紫花地丁總黃酮對單純皰疹病毒性腦炎小鼠的作用

趙麗靜,郜風(fēng)清,韓 冰

1.邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,邢臺 054000;2.邢臺市人民醫(yī)院兒三科,邢臺 054000

單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)感染可引起單純皰疹病毒性腦炎(herpes simplex virus en-cephalitis,HSE),臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、意識障礙、精神異常及癲癇等[1]。研究發(fā)現(xiàn),HSV不僅可以直接侵襲神經(jīng)系統(tǒng),還可以釋放大量干擾素α(interferonα,INF-α)、白介素6(interleukin 6,IL-6)等炎性細胞因子,是導(dǎo)致腦損傷的重要原因之一[2]。中藥紫花地丁主要含有黃酮類、香豆素、有機酸以及揮發(fā)油等活性成分,具有清熱解毒、涼血消腫、清熱利濕的作用,其提取物紫花地丁總黃酮(total flavones fromViolayedoensisMakino,TFV)具有良好的抗炎活性[3-4]。研究表明[5-6],治療HSE主要通過調(diào)控Toll受體3(toll-like receptor 3,TLR3)、β干擾素TRI結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)通路及炎癥因子分泌。本研究旨在探討TFV是否可以通過調(diào)控TLR3/TRIF通路減輕HSE小鼠的炎癥反應(yīng)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SMZ745型光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司);CFX96型PCR儀(美國Bio-Rad公司);ELx800型光吸收酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司);E-Gel Imager凝膠成像儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 試藥

紫花地丁(張仲景大藥房);阿昔洛韋(acyclovir,ACV,北京康瑞納生物科技有限公司);RIPA裂解液(北京伊塔生物科技有限公司);TLR3、TRIF引物由武漢擎科創(chuàng)新科技有限公司合成;小鼠INF-αELISA試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司);小鼠IL-6 ELISA試劑盒(上海酶研生物科技有限公司);RNA提取試劑盒(美國Mobio公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Genecopoeia公司)。

1.3 動物與病毒

5周齡新西蘭雄性健康(SPF級)小鼠80只,體質(zhì)量12～15 g,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2018-0002。HSV1病毒購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所。

2 方法

2.1 TFV的提取

參照文獻[6]方法:將紫花地丁粉碎后放置于60 ℃恒溫干燥箱中干燥24 h,用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液浸泡,加質(zhì)量濃度為40 g·L-1的氫氧化鈉提取液進行萃取,加體積分?jǐn)?shù)為18%的氯化氫溶液酸化,乙酸乙酯萃取,蒸干,乙醇溶解,制成質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的TFV溶液。計算總黃酮得率?？傸S酮得率=(提取液質(zhì)量濃度×稀釋倍數(shù)×體積)/稱取樣品的干質(zhì)量。計算得總黃酮的得率為0.9%。

2.2 測定LD50

2.3 建立HSE小鼠模型

以質(zhì)量濃度10 g·L-1戊巴比妥鈉按照30 mg·kg-1給小鼠腹腔注射使其麻醉,按照2.2項下方法,將HSV1(LD50,50×10-4·mL-1)細胞懸液20 μL注入小鼠顱內(nèi),建立HSE模型。觀察小鼠出現(xiàn)精神倦怠、食欲不振、共濟失調(diào)、肢體活動不靈等反應(yīng)則為建模成功。

2.4 實驗分組與干預(yù)

取50只小鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組、TFV組、HSV1+NS(normal saline)組、HSV1+ACV組和HSV1+TFV組,每組10只。除空白組和TFV組外,其余各組注射HSV1(LD50,50×10-4·mL-1)建立HSE小鼠模型。建模成功后,空白對照組不做處理,TFV組灌胃TFV 0.15 mL(質(zhì)量濃度50 μg·mL-1),HSV1+NS組灌胃NS 0.15 mL,HSV1+ACV組灌胃ACV 0.15 mL(質(zhì)量濃度60 μg·mL-1),HSV1+TFV組灌胃TFV 0.15 mL(質(zhì)量濃度50 μg·mL-1),以上均參考文獻用量[8]。為保證藥物被充分吸收,灌胃前12 h禁食不禁水。造模后第5天脫頸處死取左、右兩側(cè)顳葉腦組織,左側(cè)顳葉腦組織用于HE染色以觀察腦組織的病理變化,右側(cè)顳葉腦組織用于TLR3、TRIF mRNA和蛋白含量的檢測。

2.5 小鼠腦組織的病理學(xué)變化

取左側(cè)顳葉腦組織用質(zhì)量濃度40 g·L-1的多聚甲醛溶液固定24 h后,經(jīng)包埋、切片、二甲苯固定及乙醇脫水后,用蒸餾水沖洗,用蘇木素染色10 min,用質(zhì)量濃度10 g·L-1的鹽酸乙醇分化5 s,伊紅染液復(fù)染5 min,乙醇脫水,二甲苯透明,滴加中性樹脂封片,置于光學(xué)顯微鏡下進行觀察。

2.6 ELISA法檢測腦組織INF-α和IL-6的含量

取綠豆大小的右側(cè)顳葉腦組織,轉(zhuǎn)移至含蛋白酶抑制劑的PBS 1 mL中,用勻漿機充分研磨后充分勻漿,以12 000 r·min-1離心20 min,收集上清液,凍存于-20 ℃冰箱中。測定INF-α、IL-6前20 min將其從冰箱中取出,按照ELISA試劑盒說明書進行操作,測定標(biāo)本450 nm處的吸光度值(A),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中INF-α、IL-6的含量,實驗重復(fù)3次。

2.7 檢測腦組織TLR3和TRIF mRNA的含量

取右側(cè)顳葉腦組織研磨,加入Trizol裂解液提取組織的RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,按照說明書進行PCR擴增。反應(yīng)體系(20 μL):上、下游引物各0.5 μL,2×SYBR Green PCR Mastermix 10 μL,10×cDNA模板1 μL,雙蒸水8 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,40個循環(huán)。擴增所用引物的序列見表1。以GADPH為內(nèi)參基因,用2-ΔΔCt法進行定量分析。

表1 引物序列

2.8 Western blot法檢測腦組織TLR3和TRIF蛋白的表達水平

取右側(cè)顳葉腦組織研磨,加入裂解液提取腦組織蛋白,離心后收集上清液,用BCA試劑盒測定蛋白濃度,制備SDS-PAGE凝膠,蛋白變性,等量上樣進行電泳后轉(zhuǎn)膜,用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的脫脂奶粉封閉1 h。加入TLR3、TRIF和GAPDH一抗(均1∶500)4 ℃下孵育過夜,TBST洗膜;加入二抗室溫孵育2 h,TBST洗膜。以ECL法顯影,用Image J軟件進行灰度分析。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 小鼠感染HSV1的LD50

小鼠感染HSV1病毒后第1天出現(xiàn)精神倦怠、食欲下降、聳毛顫抖等癥狀,感染第2天起出現(xiàn)死亡,第4天后死亡小鼠的數(shù)量增多。不同病毒滴度下小鼠的存活率見表2。LD50值為50×10-4·mL-1。

表2 不同病毒滴度下小鼠的存活率

3.2 各組小鼠腦組織的病理變化

HSV1+NS組腦組織可見炎性細胞浸潤,淋巴細胞、巨噬細胞增多,腦組織大面積水腫、出血,神經(jīng)細胞變性嚴(yán)重;HSV1+ACV組和HSV1+TFV組小鼠腦組織水腫減輕,神經(jīng)細胞變性減輕,輕微出血,炎性細胞明顯減少?？瞻讓φ战M、TFV組無明顯炎性細胞浸潤,腦組織完整,未見出血。結(jié)果見圖1。

注:A.空白對照組;B.TFV組;C.HSV1+NS組;D.HSV1+ACV組;E.HSV1+TFV組。

3.3 各組小鼠腦組織INF-α和IL-6的含量

與空白對照組比較,HSV1+NS組、HSV1+ACV組和HSV1+TFV組INF-α、IL-6的含量顯著增加(P<0.05),TFV組無明顯變化(P>0.05);與HSV1+NS組比較,HSV1+ACV組和HSV1+TFV組INF-α、IL-6的含量顯著減少(P<0.05)。而HSV1+ACV組與HSV1+TFV組INF-α、IL-6的含量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組腦組織INF-α和IL-6含量的比較

3.4 腦組織TLR3、TRIF mRNA的表達水平

與空白對照組比較,HSV1+NS組、HSV1+ACV組和HSV1+TFV組TLR3、TRIF mRNA的表達水平顯著升高(P<0.05),TFV組無明顯變化(P>0.05);與HSV1+NS組比較,HSV1+ACV組和HSV1+TFV組TLR3、TRIF mRNA的表達水平顯著降低(P<0.05)。而HSV1+ACV組與HSV1+TFV組TLR3、TRIF mRNA的表達水平無明顯差異(P>0.05)。結(jié)果見表4。

表4 各組腦組織TLR3和TRIF mRNA表達水平的比較

3.5 小鼠腦組織TLR3和TRIF蛋白的表達水平

與空白對照組比較,HSV1+NS組、HSV1+ACV組和HSV1+TFV組TLR3、TRIF蛋白的表達水平顯著上升(P<0.05),TFV組無明顯變化(P>0.05);與HSV1+NS組比較,HSV1+ACV組和HSV1+TFV組TLR3、TRIF蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。而HSV1+ACV組與HSV1+TFV組相比,TLR3、TRIF蛋白表達水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表5、圖2。

圖2 各組腦組織TLR3和TRIF蛋白的表達水平

表5 各組腦組織TLR3和TRIF蛋白表達水平的比較

4 討論

HSE是一種由HSV引起的中樞神經(jīng)感染性疾病,HSV是一種嗜神經(jīng)病毒,分為HSV1和HSV2 2個亞型,大部分的HSE由HSV1引起,該病毒可進入軸突神經(jīng)末梢,直接損傷神經(jīng)元和神經(jīng)細胞,在周圍神經(jīng)系統(tǒng)或交感神經(jīng)細胞核中引發(fā)持續(xù)感染[9-10]。本研究中,梯度稀釋HSV1病毒,用寇式計算法計算出其LD50為50×10-4·mL-1。將20 μL HSV1細胞懸液注射入小鼠顱內(nèi),成功建立HSE小鼠模型。

張靜等[11]研究表明,TFV可以顯著下調(diào)小鼠巨噬細胞IL-1β、IL-6和INF-α等細胞因子的釋放并抑制其mRNA的表達,具有良好的抗炎活性。李海濤等[12]體外實驗研究結(jié)果表明,TFV可下調(diào)IL-2等細胞因子的分泌,參與調(diào)控體液免疫和細胞免疫應(yīng)答,改善機體的免疫功能。本研究的結(jié)果顯示,感染1 d后,小鼠出現(xiàn)食欲不振、精神倦怠、皮毛聳立等癥狀;腦組織病理形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)大量炎性細胞浸潤,大面積水腫,出血,神經(jīng)變性嚴(yán)重;治療后,小鼠腦組織水腫和神經(jīng)細胞變性減輕,INF-α、IL-6的含量顯著降低,與前者的研究結(jié)果一致,表明TFV可抑制炎性因子的分泌,減輕HSE對腦組織造成的炎性損傷。

TLR是HSE發(fā)病過程中誘導(dǎo)宿主抗病毒免疫反應(yīng)和組織損傷的主要分子,通過病毒識別、傳導(dǎo)及抗病毒效應(yīng),在病毒感染過程中發(fā)揮重要作用[13-14]。其中TLR3受體可識別雙鏈RNA,是病毒侵襲的關(guān)鍵免疫分子[15],TLR3只接受TRIF信號通路的信號并向下游傳遞[16],收到刺激信號后TRIF依賴途徑被激活,誘導(dǎo)IFN-α和IL-6等炎性細胞因子的產(chǎn)生[17],并發(fā)生免疫應(yīng)答。如果活化該通路,將會導(dǎo)致炎性細胞因子大量釋放,對機體各組織造成損傷[18]。因此,以TLR為靶點,激活或者抑制TLR通路,可能是治療病毒性感染的新策略。王曉容等[19]研究發(fā)現(xiàn),綠原酸可以抑制小鼠小膠質(zhì)細胞內(nèi)的TLR3/TRIF通路,進而減輕由HSV1型引起的小膠質(zhì)細胞的炎性反應(yīng)。此外,HUANG Y等[20]報道,在治療皰疹病毒性腦炎小鼠時,TLR3/TRIF通路的抑制在其中發(fā)揮重要作用。之前的研究均提示,TLR3/TRIF通路可能與皰疹性病毒感染密切相關(guān),本研究以TFV為治療藥物,發(fā)現(xiàn)感染HSV1后小鼠腦組織中TLR3、TRIF mRNA和蛋白的表達水平顯著升高,表明HSV1可以激活TLR3-TRIF信號通路;治療后,HSV1+ACV組和HSV1+TFV組TLR3、TRIF mRNA和蛋白的表達水平顯著降低,表明TFV的抗炎作用可能與抑制TLR3/TRIF信號通路有關(guān)。

總之,TFV可能通過調(diào)控TLR3/TRIF通路,減輕炎性細胞因子對HSE小鼠腦組織的損傷,抑制由HSV1引起的炎癥反應(yīng)。本研究為臨床治療HSE提供了實驗依據(jù),具體作用機制尚需進一步實驗研究。