滑石不同炮制品的物質(zhì)基礎(chǔ)與抗菌活性研究

任 蕾,趙 婧,呂曉武,王穎莉,焦建華

山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院,晉中 030619

滑石(Talcum)又名滑石粉(Talc powder),為臨床常用的礦物藥,收載于歷版《中國(guó)藥典》,具有利尿通淋、清熱解毒、祛濕斂瘡等功效[1]。同時(shí)滑石也作為2020年版《中國(guó)藥典》的新增藥用輔料,廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代制劑[2]?；鳛橹委熕幬镞M(jìn)行使用時(shí),經(jīng)常需要炮制。對(duì)滑石的炮制方法,漢代《玉函》中記載了“捶碎”法,《傷寒論》中記載了“研”法。劉宋時(shí)期的《雷公炮炙論》提出了將其研如粉、丹皮同煮的方法。至宋代則首次提出水飛,曰“水研如泔,揚(yáng)去粗者存細(xì)者,瀝干更研無聲乃止”,并對(duì)其粗細(xì)度提出明確要求,并為元、明、清各代沿用。此外,宋代還有炒法(《博濟(jì)》)、火煅通赤(《總微》)等,明代有燒、“火煨煅、去火毒”(《普濟(jì)方》)等方法[3-6]。而現(xiàn)代炮制工藝對(duì)滑石粉的炮制方法則以水飛法為主,藥房中常見滑石主要為生滑石、炒滑石和水飛滑石[7-8]。本文以生滑石為原料,研究經(jīng)過不同炮制方法處理后其元素含量、紅外圖譜中特征官能團(tuán)及抑菌能力變化,為滑石藥用價(jià)值的開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TAS986原子吸收分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);石墨消解儀(山東海能科學(xué)儀器有限公司);傅里葉變換紅外光譜儀(天津天光光學(xué)儀器有限公司);超級(jí)潔凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);立式蒸汽滅菌鍋(寧波久興醫(yī)療器械有限公司);可調(diào)微量移液器(上海求精生化試劑儀器有限公司) 。

1.2 試藥

滑石粉(山西同仁堂藥業(yè));Mg、Fe、Se、Zn、K、Ca、Al對(duì)照品儲(chǔ)備液(國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心);元素分析所需其余所用試劑均為色譜純;胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(青島日水生物技術(shù)有限公司);蛋白胨和牛肉膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)等。

2 方法與結(jié)果

2.1 滑石樣品的預(yù)處理

嚴(yán)格按照藥典處理樣品[1],樣品過篩,得粉末狀生滑石。取生滑石適量,置于研缽中,加水研磨,靜置,倒出上清液,重復(fù)3～5次,將沉淀倒入燒杯,放入烘箱中80 ℃烘5 h,冷卻至常溫,過篩,用潔凈的燒杯封口保存,得水飛滑石。取水飛滑石粉末狀樣品置于鍋內(nèi)先炒至微熱,往鍋內(nèi)加水蛭樣品,待炒至水蛭微微鼓起時(shí),篩選出滑石粉末過篩,封存?zhèn)溆?得炒滑石。

2.2 不同方法炮制后的滑石中主要元素的含量測(cè)定

2.2.1樣品溶液的消解 取3種不同處理方式的滑石樣品細(xì)粉(過200目篩)1.00 g,置于250 mL三角瓶中,加入10 mL·L-1硝酸溶解,靜置,加入濃硝酸-濃鹽酸(3∶1)混合,靜置24 h以上,定容,置于重金屬消解儀的專用試管中進(jìn)行消解,溫度為100 ℃～120 ℃,注意加熱過程中溫度逐漸升溫,由于溫度升高至100 ℃時(shí)水和硝酸會(huì)緩慢蒸發(fā),消解過程中需不斷加入去離子水,直至沉淀完全消失,溶液澄清后定容至100 mL[9-13]。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 取各金屬元素對(duì)照品溶液(1 000 μg·mL-1)用10 mL·L-1HNO3溶液將其配制為質(zhì)量濃度分別為5.0～60.0 μg·mL-1的金屬離子標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.2.3儀器工作參數(shù)的設(shè)定 確定并記錄火焰原子吸收光譜儀的工作條件。見表1。

表1 原子吸收分光光度計(jì)儀器工作參數(shù)(空氣壓力為0.2 MPa)

2.2.4線性范圍實(shí)驗(yàn) 用火焰原子吸收光譜法分別測(cè)定Fe、Cu、Zn、Se、Mg 、Al的對(duì)照品工作溶液,進(jìn)行線性考察,繪制線性回歸方程,測(cè)定各元素的相關(guān)系數(shù),所測(cè)得幾種元素的相關(guān)系數(shù)值均接近0.999,說明線性關(guān)系良好。

2.2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取質(zhì)量濃度分別為40、0.1、10、20、1.6、1.2、0.8 μg·mL-1的 Fe、Cu、Zn、Se、Mg、Al的對(duì)照品溶液,在2.2.3項(xiàng)下儀器工作條件下,分別對(duì)各個(gè)元素連續(xù)測(cè)定3次,求其平均值,再分別計(jì)算各個(gè)元素的RSD(%),結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.6加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 在已知含量的樣品中加入一定量的Fe、Cu、Zn、Se、Mg、Al的對(duì)照品溶液,測(cè)定其回收率,在2.2.3項(xiàng)下儀器工作條件下,依次對(duì)各元素的加標(biāo)樣品進(jìn)行測(cè)定,測(cè)出各個(gè)元素添加對(duì)照品之后的含量,計(jì)算得加標(biāo)回收率。

2.2.7方法檢出限的考察 按照2.2.2項(xiàng)下操作方法制備Fe、Cu、Zn、Se、Mg、K、Al元素的試劑空白溶液。并在2.2.3項(xiàng)下條件下連續(xù)測(cè)定Fe、Cu、Zn、Se、Mg、K、Al元素的空白溶液 10 次以上,計(jì)算試劑空白溶液響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)差S、回歸方程的斜率b,根據(jù)檢出限計(jì)算公式L=3S/b,得出此方法Fe、Cu、Zn、Se、Mg、K、Al的檢出限。

2.2.8含量測(cè)定 平行稱取生品滑石粉、水滑石粉、炒滑石粉細(xì)粉3份,每份各1.0 g,按照2.2.1項(xiàng)下方法制備3份樣品溶液,并在2.2.3項(xiàng)下條件下測(cè)定各個(gè)微量元素含量,并取其平均值。含量測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 不同方法處理后的滑石粉微量元素含量

2.3 不同方法炮制后滑石粉樣品的紅外光譜分析

2.3.1樣品的預(yù)處理 將不同方法處置的滑石粉樣品過篩,置于密封袋中保存,編號(hào)備用。溴化鉀干燥備用。

2.3.2樣品的紅外光譜分析 按照紅外光譜實(shí)驗(yàn)方法將溴化鉀與樣品混合均勻,放入模具中,壓制為通透均勻的薄片,于4 000～400 cm-1進(jìn)行掃描測(cè)定,每個(gè)樣品累計(jì)掃描32次[14-16]。結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同炮制樣品的紅外光譜圖

2.3.3紅外圖譜結(jié)果 圖譜結(jié)果表明,3個(gè)滑石粉樣品的官能團(tuán)在3 678、3 435、1 669 cm-1波數(shù)處均有峰值,在指紋區(qū)1 018、536 cm-1波數(shù)處均有峰,滑石粉經(jīng)不同方法處理紅外圖譜變化不明顯[14]。

2.4 不同方法處理后滑石粉樣品的抑菌實(shí)驗(yàn)

2.4.1培養(yǎng)基的制備 按照藥典標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行SA培養(yǎng)基、E.coli培養(yǎng)基、PA培養(yǎng)基及其斜面培養(yǎng)基的制備[17-22]。

2.4.2菌株的傳代培養(yǎng)及稀釋 培養(yǎng)出3代菌株,加入適量的滅菌生理鹽水,震蕩試管洗下菌苔。將洗液移至無菌EP管中,分別標(biāo)記后搖勻。取10支裝有4.5 mL的無菌生理鹽水EP管,按菌液稀釋10～1010倍依次標(biāo)號(hào)。

2.4.3菌株最佳生長(zhǎng)密度的確定 選取菌落生長(zhǎng)大小適宜、分布均勻、較適宜的生長(zhǎng)密度。分別確定好3種菌相應(yīng)密度和最佳觀測(cè)時(shí)間,進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4.4藥敏片的制備 將消毒干燥后的濾紙片分別放入裝有實(shí)驗(yàn)室配制好的3種滑石粉樣品及阿莫西林膠囊懸濁液的西林瓶中,實(shí)驗(yàn)過程中現(xiàn)制現(xiàn)用。

2.4.5抑菌環(huán)直徑的測(cè)量 根據(jù)2.4.4項(xiàng)下確定好的3種菌株的最佳生長(zhǎng)密度分別進(jìn)行涂布后,把培養(yǎng)皿分成4個(gè)區(qū)域并編號(hào),室溫下放置2～3 min后依次把制備好的藥敏片置于相應(yīng)的區(qū)域內(nèi)倒置,37 ℃培養(yǎng),18～24 h內(nèi)每隔2 h觀察其有無抑菌環(huán)并測(cè)量。實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行3組,求3組實(shí)驗(yàn)的平均值。抑菌效果的判斷是以抑菌環(huán)直徑(d)大小為標(biāo)準(zhǔn)的:當(dāng)d<6 mm時(shí),無抑菌作用;當(dāng)6≤d≤10 mm時(shí),有抑菌作用,可判斷為低度敏感;當(dāng)1015 mm時(shí),有抑菌作用,即為高度敏感;3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)均達(dá)到有抑菌作用結(jié)果者判為合格;陰性對(duì)照組應(yīng)無抑菌圈產(chǎn)生,否則實(shí)驗(yàn)無效。

2.4.6抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定滑石不同方法處理后的樣品對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌作用,見圖2和表3?？梢钥闯?3種滑石樣品均顯示出不同程度的抑菌作用。作為陽性對(duì)照品藥物的阿莫西林膠囊對(duì)3種菌的抑菌作用均非常明顯,抑菌環(huán)均達(dá)到40 mm以上。從滑石的3種樣品的抑菌圖可以看出,滑石生品對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌有抑菌效果,但不明顯;滑石生品對(duì)金黃色葡萄球菌無抑制作用;炒滑石在三者之中的抑菌效果最強(qiáng),達(dá)到了15 mm以上;水飛滑石對(duì)3種菌也有一定的抑菌效果。

圖2 滑石不同方法處理后的抑菌能力

表3 不同藥物對(duì)3種常見菌的抑菌圈直徑

3 討論

在中藥的研究過程中,發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)與微量元素的協(xié)同作用日益受到重視?；鳛橐环N重要的傳統(tǒng)礦物中藥,有著上千年的藥用歷史,但是目前對(duì)滑石的不同炮制品的用法研究顯得頗為混亂。本文對(duì)滑石不同方法炮制后的樣品進(jìn)行了元素含量的變化分析,通過比較3種樣品,水飛滑石中Mg、Cu元素的含量最高,炒滑石中Zn、Se、Fe、Al含量最高,顯然對(duì)滑石的炮制可以改變滑石中元素的含量比例。而紅外光譜顯示在炮制前后滑石的主要特征峰并未發(fā)生變化,說明炮制過程對(duì)滑石的有機(jī)活性影響不大。體外抑菌實(shí)驗(yàn)顯示,炒滑石對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均有較強(qiáng)的抑菌作用,水飛滑石也顯示了一定的抑菌能力,而生品滑石抑菌效果最弱。由本文結(jié)果提示,可以考慮在滑石作為治療藥物和藥用輔料的過程中,根據(jù)其不同炮制品的物質(zhì)基礎(chǔ)變化進(jìn)行選擇性使用。