干擾ACACA基因對豬原代肌衛(wèi)星細胞增殖和成脂轉分化過程的影響

雷宇航，譚 婭，黃志洋，趙夢穎，齊 婧，甘麥鄰，沈林園*，朱 礪*

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽生物組學重點實驗室，成都 611130；3. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550005）

中國不僅是世界上生豬飼養(yǎng)規(guī)模最大的國家，而且還是世界最大的豬肉消費國，豬肉品質在很大程度上決定了生豬行業(yè)經(jīng)濟效益及產(chǎn)業(yè)發(fā)展，因此提高豬肉質量成為該行業(yè)重中之重亟需解決的問題[1]。一般意義上，豬肉品質包含pH值、嫩度、系水力以及肌內脂肪含量等指標[2]。在影響豬肉品質的諸多因素中，肌內脂肪（intramuscular fat，IMF）含量是一項關鍵指標，它與豬肉的嫩度、風味、多汁性都具有明顯關聯(lián)[3]。肌內脂肪組織又俗稱“大理石紋”，屬于肌肉脂肪中的一種，由散布在肌纖維束之間的脂肪細胞組成，是衡量肉類營養(yǎng)和風味的重要指標[4]。目前普遍認為豬肉最佳肌內脂肪含量在2%～3%之間，當肌內脂肪含量高于3%時，豬肉口感變得太過油膩會降低消費者購買意愿；而肌內脂肪含量太低則會導致豬肉品質下降，因此合理控制肌內脂肪含量成為了本行業(yè)的研究重點[5-6]。

有研究顯示豬肌內脂肪包括肌纖維內的脂滴沉積在肌纖維之間和肌纖維束之間的脂肪，其發(fā)育和代謝過程與身體其他部位的脂肪有明顯的差別[7]。肌肉中能分化為脂肪細胞的干細胞有兩種，即脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）和肌肉衛(wèi)星細胞（MSCs）。這兩種細胞之間存在密切聯(lián)系，其中ADSCs 能夠分泌一些調控因子，調控MSCs 增殖以及向脂肪細胞轉分化[8-10]。另外，在胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤和羅格列酮等成脂誘導因子的作用下，體外培養(yǎng)的間充質來源不同的細胞（包括衛(wèi)星細胞）同樣能夠向脂肪細胞分化[11-13]。這些研究表明肌內脂肪既可由肌肉內前體脂肪細胞發(fā)育而來，也可通過MSCs 轉分化為脂肪細胞這一調控機制進行，并且肌內脂肪含量與MSCs的增殖和成脂轉分化過程息息相關[14-16]。

ACACA屬于羧化轉移家族的成員，是脂肪酸代謝過程中的關鍵因子，其序列753-818處有生物素/硫辛酸附著位點[17]。該酶在哺乳動物中以兩種方式存在，分別為ACACA基因編碼的ACC-1 以及ACACB基因編碼的ACC-2，兩者具有高度的相似性，互為同工酶。其中ACC2 主要存在于脂肪分化活躍的組織，其作用是催化脂肪酸的氧化；而ACC-1主要存在于哺乳動物肝臟和脂肪組織內，能參與脂肪酸合成代謝，催化乙酰輔酶A羧化成不飽和脂肪酸合成起始產(chǎn)物，即丙二酰輔酶A[18]。丙二酰輔酶A 是線粒體內β 氧化的重要調控因子，充當不飽和脂肪酸合成的限速酶，可直接影響人類的脂類代謝[19-22]。在前期本研究團隊已經(jīng)證實ACACA在高肌內脂肪含量的豬群體中呈現(xiàn)高表達趨勢[23]。另外據(jù)相關研究表明，ACACA基因在高肌內脂肪含量的萊蕪豬肌肉中的表達量明顯高于肌內脂肪含量低的DLY 豬，ACACA與肌內脂肪含量呈現(xiàn)正相關[24]。D. Gallardo 等[25]研究也發(fā)現(xiàn)，在杜洛克豬中ACACA基因的兩個連鎖同義突變對肌肉中脂肪酸組成（包括多不飽和/飽和脂肪酸比值）有顯著影響，這些研究均提示ACACA與豬肌內脂肪有相關性。

因此，本研究以豬MSCs為模型，通過體外培養(yǎng)誘導其轉分化，模擬肌內脂肪的生成，探究干擾ACACA基因后對豬MSCs 增殖凋亡及轉分化的影響，進而揭示其成脂轉分化的分子機制，為研究豬肌內脂肪生成分子調控機制和改善豬肉品質提供有關理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清（FBS）、DMEM/F12 培養(yǎng)基購于Gibco公司；油紅O 染液、胰島素（insulin）、地塞米松（DEX）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）和羅格列酮（Rosiglitazone）購于Sigma公司；甘油三酯（TG）檢測試劑購于南京建成生物工程研究所；Trizol（總RNA 抽提試劑）購于Invitrogen 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）細胞增殖/毒性檢測試劑盒購于日本DOJINDO 公司；PI/Rnase Cell cycle staining Buffer 細胞周期試劑盒購于美國BD 公司；Lipofectamine?3000 轉染試劑購于ThermoFisher 公司；Prime Script Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒和SYBR Permix Ex Taq Kit 購于TaKaRa 公司；qRT-PCR 引物合成于擎科生物公司（成都）；使用CFX96熒光定量儀（Bio-Rad，美國）、Cytoflex 流式細胞儀（Backman，美國）、酶標儀（Thermo，美國）、Olympus IX53 熒光顯微鏡（Olympus，日本）。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬原代肌衛(wèi)星細胞體外分離

無菌采取3 日齡的DLY 仔豬背最長肌組織，用含3%雙抗的PBS緩沖溶液清洗3～5次，剔除血管和結締組織，用手術剪剪成肉糜狀。經(jīng)Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶消化后，將消化液用100 μm 的細胞篩過濾，1 000 g/min轉速離心10 min后倒掉上清，收集底部細胞，加入20%培養(yǎng)基重懸，鋪瓶，將培養(yǎng)瓶置于含5% CO2，37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于原瓶中細胞種類較多，含有大量成纖維細胞、骨骼肌衛(wèi)星細胞、組織等，其中成纖維細胞具有較強的貼壁能力最強[26]，因此在3 h后將原瓶中上清液轉移至新的培養(yǎng)瓶中，未貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，重復一次，最終采用差速貼壁法對豬MSCs進行分離純化。

1.2.2 豬原代肌衛(wèi)星細胞傳代與誘導成脂轉分化

待培養(yǎng)瓶中細胞密度達到80%左右，經(jīng)胰蛋白酶消化后，按照1∶3 的比例進行傳代培養(yǎng)。當培養(yǎng)板內細胞密度達到90%時，將完全培養(yǎng)基更換為成脂誘導A 液（DMEM+20% FBS+1%雙抗+1 μmol/L DEX+20 μg/mL Insulin+0.5 mmol/L IBMX+10 μmol/L Rosiglitazone），培養(yǎng)2 d 之后，更換為成脂誘導B 液（DMEM+20% FBS+1%雙抗+20 μg/mL Insulin），每2 d換液一次，并在顯微鏡下拍照記錄。

1.2.3 小干擾RNA（siRNA-ACACA）的合成

針對豬的ACACA基因的保守序列，由吉瑪基因（Gene Pharma）公司（上海）設計并合成3 條小干擾RNA，序列見表1。

表1 ACACA的siRNA序列Table 1 The siRNA sequence of ACACA

1.2.4 細胞轉染

為了探究siRNA-ACACA對豬原代肌衛(wèi)星細胞增殖凋亡以及轉分化的影響，將細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板，分別在增殖期和轉分化期將3 種小干擾RNA（si-ACACA1、si-ACACA2、si-ACACA3）和一組對照組（NC）轉染進細胞，每組處理設置3個重復。轉染液按照Lipofectamine? 3000說明書進行配制。

1.2.5 CCK-8細胞增殖檢測

將細胞接種至96 孔板，每組處理6 個孔，每個孔100 μL 細胞懸液。將培養(yǎng)板置于含5% CO2，37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h，當細胞密度達到30%時轉染細胞并換增殖培養(yǎng)液。轉染細胞后，設定5 個時間點（0、12、24、48、72 h）向待檢測細胞孔中加入10 μL CCK-8檢測試劑，孵育1.5 h后利用酶標儀檢測在450 nm 波長處的OD 值，確定細胞增殖活力。

1.2.6 流式細胞檢測

細胞轉染24 h 后，用胰蛋白酶消化細胞，并以1 000 r/min離心5 min（收集約6×105個細胞）。加入4 ℃ 70%乙醇2 mL，于冰上處理30 min。加入2 mL 4 ℃的PBS 液，旋渦混勻300 g 離心5 min，重復此步驟。加入500 μL 的PI/Rnase staining Buffer，4 ℃孵育30 min，加入2 mL 的PBS 液洗滌一次，加入400μL的PBS液重懸細胞。使用流式細胞儀上機檢測，采用Modfit軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 甘油三酯檢測

收集轉分化第8 天的細胞培養(yǎng)液上清，參考甘油三酯試劑盒說明書，利用酶標儀操作比色法測定上清液中甘油三酯的相對含量。

1.2.8 油紅O染色

MSCs 在轉分化第8 天時用4%多聚甲醛固定1 h，PBS漂洗3 min，60%異丙醇沖洗15 s，促進中性脂肪的染色。隨后在避光處用油紅O 染液浸染15 min，每個處理組隨機選取5 個點在倒置熒光顯微鏡下拍照，并用Image J軟件量化脂滴面積。

1.2.9 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

用Trizol 試劑裂解細胞，加入氯仿使溶液分為水相和有機相，吸取上層水相用異丙醇沉淀回收RNA。隨后使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，RTPCR 檢測增殖、分化相關基因表達水平。PCR 反應體系為SYBR Premix Ex Taq? 5 μL，DEPC 水3 μL，上下游引物各自0.5 μL，cDNA 1 μL。反應條件：95℃預變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共計40個循環(huán)。以β-actin作為內參基因，使用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達含量[27]。qRT-PCR反應的引物序列見表2。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 The primer sequence for qRT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行統(tǒng)計學分析，使用獨立樣本t檢驗進行差異顯著性檢驗。數(shù)據(jù)均以平均值（mean）±標準差（standard deviation，SD）表示。

2 結果與分析

2.1 豬MSCs分離培養(yǎng)結果

剛分離下來的豬原代肌衛(wèi)星細胞在明場下觀察呈現(xiàn)亮白小圓點，懸浮于培養(yǎng)液之中（圖1A）。培養(yǎng)6 h之后，轉移上清液至新培養(yǎng)瓶，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，此時上清液中少量原代肌衛(wèi)星細胞開始在培養(yǎng)瓶上貼壁，呈現(xiàn)細胞樣，向四周伸展；未貼壁細胞依舊呈現(xiàn)圓形白點狀（圖1B）。培養(yǎng)24 h 之后，絕大多數(shù)細胞貼壁（圖1C），此時更換培養(yǎng)液，去除仍未貼壁細胞。經(jīng)過48 h 后，細胞大量增殖，細胞形態(tài)逐漸呈現(xiàn)出纖維狀或梭形（圖1D）。

圖1 不同培養(yǎng)時間豬原代肌衛(wèi)星細胞形態(tài)Figure 1 The morphology of porcine primary muscle satellite cells at different culture time

2.2 siRNA-ACACA的干擾效率

qRT-PCR 檢測結果如圖所示（圖2），與NC 未轉染組相比，轉染si-ACACA之后ACACA的mRNA表 達 量 均 下 降，且si-ACACA1、si-ACACA2、si-ACACA3 的干擾效率分別為56.04%、88.43%、72.06%。其中si-ACACA2 干擾效率最好，較NC 組有極顯著差異（P＜0.000 1），從而篩選出si-ACACA2對豬MSCs進行轉染，用于后續(xù)實驗。

圖2 siRNA-ACACA的篩選Figure 2 The screening result of siRNA-ACACA

2.3 干擾ACACA基因對豬MSCs增殖的影響

轉染24 h之后，通過CCK-8試劑盒測定細胞活力，結果顯示：當細胞培養(yǎng)到12 h 和24 h 時，NC 組與si-ACACA2 組在450 nm 處OD 值基本相同，細胞數(shù)目沒有明顯差異；當細胞培養(yǎng)到48 h 時，si-ACACA2 組OD 值顯著低于NC 組（P＜0.05）；當細胞培養(yǎng)到72 h 時，si-ACACA2 組OD 值極顯著低于NC組（P＜0.01）（圖3A）。

轉染細胞24 h 后，經(jīng)過流式檢測分析發(fā)現(xiàn)，si-ACACA2組相比于NC組，G0/G1期細胞比率由53.15%（55.3±2.66）上升到60.67%（60.32±0.36）（P＜0.05），G2/M 期變化差異不大，S 期細胞數(shù)量由35.47%（33.05±3.35）下降到27.47%（28.44±0.97）（P＜0.05）（圖3B和C）。

圖3 干擾siRNA-ACACA后對豬原代肌衛(wèi)星細胞增殖的影響Figure 3 Effect of interfering siRNA-ACACA on proliferation of porcine primary muscle satellite cells

實時熒光定量PCR 檢測細胞增殖相關基因（Cyclin D1、Cyclin E）的表達量，結果顯示：干擾ACACA能 夠 降 低Cyclin D1（P＜0.05）（圖3D）和Cyclin E（P＜0.000 1）的表達量（圖3E）。

以上結果表明：抑制ACACA基因之后，豬MSCs活性和新生細胞比率均極顯著低于對照組，細胞周期相關基因Cyclin D1和Cyclin E表達量顯著降低，G0/G1 期細胞比例顯著增多（P＜0.05），而S 期細胞比例顯著降低（P＜0.05）。說明干擾ACACA可抑制豬MSCs 從G1 期向S 期轉變，從而導致G0/G1 期阻滯，細胞增殖受到抑制。

2.4 干擾ACACA基因對豬MSCs凋亡的影響

轉染24 h后，利用qRT-PCR檢測凋亡標志基因在細胞樣本中的表達量。結果顯示，si-ACACA2 組與NC組相比，BAX表達量顯著升高（P＜0.05），BCL-2表達量顯著下降（P＜0.05）（圖4A和B）。由此可以推測，干擾ACACA基因可以顯著促進豬MSCs凋亡。

圖4 干擾siRNA-ACACA 24 h后對豬原代肌衛(wèi)星細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of interfering siRNA-ACACA after 24 h on apoptosis of porcine primary muscle satellite cells

2.5 誘導豬MSCs轉分化結果

增殖期細胞融合度達100%時，更換成脂誘導液，繼續(xù)培養(yǎng)至8 d左右，細胞形態(tài)逐漸由纖維狀變?yōu)闄E圓形，并且伴隨有明顯脂滴出現(xiàn)，豬原代肌衛(wèi)星細胞成功轉分化為脂肪細胞（圖5A）。通過實時熒光定量PCR 分別對轉分化不同時期的細胞進行成脂和成肌相關標志基因表達量的檢測，進一步驗證脂肪細胞的形成，結果如下圖所示：成脂相關基因C/EBPα的表達量在轉分化時期顯著高于第0天，并且在第2 天左右表達量達到最高，隨后開始逐漸降低（圖5B）；成肌相關的基因MyoD和MyoG的表達量與轉分化第0 天相比均呈現(xiàn)極顯著下降的趨勢（P＜0.001），其中MyoD的表達量從第2 天開始逐漸升高，而MyoG的表達量逐漸遞減，到第8 天時表達量最低（圖5C 和D）。成肌基因與成脂基因的表達量變化在豬MSCs 轉分化時期呈現(xiàn)相反趨勢，成功誘導豬MSCs向脂肪細胞轉分化。

圖5 誘導MSCs轉分化結果Figure 5 The result of induced transdifferentiation of MSCs

2.6 干擾ACACA 基因對豬MSCs 成脂轉分化的影響

轉染之后，對轉分化第8 天細胞進行油紅O 染色發(fā)現(xiàn)，si-ACACA2 組中紅色脂滴產(chǎn)生量明顯少于NC 組，并且脂滴大小也明顯小于NC 組（圖6A 和B）。檢測甘油三酯含量同樣發(fā)現(xiàn)，si-ACACA2 組中甘油三酯的含量顯著低于NC 組（圖6C）。因此，干擾ACACA基因可以阻礙豬MSCs轉分化時期脂肪沉積作用。

圖6 干擾ACACA后對豬原代肌衛(wèi)星細胞轉分化時脂滴形成的影響Figure 6 The effect of ACACA interference on lipid droplet formation during transdifferentiation of porcine primary muscle satellite cells

3 討論

ACACA基因定位在豬的12號染色體，其編碼的乙酰輔酶A 羧化酶α 屬于羧化轉移家族成員，是脂肪酸從頭合成途徑中的關鍵酶，可促進乙酰輔酶A轉變?yōu)楸釂熙］o酶A，能提供脂肪酸合成所需的二碳單位[28]。有研究表明ACACA轉錄水平含量決定細胞和/或個體脂肪酸合成，維持正常生存。如楊青[29]發(fā)現(xiàn)在谷氨酸棒桿菌中過表達ACACA可顯著促進脂肪酸合成，提升效率接近2倍之多。相反，當ACACA基因受到抑制后，脂肪酸的合成明顯受到阻礙，并且對多種細胞的增殖及個體生長發(fā)育會產(chǎn)生負調控作用。Liao T.等[30]通過抑制KMT5A的表達間接抑制了ACACA的表達，從而可使人甲狀腺乳頭狀癌細胞系（PTC）的增殖減弱，并促進其凋亡。E. C. Jessica 等[31]通過雙轉染siRNA 直接抑制ACC1和ACC2 mRNA 水平的表達量，同樣發(fā)現(xiàn)人膠質母細胞瘤的增殖受到抑制，并且其新生脂肪產(chǎn)生量也顯著降低。Zhang H.等[32]發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中ACACA的表達量非常高，與前列腺癌細胞增殖速度快有一定相關性，但是沉默ACACA的表達可以抑制前列腺癌細胞增殖并誘導其凋亡，研究還揭示ACACA對前列腺癌細胞增殖調控的作用機制，發(fā)現(xiàn)其是通過影響NAD+/NADH、線粒體ATP 產(chǎn)量、mtDNA 和ROS 水平的平衡，干擾線粒體的正常功能，從而降低細胞的增殖能力。程婧等[33]在對腎透明細胞癌研究同樣發(fā)現(xiàn)下調腎透明細胞癌786-O和Caki-1細胞中ACACA的表達，能抑制細胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4表達進而影響細胞增殖。在活體實驗上，L. Abu-Elheiga等[34]發(fā)現(xiàn)雙敲除ACACA基因，對小鼠胚胎具有顯著致死效應。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)通過在體外培養(yǎng)的豬MSCs中干擾ACACA基因可導致細胞增殖受阻，細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，并且伴隨細胞周期標志基因（Cyclin D1、Cyclin E）的表達量顯著下降。細胞凋亡相關基因BAX顯著升高，BCL-2顯著下降，從而加速豬MSCs 凋亡。這些結果提示MSCs 干擾ACACA后增殖受阻與G0/G1期阻滯以及細胞凋亡增強密切相關。

豬肌內脂肪的形成不僅與遺傳因素有關，而且更多受到營養(yǎng)條件的影響。動物骨骼肌衛(wèi)星細胞作為肌內脂肪形成的細胞之一，可以通過體外添加胰島素、羅格列酮、地塞米松等進行誘導培養(yǎng)，促進向脂肪細胞轉化[16,26,35]。其中胰島素作為機體內唯一降低血糖的激素，可以促進脂肪的合成[36]；羅格列酮則是PPARγ的激動劑，通過激活脂肪細胞標志物脂蛋白脂酶（LPL）的表達以及下調絲裂原激活蛋白激酶激酶3（MAP2K3）的表達來誘導脂肪細胞的形成[37]；DEX 可以促進C/EBPα的表達，而C/EBPα是脂肪形成過程中的關鍵因子[38]。因此無論成肌細胞是否有內在成脂能力，均可通過PPARγ和C/EBPα這兩種成脂轉分化因子的異位表達來誘導轉分化為成熟脂肪細胞。閆研[12]研究表明通過上調延邊牛骨骼肌衛(wèi)星細胞中PPARγ的表達，可以促進肌肉衛(wèi)星細胞成脂轉分化?；矢σ环瞇39]研究證明，在牛成肌細胞內過表達C/EBPα同樣也可以誘導成肌細胞向脂肪細胞轉分化。另外，C. Fux 等[40]研究證實，C2C12 成肌細胞向脂肪細胞轉分化過程中，脂肪細胞的形成僅在C/EBPα表達最高時發(fā)生，這也說明C/EBPα的高表達對于成脂轉分化至關重要。因此，本研究通過體外添加胰島素、羅格列酮、地塞米松等，進而上調MSCs 內C/EBPα的表達，檢測了成脂相關基因C/EBPα和成肌相關的基因MyoD、MyoG在轉分化過程中表達量的變化，成功誘導MSCs 向脂肪細胞轉分化。其中C/EBPα基因作為脂肪細胞形成的標志物，其表達量在轉分化時期極顯著高于轉分化開始。而生肌調節(jié)因子家族（myogenic regulatory factors， MRFs）中的生肌決定因子（MyoD）和肌生成素（MyoG）在肌肉的形成和分化起著重要作用，前者對于成肌細胞分化起決定性作用，而MyoG則是分化后期形成肌管和肌纖維所必需的。在轉分化過程中，猜測是由于肌衛(wèi)星細胞向脂肪細胞轉分化，從而抑制肌管的形成，導致MyoD和MyoG的表達量則始終低于轉分化開始時，具體的機制還有待進一步驗證。在表觀層面，通過油紅O染色顯示干擾ACACA基因后會明顯阻礙轉分化時期脂滴的累積過程，抑制了脂肪沉積過程。

4 結論

本研究以豬MSCs 體外培養(yǎng)為模型，探究出干擾ACACA后抑制豬MSCs的增殖，促進其凋亡，并且減少成脂轉分化時脂肪的沉積。研究結果為進一步研究ACACA在豬肌內脂肪生成分子調控機制和改善豬肉品質提供實驗參考和基礎數(shù)據(jù)。