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    玉米bZIP基因應(yīng)答逆境脅迫的表達(dá)模式分析

    2023-05-06 11:14:42賈利強(qiáng)張運(yùn)林趙秋芳
    關(guān)鍵詞:銨態(tài)氮硝態(tài)逆境

    賈利強(qiáng),劉 洋,丁 波,張運(yùn)林,趙秋芳,陳 曙

    (1. 貴州師范學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院,貴陽(yáng) 550018;2. 嘉興職技術(shù)學(xué)院,浙江 嘉興 314036;3. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院,廣東 湛江 524091)

    玉米生長(zhǎng)進(jìn)程中經(jīng)常遭受各種逆境脅迫,包括高鹽脅迫、水分缺乏或極端溫度脅迫等,影響作物正常生長(zhǎng),導(dǎo)致減產(chǎn)或絕產(chǎn),國(guó)家糧食安全受到影響。植物應(yīng)答逆境脅迫的信號(hào)途徑是復(fù)雜的,涉及到多層次生理生化響應(yīng)途徑和相應(yīng)調(diào)控基因的參與[1]。轉(zhuǎn)錄因子(TFs)就是植物適應(yīng)抵御逆境脅迫的關(guān)鍵調(diào)控因子,影響作物的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量[2]。作為數(shù)目最多,普遍分布的轉(zhuǎn)錄因子家族,bZIP基因在維持植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育或抗逆性等方面具有關(guān)鍵作用。許多研究結(jié)果表明bZIP基因參與調(diào)控植物眾多生理生化進(jìn)程,諸如種子萌發(fā)生長(zhǎng)、花發(fā)育和結(jié)實(shí)、植物衰老、逆境脅迫以及激素和光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等[3-8]。在作物中超表達(dá)bZIP基因會(huì)提高其抗逆性,諸如提高作物抗鹽、干旱或者極端溫度脅迫等逆境環(huán)境的能力[3,7-13]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族都存在一個(gè)保守的bZIP結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域的N端都含有N-x7-R/K-x9保守基序,作為入核信號(hào)和結(jié)合下游核酸特定序列,C 端由保守的重復(fù)亮氨酸拉鏈蛋白基序組成的a-螺旋結(jié)構(gòu),二聚體化構(gòu)成超螺旋結(jié)構(gòu),控制目標(biāo)基因的表達(dá)[14]。

    近些年來(lái),bZIP基因家族在眾多植物中得到報(bào)道,包括擬南芥(78個(gè))[15]、葡萄(55個(gè))[16]、水稻(89個(gè))[17]、玉米(125個(gè))[18]、高粱(92個(gè))[19]、蕎麥(96個(gè))[20]、油菜(247 個(gè))[21]、大豆(131 個(gè))[22]、芝麻(63 個(gè))[13]和番茄(69個(gè))[23]。馬鈴薯(80個(gè))[24]和辣椒(60個(gè))[7]。

    玉米是我國(guó)主要的糧、經(jīng)、飼兼用大田作物,為確保我國(guó)糧食安全起到基石作用。在玉米收獲前,往往遭遇各種逆境脅迫威脅,致使生產(chǎn)者遭受嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失,糧食安全面臨考驗(yàn),高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、抗逆氮高效利用的玉米新品種選育迫在眉睫。植物應(yīng)答不同逆境脅迫時(shí),bZIP轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著普遍而又關(guān)鍵作用。本文以鄭58 自交系為試驗(yàn)材料,選擇bZIP基因家族中的亞家族A 和部分B 亞家族成員,共計(jì)11 個(gè)ZmbZIP作為研究對(duì)象,系統(tǒng)研究其應(yīng)答200 mmol/L NaCl溶液,20% PEG6000,4 ℃低溫條件和氮缺乏脅迫條件時(shí)的表達(dá),為將來(lái)深入剖析這些基因功能提供信息。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    本文中以鄭58 玉米自交系為試驗(yàn)材料,在開(kāi)花期,取根、莖、葉、雄花和授粉15 d 的幼穗等不同器官,液氮冷凍處理,-80 ℃超低溫冰箱保存。,每份組織樣品為3 個(gè)獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)的組織混合樣品。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 非生物脅迫試驗(yàn)及定量PCR分析

    三葉期苗齡的幼苗進(jìn)行各種逆境脅迫試驗(yàn),分別在逆境脅迫處理的0、1、6 和24 h,采樣進(jìn)行液氮速凍,超低溫冰箱保存,RNA 提取及進(jìn)行定量PCR分析(引物見(jiàn)表1),非生物脅迫試驗(yàn)及定量PCR 等詳細(xì)試驗(yàn)內(nèi)容參考前人研究[25]。

    表1 11個(gè)ZmbZIP基因的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)引物Table 1 qRT-PCR primers for expression on analysis of ZmbZIP

    1.2.2 bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的生物信息學(xué)分析

    11個(gè)玉米bZIP和78個(gè)擬南芥AtbZIP的蛋白序列、基因序列和編碼序列來(lái)源于MaizeGDB(maize genetics and henomics database)和Phytozome v. 9.1(http://www.phytozome.net/)數(shù)據(jù)庫(kù)。11 個(gè)ZmbZIP蛋白基本信息利用各種在線常用分析軟件,包括在線工具ExPASy(https://web.expasy.org/protparam)進(jìn)行蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè), Mapinspect 軟件繪制其遺傳圖譜(http://www.plantbreeding.wur.nl/uk/software-mapinspect. html)。 GSDS(http://gsds. cbi.pku.edu.cn/index.php)軟件來(lái)繪制ZmbZIP基因結(jié)構(gòu)。MAFFT 軟件進(jìn)行多重蛋白序列比對(duì),利用MEGA 10軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 11個(gè)ZmbZIP的生物信息學(xué)分析

    11 個(gè)ZmbZIP基 因 的 各 種 數(shù) 據(jù) 見(jiàn) 表2。11 個(gè)ZmbZIP 蛋白的大小從161 aa(ZmbZIP86)到637 aa(ZmbZIP36),對(duì)應(yīng)分子量從17.87 kDa到67.53 kDa。11個(gè)ZmbZIP基因分布在8個(gè)不同染色體,各有2個(gè)基因分布的染色體為Chr2、Chr5和Chr6,含有1個(gè)基因的染色體為Chr1、Chr3、Chr7、Chr8 和Chr9(圖1A)。11 個(gè)ZmbZIP基因含有內(nèi)含子數(shù)目各異,預(yù)示著這些基因進(jìn)化歷程不同(圖1B)。典型的bZIP 結(jié)構(gòu)域都存在于ZmbZIP 蛋白N 末端,包括完整的堿式蛋白基序和亮氨酸鋅指基序(圖1C)。進(jìn)化樹(shù)數(shù)據(jù)顯示,11個(gè)ZmbZIPs可以劃分為3個(gè)亞家族,其中亞家族I含有ZmbZIP36,Ⅱ含有3個(gè)基因,包括ZmbZIP34、ZmbZIP92和ZmbZIP127,Ⅲ屬于AREB 亞家族,包含有AtABF2基因,共包含有5個(gè)ZmbZIP基因,表明11個(gè)ZmbZIP基因進(jìn)化歷程不同。

    表2 11個(gè)玉米bZIP基因基本信息Table 2 The basic information of bZIP gene family members in Zea mays

    圖 1 ZmbZIPs的生物信息學(xué)分析Figure 1 The bioinformatic analysis of ZmbZIPs

    2.2 ZmbZIP基因在玉米不同組織中的表達(dá)譜分析

    為了明確ZmbZIP在玉米中的不同組織中的表達(dá)水平,對(duì)5 種不同組織進(jìn)行了定量分析。結(jié)果如圖2所示,所探測(cè)的9個(gè)ZmbZIP基因的表達(dá)模式不同。5 個(gè)基因(ZmbZIP14、ZmbZIP34、ZmbZIP84、ZmbZIP92、ZmbZIP119和ZmbZIP127)主要在玉米的幼穗中高表達(dá),其表達(dá)量超過(guò)其他組織2倍以上,顯示這些基因在玉米幼穗形成進(jìn)程中可能的關(guān)鍵作用。ZmbZIP36和ZmbZIP110在根系器官中表達(dá)量最高,而ZmbZIP86同時(shí)在玉米根系和雄花器官中表達(dá)量最高,分別超過(guò)其他組織器官2倍以上,表明這些基因在這些玉米組織發(fā)育進(jìn)程中所發(fā)揮的關(guān)鍵作用。ZmbZIP基因不同的表達(dá)模式預(yù)示著ZmbZIP基因進(jìn)化和生物學(xué)功能的保守性和多樣性。

    圖2 ZmbZIP基因在玉米不同器官(根、莖、葉、雄花和穗)中的表達(dá)Figure 2 Expression of ZmbZIP gene in different tissues including root,stem,leaf,tassel,ear and tissue in maize

    2.3 各類逆境脅迫調(diào)控ZmbZIP基因表達(dá)分析

    同屬這一亞家族的大豆的GmbbZIP1的表達(dá)強(qiáng)烈受到ABA、干旱、鹽和低溫脅迫的誘導(dǎo)[26]。超表達(dá)GmbZIP1會(huì)改變ABA 或逆境脅迫相關(guān)途徑基因的表達(dá),提高大豆耐受鹽、干旱和低溫等脅迫的抗逆水平[26]。由圖3 顯示,在3 種不同逆境脅迫處理下,8 個(gè)ZmbZIP基因表達(dá)差異明顯。3 種不同逆境脅迫都同時(shí)明顯誘導(dǎo)ZmbZIP36基因表達(dá),NaCl 溶液脅迫和4 ℃脅迫24 h 時(shí),其表達(dá)水平比處理前分別上調(diào)9 倍和6 倍以上,PEG6000 脅迫處理1 h 時(shí),其表達(dá)水平誘導(dǎo)2倍以上,這些數(shù)據(jù)暗示ZmbZIP36可能都參與玉米應(yīng)答這3 種逆境脅迫響應(yīng)信號(hào)途徑。NaCl 溶液和低溫脅迫明顯誘導(dǎo)ZmbZIP86表達(dá),脅迫處理結(jié)束時(shí),表達(dá)水平比處理前分別上調(diào)3倍和11 倍,而PEG6000 明顯抑制該基因表達(dá),在脅迫處理結(jié)束,其表達(dá)量下降了87%左右,表明Zm-bZIP86參與3 種逆境脅迫的分子機(jī)制可能不同。NaCl溶液脅迫能明顯誘導(dǎo)ZmbZIP34和ZmbZIP110的表達(dá),在脅迫處理24 h時(shí),相比處理前,其表達(dá)水平分別上升了至少2倍和5倍以上,同時(shí),高滲和4 ℃低溫脅迫顯著抑制該基因表達(dá),說(shuō)明在玉米應(yīng)答不同逆境脅迫時(shí),這2個(gè)基因的分子調(diào)控機(jī)理各異。3種不同逆境脅迫同時(shí)抑制ZmbZIP127表達(dá),在脅迫處理6 h時(shí),其表達(dá)水平比處理前下降了80%左右,顯示ZmbZIP127參與逆境脅迫響應(yīng)信號(hào)途徑時(shí)的分子機(jī)制與其他的ZmbZIP基因的不同。

    圖3 高鹽、干旱和低溫脅迫時(shí)ZmbZIP的相對(duì)表達(dá)量Figure 3 Relative expression levels of ZmbZIPs under 200 mM NaCl,20% PEG6000 and 4 ℃ stress

    2.4 氮缺乏脅迫調(diào)控ZmbZIP基因表達(dá)分析

    由圖4 可知,不同氮形態(tài)缺乏脅迫能明顯影響葉片中ZmbZIP基因的表達(dá)水平。ZmbZIP14、ZmbZIP34、ZmbZIP84、ZmbZIP92、ZmbZIP110和ZmbZIP127顯著的受銨態(tài)氮缺乏脅迫誘導(dǎo),其中ZmbZIP34、ZmbZIP84、ZmbZIP92和ZmbZIP127受到脅迫處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)(>10 倍),分別比處理前上升了256、27、197 和96 倍,而在硝態(tài)氮缺乏脅迫下,ZmbZIP34和ZmbZIP92的表達(dá)先升后降,在脅迫處理24 h 時(shí),分別比處理前下降了99%和88%,Zm-bZIP84的表達(dá)一直下降,表明這4 個(gè)基因在玉米抵御硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫分子生理機(jī)制差異。這2 種脅迫處理能明顯抑制ZmbZIP36、ZmbZIP86和ZmbZIP119的表達(dá),尤其ZmbZIP86在脅迫處理24 h 時(shí),其表達(dá)水平比處理前下降了超過(guò)90%。這些數(shù)據(jù)顯示硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫調(diào)控ZmbZIP基因的表達(dá)水平,可能在玉米面臨氮缺乏脅迫時(shí)發(fā)揮著不同重要生理生化作用。

    圖4 葉片中的ZmbZIPs在氮缺乏脅迫時(shí)的表達(dá)水平Figure 4 Expression levels of ZmbZIPs of leaves under nitrogen stress

    由圖5 可知,氮缺乏脅迫能顯著調(diào)控根系ZmbZIP表達(dá)水平。ZmbZIP14、ZmbZIP36、ZmbZIP86、ZmbZIP110和ZmbZIP119等5個(gè)基因受硝態(tài)氮缺乏脅迫明顯誘導(dǎo),其中ZmbZIP14和ZmbZIP36的表達(dá)量最高上升了5 倍以上,而銨態(tài)氮缺乏脅迫顯著地抑制ZmbZIP基因,其中ZmbZIP86和ZmbZIP110的表達(dá)下降了90%以上,顯示這5個(gè)基因在不同氮形態(tài)缺乏響應(yīng)途徑中分子生理機(jī)制有差異。這2種氮脅迫同時(shí)顯著抑制ZmbZIP84表達(dá),在脅迫處理24 h時(shí),分別比處理前下降了63%和82%。ZmbZIP127則應(yīng)答不同形態(tài)氮缺乏相反,受銨態(tài)氮缺乏脅迫誘導(dǎo),而硝態(tài)氮缺乏脅迫抑制其表達(dá)。這些數(shù)據(jù)顯示ZmbZIP基因在玉米根系發(fā)育進(jìn)程中存在不同的分子調(diào)控機(jī)制。

    圖5 根中的ZmbZIPs在氮缺乏脅迫時(shí)的表達(dá)水平Figure 5 Expression levels of ZmbZIPs of roots under nitrogen stress

    3 討論與結(jié)論

    植物bZIP蛋白家族在植物的生長(zhǎng),以及在抵御各類逆境脅迫途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。本研究中,通過(guò)人為模擬高鹽、干旱、低溫和缺氮脅迫,以我國(guó)玉米骨干自交系鄭58為試驗(yàn)材料,系統(tǒng)地分析了11個(gè)ZmbZIP基因的響應(yīng)表達(dá)模式。已有大量研究表明bZIP基因廣泛受逆境脅迫調(diào)控[26]。據(jù)報(bào)道,在PEG6000 脅迫處理60 h 和96 h 時(shí),ZmbZIP84的表達(dá)受到明顯抑制,恢復(fù)澆水時(shí),該基因表達(dá)受誘導(dǎo)而上調(diào),而ZmbZIP34和ZmbZIP92則相反,受PEG6000脅迫誘導(dǎo)而上調(diào),恢復(fù)澆水,則表達(dá)下調(diào),ZmbZIP119受 鹽、PEG 和 溫 度 等 脅 迫 的 誘 導(dǎo)[27]。ZmbZIP127在胚的發(fā)育進(jìn)程中受到抑制,而其不同剪切體的表達(dá)受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫誘導(dǎo)[12],擬南芥和大豆中的同源基因,AtbZIP60和GmbZIP15也受到干旱和鹽脅迫的抑制[28]。利用不同的實(shí)驗(yàn)材料,我們的研究結(jié)果部分與前人各有異同,比如ZmbZIP92受PEG6000 脅迫的抑制,而受NaCl 脅迫的誘導(dǎo),ZmbZIP127也受到鹽、干旱等脅迫的抑制,而ZmbZIP84并沒(méi)有受到PEG6000 的明顯抑制,同時(shí)ZmbZIP127在玉米穗的發(fā)育進(jìn)程中受到明顯的誘導(dǎo),這些表達(dá)模式的不同可能來(lái)自于試驗(yàn)材料的不同,這在其他研究中也有報(bào)道[18]。

    在氮缺乏脅迫時(shí),大多數(shù)ZmbZIP基因表達(dá)水平各異。比如,硝態(tài)氮脅迫顯著抑制葉片ZmbZIP14的表達(dá),而根系則相反,受到誘導(dǎo)而上調(diào)接近10 倍,銨態(tài)氮缺乏脅迫下,葉片中的ZmbZIP34、ZmbZIP84和ZmbZIP92受到顯著的誘導(dǎo)上調(diào),而在根系這些基因的表達(dá)變化不明顯,甚至出現(xiàn)顯著的下調(diào)。根系中ZmbZIP36、ZmbZIP86和ZmbZIP119在硝態(tài)氮脅迫1 h時(shí),表現(xiàn)為明顯的上調(diào),而葉片中這些基因整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中都沒(méi)有表現(xiàn)明顯的上調(diào),這些數(shù)據(jù)表明這些基因在調(diào)控玉米根系或葉片中的氮代謝平衡分子機(jī)制中發(fā)揮著不同的作用。類似的研究在許多植物中也有過(guò)報(bào)道[29]。

    玉米種質(zhì)資源具有豐富的遺傳變異,不同基因型的種質(zhì)在抗逆方面,包括抗鹽、干旱、低溫以及氮缺乏脅迫等方面差異顯著,充分利用高抗優(yōu)質(zhì)玉米種質(zhì)資源,選育多抗?fàn)I養(yǎng)高效吸收利用玉米新品種,提高玉米新品種的綜合抗性及氮素利用效率,有利于玉米的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn),減少環(huán)境污染。傳統(tǒng)的常規(guī)育種技術(shù)周期長(zhǎng),效率低,隨著基因工程的成熟,挖掘控制玉米抗逆性的基因資源,解析其分子生理調(diào)控機(jī)制,利用基因工程等現(xiàn)代生物育種技術(shù)來(lái)培育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)氮高效吸收利用的玉米新品種成為可能。已知植物bZIP基因家族成員在維持植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆等生理活動(dòng)具有重要的調(diào)控作用,本研究利用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)11 個(gè)玉米bZIP基因應(yīng)答各類逆境脅迫時(shí)表達(dá)譜,為深入剖析這些基因的功能提供有用信息。

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