褪黑素浸種對滇油杉種子發(fā)芽及苗木生長和生理特性的影響

周冬梅，李蓮芳，朱存福， 顧 夢，張合瑤，李小軍，劉 嫻，侯海雄，王文俊

（1.西南林業(yè)大學林學院，昆明 650224；2.西南林業(yè)大學西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點實驗室，昆明 650224）

滇油杉（Keteleeria evelyniana）為松科（Pinaceae）油杉屬喬木樹種，其主要分布于云南，四川西南部和貴州西部等地區(qū)，分布區(qū)海拔1 400～2 500 m；云南主要以滇中為分布中心[1]。滇油杉干形通直，樹形優(yōu)美，樹皮耐火，因此，可用其作為分布區(qū)的優(yōu)質用材林和防火隔離帶樹種；其耐蔭，可與多種樹種混交成林[2-5]。在滇中，滇油杉的嫩莖葉作為森林蔬菜食用，可結合森林撫育開展資源有效利用。

滇油杉種子無堅硬的外種皮保護，種皮富含油腺，種子富含油脂，故此，成熟種子貯存期間油脂易氧化，種子容易失去生活力。已有研究指出，滇油杉種子在室溫下貯藏，其生活力最長保持時間為6個月，采集制種后采用0.45 g/L IBA和0.30 g/L IAA混合溶液浸種可提高滇油杉種子發(fā)芽率（56.0%）和發(fā)芽勢（27.0%），縮短發(fā)芽時間[6-7]。姜若超等[8]發(fā)現，0.1 g/L 的GA3和0.05%的殼寡糖（chitosan oligosaccharide, COS）溶液混合浸種提高滇油杉種子場圃發(fā)芽（69.6%）。褪黑素（melatonin, MT）是一種多功能的植物生長調節(jié)劑，其廣泛存在于動植物體內[9]，具有極強的抗氧化功能，有效緩解活性氧積累的傷害，保護細胞結構，清除自由基[10]。已有研究發(fā)現，褪黑素可以有效緩解鹽脅迫、干旱脅迫、鎘脅迫、低溫和高溫等脅迫的傷害[11-14]。黎力乙等[15]指出，150 mmol/L NaCl溶液脅迫下，0.1 mmol/L褪黑素浸種對苜蓿（Medicago sativa）種子緩解鹽脅迫極為有效。王慧等[16]采用褪黑素溶液葉面噴施和根施干旱脅迫的黑麥草（Lolium perenne）和苜蓿植株，黑麥草的生物量分別增加14.5%和29.6%，苜蓿的則增加36.6%和49.1%；提高黑麥草和苜蓿的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、過氧化物酶（peroxidase, POD）、過氧化氫酶（catalase, CAT）活性以及N、P 含量，減少葉片中丙二醛（malondialdehyde, MDA）的積累，抗氧化能力和保護酶活性顯著提高。向警等[17]在水稻（Oryza sativa）種子的試驗中發(fā)現，0.2 mmol/L的褪黑素溶液浸種后，可有效緩解鹽脅迫對水稻種子的傷害，提高種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、主根長及CAT活性；0.4 mmol/L的褪黑素溶液浸種后則有效提高種子的SOD和POD活性。

目前，滇油杉在其分布區(qū)森林面積較小，且碎片化，人工林培育是恢復其森林植被的主要途徑，苗木培育是造林的基礎。雖然已有滇油杉種子發(fā)芽和苗木培育的相關試驗研究，但促進種子發(fā)芽的措施僅開展生長激素浸種等方面的研究。本研究基于滇油杉種子富含油脂而易氧化的特性，采用不同濃度的褪黑素溶液浸種，了解外源褪黑素對滇油杉種子發(fā)芽和苗木抗氧化能力的影響，為滇油杉種子發(fā)芽及苗木培育提供科學依據，豐富褪黑素在種子發(fā)芽方面應用的相關資料。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況與材料

試驗于2022 年3 月底在西南林業(yè)大學林學院苗圃（102°45＇E，25o03＇N；海拔約1 890 m）中進行，其屬亞熱帶低緯度高原山地季風氣候，日照長，霜期短，年均氣溫約14.7 ℃，年均降水量1 035 mm，年均相對濕度68.2%，年均日照時長2 200 h；土壤類型為山地紅壤[18]，試驗地位于滇油杉的分布中心。滇油杉種子于2021年12月采自宜良縣國有花園林場（103°14＇E，24°92＇N；海拔約1 700 m），制種后測定的種子生活力為40.0%，種子貯藏于通風干燥的室溫條件下，播種時種子已在室溫下貯藏4 個月。褪黑素購自上海源葉生物科技有限公司（CAS 號S20287）的分析純粉劑，采用無紡布容器（9 cm×9 cm）進行發(fā)芽和苗木培育。

1.2 試驗設計

根據已有文獻和本試驗的種子特性確定褪黑素的濃度梯度，其濃度為0.3～1.2 mmol/L，并增加1個不處理的對照（表1），采用單因素完全隨機設計進行試驗實施，試驗共5個處理，每處理450粒種子（3次重復，每重復150粒）。

表1 試驗的因素水平表Table 1 Factorial levels of the trial

試驗前平整苗床，將采集的苗圃土分裝入容器中，采用0.5% KMnO4溶液對基質和苗床進行消毒。選取大小一致，形態(tài)飽滿的滇油杉種子，按試驗設計分別用紗布包裹后置于不同濃度褪黑素溶液中浸種12 h，浸種結束后，將種子播入無紡布容器中，每處理90 個無紡布容器，每個容器中播種5 粒種子，播種后均勻覆蓋一層基質并澆透水，搭建塑料拱棚，保證種子發(fā)芽所需溫度，拱棚上覆蓋遮陰網。發(fā)芽和苗木培育期間定期澆水除草。

1.3 指標測定

種子發(fā)芽后，每2 d 記錄1 次發(fā)芽數；待發(fā)芽結束后，計算發(fā)芽率（%）、發(fā)芽勢（%）、平均發(fā)芽時間（d）和發(fā)芽指數（粒/d）。發(fā)芽指標的計算公式如下[19]：

式中，n為測定時間內正常發(fā)芽的種子數；N為置床的種子數；N0為日發(fā)芽種子數達到最高峰時正常發(fā)芽的種子數；di為從播種之日算起的天數，ni為相應各日正常發(fā)芽粒數。

苗齡65 d 時，測定其幼苗生長和生物量，具體方法為苗木取回實驗室后測定地徑、苗高、胚軸長和針葉數，之后每株編號分根、莖、葉測定生物量鮮重，分單株按編號密封于信封內置入120 ℃烘箱內殺青2 h，再調至50 ℃烘干至恒重，稱其烘干重，計算根、莖、葉的含水率。生長和生物量測定的同期，每處理選擇3～5 株苗木，隨機剪取一定數量的針葉混合，稱取0.2 g針葉，采用乙醇浸提法[20]，測定其葉綠素和類胡蘿卜素含量；MDA 含量、CAT、POD 和SOD 活性使用蘇州格瑞思生物科技的試劑盒采用硫代巴比妥法[21]、紫外吸收法[22]、愈創(chuàng)木酚比色法[21]和WST-8 法[21]于紫外分光光度計（UV-6100 Double Beam Spectrophotometer）上進行測定。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2016 和SPSS 26.0 軟件進行數據整理和分析。處理間若指標呈現顯著或極顯著差異，采用鄧肯氏（Duncan＇s）法進行多重比較；相關性采用Pearson法分析[23]。

2 結果與分析

2.1 不同褪黑素溶液濃度浸種對滇油杉種子發(fā)芽的影響

不同濃度褪黑素溶液浸種的滇油杉種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢分別為41.5%～60.0%和14.5%～32.1%，CK的則為40.4%和15.2%；低濃度（0.3 mmol/L）褪黑素處理的發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著高于對照的（P發(fā)芽率=5.50E-05＜0.01，P發(fā)芽勢=9.42E-07＜0.01），與對照相比提高了48.5%和111.2%，發(fā)芽率和發(fā)芽勢隨著褪黑素濃度的升高呈現下降的趨勢（圖1），結合此二指標，說明低濃度的褪黑素溶液浸種有利于種子發(fā)芽。

褪黑素處理的平均發(fā)芽時間和發(fā)芽指數分別為12.6～14.6 d 和4.5～7.2 粒/d；CK 的 為13.3 d 和4.2粒/d，其中，1.2 mmol/L的平均發(fā)芽時間顯著地長于其余處理的（P=1.10E-02＜0.05），該濃度浸種延長種子發(fā)芽時間，降低發(fā)芽率；發(fā)芽指數與平均發(fā)芽時間相一致，隨著褪黑素溶液浸種濃度提高而降低；綜合平均發(fā)芽時間和發(fā)芽指數，0.3 mmol/L的褪黑素溶液浸種，提高種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的同時，實現其發(fā)芽整齊一致（圖1），即0.3 mmol/L 的褪黑素溶液浸種有益于滇油杉種子發(fā)芽。

圖1 處理的發(fā)芽性狀Figure 1 Germination indexes of treatment

2.2 褪黑素浸種對滇油杉幼苗生長及其器官含水率的影響

2.2.1 苗木生長

苗齡65 d 時，褪黑素處理的地徑、苗高、胚軸長、主根長和針葉數分別為0.8～0.9 mm、6.7～7.6 cm、3.0～3.6 cm、7.4～9.9 cm 和17.0～23.0 針/株（對照的分別為0.9 mm、6.5 cm、4.3 cm、7.4 cm 和15.8針/株），其苗高和針葉數優(yōu)于對照；處理間，0.3 mmol/L 褪黑素溶液浸種的主根長顯著長于除1.2 mmol/L 以外其余處理（P=5.10E-02＜0.05），針葉數也是該濃度的最多；對照的胚軸較褪黑素浸種的長（表2）。種子培育的滇油杉苗木，其地上部分為萌蘗芽形成的無性系苗木，較長的胚軸推遲萌蘗芽形成，影響苗木生長，因此，褪黑素溶液浸種縮短胚軸，促進萌蘗芽快速發(fā)育，提高種子發(fā)芽和促進苗木生長。

2.2.3 苗木含水率

褪黑素處理的根、莖和葉的含水率分別為70.8%～75.7%、78.7%～80.7%和75.2%～84.8%，對照的分別為67.0%、76.3%和74.3%，褪黑素處理的均高于對照的；處理間，0.3 mmol/L褪黑素溶液浸種的針葉含水率顯著地高于其余處理的（P=1.30E-02＜0.05；表2），即褪黑素溶液浸種同時可調節(jié)滇油杉幼苗的器官含水量。

表2 滇油杉幼苗生長及其器官含水統(tǒng)計Table 2 Statistics of seedling growth and water contents in organs of K. evelyniana seedlings

2.3 褪黑素溶液浸種對滇油杉幼苗葉綠素和類胡蘿卜素的影響

與生長測定的同期，褪黑素溶液浸種處理的葉綠素和類胡蘿卜素含量分別為0.96～1.43 mg/g 和0.16～0.23 mg/g（CK 的為0.98 mg/g 和0.21 mg/g）；與發(fā)芽性狀和生長相同，0.3 mmol/L 褪黑素溶液浸種的葉綠素含量極顯著地高于其余處理的（P=1.75E-05＜0.01），說明該濃度處理后，對種子發(fā)芽、葉綠素積累及苗木生長有著重要作用，隨著褪黑素濃度的升高葉綠素含量呈逐漸下降的趨勢；與葉綠素含量不同，0.9 mmol/L 處理的類胡蘿卜素含量極顯著高于其余處理的（P=4.18E-04＜0.01），隨著褪黑素濃度的升高，類胡蘿卜素含量呈現先增后降的趨勢（圖2），表明葉綠素和類胡蘿卜素合成對褪黑素浸種濃度的響應不一致，但濃度都不宜較高。

圖2 滇油杉幼苗葉綠素和類胡蘿卜素含量Figure 2 Chlorophyll and carotenoid contents of K. evelyniana seedlings

2.4 褪黑素溶液浸種對滇油杉幼苗抗氧化酶的影響

褪黑素溶液浸種處理的滇油杉幼苗葉片SOD、POD 和CAT 活性分別為210.8～360.7 U/（g·min）、24.4～64.9 U/（g·min）和1 754.6～1 916.3 U/（g·min），CK 的分別為185.4 U/（g·min）、34.8 U/（g·min）和1 532.1 U/（g·min），其中，褪黑素處理的SOD和CAT活性均高于對照的，處理間，SOD、POD 和CAT 活性具有極顯著的差異（P=1.20E-06～3.41E-03＜0.01）；0.3 mmol/L 處理的SOD 和POD 活性最高，CAT 活性最高的則是0.6 mmol/L 處理的，但0.3 mmol/L 處理的與其無顯著的差異（圖3）。綜合來說，0.3 mmol/L的褪黑素浸種提高滇油杉幼苗保護酶活性，可以增強對環(huán)境變化的抵御能力，促進苗木生長。

褪黑素處理的MDA 含量為9.5～17.0 nmol/g，對照處理的MDA 含量（25.6 nmol/g）顯著地高于褪黑素處理的（P=1.13E-02＜0.05），與保護酶活性相一致，0.3 mmol/L 處理的MDA 含量最低（圖3）。MDA含量越高，苗木受膜脂過氧化傷害越大，因此，也進一步證明0.3 mmol/L褪黑素處理可以有效清除活性氧，有利于苗木抗性的提高。

圖3 不同處理幼苗的抗氧化酶Figure 3 Antioxidant enzymes of different treatment seedlings

2.5 生長和生理指標間的相關性分析

相關分析結果（表3）表明，滇油杉種子發(fā)芽率與針葉數、葉綠素含量、SOD 活性、POD 活性之間，葉綠素含量與SOD活性、POD活性之間呈顯著或極顯著正相關關系（P＜0.05或P＜0.01）；地徑和發(fā)芽率之間，苗高和地徑之間，MDA含量與發(fā)芽率、葉綠素含量、SOD 活性之間顯著或極顯著負相關關系（P＜0.05 或P＜0.01）。表明經褪黑素溶液處理種子，滇油杉種子發(fā)芽性狀、幼苗器官生長及其含水率、幼苗生理特性間既有相互促進的，也有相互抑制的，可根據其相關性，選擇適宜濃度的褪黑素溶液浸種提高種子發(fā)芽性狀和苗木生長。

表3 滇油杉幼苗生長指標和生理指標間的相關性分析Table 3 Correlation analysis between growth index and physiological index of K. evelyniana seedlings

3 討論與結論

3.1 討論

生理后熟是指種子的種胚在形態(tài)上看似發(fā)育完全，但種胚的生理狀態(tài)不具備發(fā)芽條件的現象[24]。王嚴嚴[25]發(fā)現，額敏貝母（Fritillaria meleagroides）種子形態(tài)成熟后存在生理后熟現象，其中內源抑制物可能是導致生理休眠的原因。劉自剛等[26]研究結果指出，桔梗（Platycodon grandiflorum）開花后55 d時，種子發(fā)芽率為53.0%，55～61 d 時，發(fā)芽率達93.3%，說明種子具有生理后熟現象。本研究制種后測定的滇油杉種子生活力為40.0%，室溫儲藏4 個月后播種，褪黑素處理的發(fā)芽率為60.0%，對照的40.4%，發(fā)芽率均高于生活力，與前述兩篇文獻的類似，滇油杉種子是否也具有生理后熟現象，需要開展相關的研究進行判斷。

種子發(fā)芽是苗木培育的基礎，其發(fā)芽性狀直接影響后期的苗木生長[14]。褪黑素作為一種植物生長調節(jié)劑，被廣泛用于種子發(fā)芽與苗木生長的試驗中。已有研究表明，褪黑素有促進種子發(fā)芽，提高根系生長發(fā)育的作用[15]。劉珂等[27]發(fā)現，0.1 mmol/L褪黑素處理后顯著改善香椿（Toona sinensis）種子的發(fā)芽性狀；董秋麗等[28]試驗表明，干旱脅迫下，0.15和0.20 mmol/L 褪黑素分別處理12和6 h時，達烏里胡枝子（Lespedeza davurica）種子發(fā)芽率最高；李陽[29]研究發(fā)現，褪黑素處理棉花（Gossypiumspp.）種子后，可有效緩解NaCl 脅迫對棉花幼苗根系活力的抑制作用，提高其發(fā)芽率，促進幼苗下胚軸生長；唐鴻呂[30]研究指出，0.15 mmol/L 褪黑素處理種子，顯著提高低溫脅迫下甘藍（Brassica oleraceavar.capitata）種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和幼苗胚根長，促進幼苗地上部分、地下部分的生長及苗木生物量的積累。本研究中，0.3 mmol/L褪黑素浸種后，極顯著地提高滇油杉種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，隨著褪黑素濃度的升高，發(fā)芽率呈下降趨勢，與前述文獻低濃度的褪黑素有益于種子發(fā)芽的類似，但本研究改善種子發(fā)芽性狀的褪黑素濃度略高于文獻的，是否更低濃度褪黑素浸種會更有利于提高滇油杉種子的發(fā)芽率，有待進一步試驗研究。

葉綠體是植物進行光合作用的重要場所，葉綠素存在于光合膜上[31]。已有研究表明，外源褪黑素處理可提高植物的葉綠素含量。張盼盼等[12]進行褪黑素處理生菜（Lactuca sativa）幼苗的試驗指出，褪黑素溶液根施可緩解干旱脅迫對生菜幼苗的傷害，顯著增加總根長、地上地下部分干物質質量、葉綠素含量等（P＜0.05）。史中飛等[32]發(fā)現低溫脅迫下0.1 mmol/L 褪黑素預處理后油菜（Brassica napus）幼苗的葉綠素含量增加28.5%。本研究中，0.3 mmol/L和0.6 mmol/L褪黑素處理顯著提高滇油杉幼苗的葉綠素含量和類胡蘿卜素含量，與對照相比提高32.7%和9.0%，與史中飛等[32]的研究結果基本一致。隨著褪黑素濃度的升高，葉綠素的含量呈下降趨勢，即高濃度的褪黑素對葉綠素的合成產生不同程度的抑制，低濃度促進葉片葉綠素合成，這與徐向東等[33]的研究結果相一致，也許葉綠素合成與褪黑素的濃度間存在一個匹配閾值。

已有研究表明，褪黑素可通過提高植物的抗氧化能力而降低逆境引發(fā)的氧化脅迫對植物生長發(fā)育的影響[34]。古咸彬等[9]發(fā)現，中低濃度（0.1～0.2 mmol/L）褪黑素通過抑制H2O2和MDA 的生成，增強抗氧化酶的活性，從而緩解干旱對桃（Prunus persica）苗木的氧化傷害。施雨[35]發(fā)現，低濃度褪黑素處理后，苜蓿種子中MDA含量隨褪黑素濃度的增加先下降后上升。劉建龍[36]研究表明，褪黑素浸種后，顯著降低干旱脅迫下番茄（Solanum lycopersicum）幼苗葉片中的MDA 含量，增加SOD、CAT 和POD 活性。張娜等[37]的試驗研究指出，褪黑素處理后，可有效提高NaCl 脅迫下狼尾草（Pennisetum alopecuroides）SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶活性，降低MDA 的含量，從而緩解鹽脅迫對狼尾草幼苗的傷害。本研究中，未經褪黑素處理的滇油杉幼苗的MDA 含量均高于褪黑素處理的，除1.2 mmol/L 處理的POD 活性低于對照的外，其余POD、SOD 和CAT活性均高于對照的，揭示褪黑素處理后，可以有效清除活性氧，降低膜脂過氧化對滇油杉種子的傷害，提高幼苗的POD、SOD 和CAT 活性，與張娜等[37]研究結果一致。MDA是膜脂過氧化的產物，未經褪黑素處理的滇油杉種子，內部油脂氧化后對種子發(fā)芽產生脅迫，從而種子產生的多余自由基導致膜脂過氧化，對種子的發(fā)芽產生傷害，也許這是導致未經褪黑素處理的種子發(fā)芽率較低的原因。

基于褪黑素可以緩解植物體內受多種因素脅迫的結論[9,11-17,27-30,32-39]，本研究褪黑素處理后，提高滇油杉種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，促進主根生長，顯著提高幼苗的光合色素含量，降低膜脂氧化損傷，抑制MDA 的積累，提高抗氧化酶的活性，有益于苗木生長。

3.2 結論

本試驗采用單因素完全隨機設計，開展褪黑素不同溶液濃度處理對滇油杉種子發(fā)芽及幼苗生長和生理指標影響的試驗。褪黑素溶液浸種顯著或極顯著提高滇油杉種子發(fā)芽性狀、影響光合色素含量及抗氧化物質的活性（P＜0.05 或P＜0.01）。綜合發(fā)芽、幼苗生長和生理特性，0.3 mmol/L褪黑素溶液浸種全面提高種子發(fā)芽性狀、光合色素形成和改善保護酶的活性，促進苗木生長，可應用于滇油杉的種子處理。