不同F(xiàn)GFR1突變與先天性低促性腺激素性性腺功能減退癥的相關(guān)性

楊宇帆，王 曦，聶 敏，伍學(xué)焱，茅江峰

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 內(nèi)分泌科，北京 100730

先天性低促性腺激素性性腺功能減退癥(congenital hypogonadotropic hypogonadism,CHH)是一類由多種基因突變導(dǎo)致的下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)分泌減少或作用缺陷引起的先天性疾病,男性發(fā)病率約1/10 000,女性更低。疾病主要表現(xiàn)為青春期不發(fā)育和生育障礙[1]。

目前發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1(fibro-blast growth factor receptor 1,FGFR1)、促性腺激素釋放激素受體(gonadotropin releasing hormone receptor,GnRHR)、白細(xì)胞介素17受體D(interleukin-17 receptor D,IL17RD)等30余個(gè)基因與CHH發(fā)病有關(guān)。FGFR1突變導(dǎo)致CHH較為常見(jiàn),占全部患者8%～10%,符合常染色體顯性遺傳模式[2]。FGFR1位于染色體8p11.23,包含18個(gè)外顯子,編碼的FGFR1蛋白屬于酪氨酸激酶受體超家族成員,在體內(nèi)廣泛表達(dá)[3]。

新近的研究發(fā)現(xiàn),攜帶相同F(xiàn)GFR1突變的個(gè)體,臨床表現(xiàn)差別很大。同一家系內(nèi)的攜帶者可表現(xiàn)正常性腺軸功能,也可表現(xiàn)為CHH[4]。因此僅以FGFR1突變難以解釋疾病發(fā)生。本研究擬通過(guò)對(duì)FGFR1突變CHH患者多個(gè)基因進(jìn)行篩查,尋找是否同時(shí)存在其他基因突變,共同導(dǎo)致疾病發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 病例

2013年5月至2021年5月在北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科門(mén)診隨訪的CHH患者共160例。同時(shí)滿足以下條件可診斷CHH。1)男性年齡≥18歲或女性年齡≥16歲仍無(wú)第二性征發(fā)育;2)男性睪酮(testosterone,T)<1 ng/mL 或女性雌二醇<25 pg/mL,且黃體生成素(luteinizing hormone,LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)水平均低下;3)其余垂體前葉激素水平正常;4)鞍區(qū)磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)正常;如果患者同時(shí)存在嗅覺(jué)喪失,可診斷為卡爾曼綜合征(Kallmann syndrome,KS)。嗅覺(jué)功能正常的CHH患者可診斷為嗅覺(jué)正常的CHH(normosmic CHH,nCHH)。經(jīng)全部患者和部分患者父母知情同意,抽取外周血,提取基因組DNA進(jìn)行二代測(cè)序panel分析。研究通過(guò)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(編號(hào)JS-2111)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集:包括患者的診斷、年齡、性別、睪丸體積、基礎(chǔ)LH、FSH和T水平(北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科測(cè)定)。

1.2.2 基因的檢測(cè):按照操作說(shuō)明書(shū),提取患者及父母外周血白細(xì)胞DNA,使用高通量測(cè)序系統(tǒng)Illumina Nextseq 500對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行panel二代測(cè)序,對(duì)FGFR1突變進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證突變來(lái)源。

1.2.3 測(cè)序結(jié)果分析:二代測(cè)序的定制化基因panel包含CHH相關(guān)的基因97個(gè)。參考基因組版本為GRCh37/hg19,并參考千人基因組、外顯子組測(cè)序項(xiàng)目 (ESP6500)、外顯子組聚集聯(lián)盟(The Exome Aggregation Consortium,EXAC)和EXAC-EAS(EXAC約4 000個(gè)東亞人)的數(shù)據(jù)庫(kù)。將致病基因的測(cè)序結(jié)果,與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Gene Mutation Database,HGMD)進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4FGFR1突變的致病性分析:使用1 000 g 2015aug_all、GnomAD判斷新發(fā)突變的頻率,GERP評(píng)估突變位點(diǎn)的氨基酸保守性。所有突變使用美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(The American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南[5]判斷致病性。使用SIFT,PolyPhen_2,MutationTaster,REVEL,MCAP,LRT這6種生物信息學(xué)軟件判斷FGFR1和其他CHH相關(guān)基因錯(cuò)義突變的致病性。從未報(bào)道過(guò)的突變、或在NCBI、Ensembl、 Exome Variant Server和500 normal Chinese controls中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的突變,或在上述數(shù)據(jù)庫(kù)中等位基因頻率≤0.001,同時(shí)不少于3種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)為有害,可認(rèn)為該突變存在致病性,認(rèn)定為可能致病。

1.2.5 基因相互作用分析:使用Genemania研究FGFR1與其他CHH相關(guān)基因之間的作用。使用String檢測(cè)蛋白作用。通過(guò)Gene Ontology分析尋找基因作用通路。

2 結(jié)果

2.1 FGFR1突變分布與致病性分析

9.3%(15/160)的CHH患者 (男/女=11/4;nCHH/KS=8/7)中共發(fā)現(xiàn)15個(gè)罕見(jiàn)FGFR1突變(表1)。其中10個(gè)為錯(cuò)義突變,包括p.V273M[6]、p.P366L[7]、p.R254W[8]、p.R424H[6]、p.L326F、p.S125L、p.M1I、p.R80C、p.G260R和p.T761I。(前4個(gè)已被報(bào)道,其余為新發(fā)突變)。5個(gè)可能導(dǎo)致蛋白發(fā)生截?cái)嗟耐蛔?c.536delC、c.838dupT、c.54_55del、c.250_264delGAGGAGGTGGAGGTG、c.325_342delAGTGACACCACCTACTTC(均為新發(fā)突變)。根據(jù)ACMG指南、SIFT等6種生物信息學(xué)軟件和GREP軟件預(yù)測(cè)結(jié)果,這些突變?cè)谂懦鄳B(tài)性后均被判定為可能致病性。

表1 FGFR1突變的來(lái)源Table 1 Inheritance of FGFR1 mutations

FGFR1突變來(lái)源分析:有9例(男性7例,女性2例)FGFR1突變來(lái)自父/母(遺傳突變組)。有6人為自發(fā)突變(自發(fā)突變組)。 遺傳突變組的FGFR1的突變主要為錯(cuò)義突變,只有1例是缺失突變(109_114delSDTTYF),而自發(fā)突變組的突變類型包括3例的截?cái)嗤蛔?C19Hfs*3、P179Lfs*13、Y280Lfs*2)、1例缺失突變(84_88delEEVEV)及2例錯(cuò)義突變。

15例FGFR1突變的CHH患者父母均為正常表型。

2.2 其他CHH相關(guān)基因突變來(lái)源與致病性分析

在遺傳突變組(n=9)中,6例患者還同時(shí)存在另一個(gè)基因的突變(表2)。除FGFR1突變外,其他突變位點(diǎn)分別為前動(dòng)力蛋白受體2(prokineticin receptor 2,PROKR2) (W178S)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(fibroblast growth factor 8,FGF8)(T121N)、硫酸肝素6-O-磺基轉(zhuǎn)移酶1(heparin sulfate 6-o-sulfotransferase 1,HS6ST1)(P242L)、信號(hào)素3A(semaphorin 3A,SEMA3A)(R734W)、亮氨酸拉鏈樣轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1(leucine-zipper-like transcription regulator 1,LZTR1)(c.21delG)。根據(jù)ACMG指南,LZTR1(p.Q10rfs *15)可能導(dǎo)致蛋白截短而判定為致病性突變。PROKR2(W178S)已有多次致病性突變的報(bào)道[9]。SEMA3A(R734W)、FGF8(T121N)和HS6ST1(P242L),經(jīng)過(guò)SIFT等6種生信軟件和GREP軟件分析,均判定為致病性。此外,有1例患者是FGFR1復(fù)合雜合突變。這些基因突變,來(lái)自表型正常的父親或母親。

表2 多基因位點(diǎn)突變的CHH患者Table 2 Multiple gene mutations in CHH patients

利用Genemania軟件分析這些基因的相互作用FGFR1和其他基因(PROKR2、SEMA3A、FGF8和LZTR1)之間存在復(fù)雜相互作用。FGFR1與FGF8關(guān)系最為密切(圖1A)。String蛋白相互作用分析表明,FGFR1蛋白與HS6ST1、SEMA3A、FGF8和PROKR2蛋白之間具有相互作用,但與LZTR1蛋白無(wú)相互作用(圖1B)。此外,Gene Ontology分析表明,FGFR1、SEMA3A、FGF8和HS6ST1影響神經(jīng)元發(fā)育,FGFR1、SEMA3A和FGF8影響前腦神經(jīng)元生成(圖1C)。因此推測(cè),FGFR1+HS6ST1、FGFR1+SEMA3A、FGFR1+FGF8、FGFR1+PROKR2、FGFR1+LZTR1的有害突變組合可能導(dǎo)致CHH發(fā)生。

A:gene-gene interactions were predicted using genemania. Blue lines indicate co-localization. Red lines indicate physical interactions. Purple lines indicate co-expression; B:association between FGFR1 protein and other proteins. Green lines indicate text mining. Black lines indicate co-expression. The pink line indicates that the association was experimentally determined. The blue line indicates that the association was determined from a curated database; C:pathways highlighted by gene ontology analysis. Red indicates genes that affect neuron development. Purple indicates genes that affect forebrain neuron generation

在自發(fā)突變組(n=6)中均未發(fā)現(xiàn)其他CHH相關(guān)基因突變。

3 討論

本研究篩查到15例FGFR1突變的CHH患者中存在15個(gè)致病性FGFR1突變。攜帶FGFR1突變的父/母性腺軸功能正常,但子代發(fā)生CHH。這表明來(lái)自父/母的FGFR1單基因突變不足以導(dǎo)致CHH,此時(shí)可能需另一個(gè)CHH相關(guān)基因突變的損傷作用積累,才會(huì)導(dǎo)致CHH發(fā)生。此外,Fgfr1缺失小鼠表現(xiàn)多樣,可出現(xiàn)青春發(fā)育延遲,生殖能力下降,不育等。

研究提示,多個(gè)微效基因缺陷積累可能導(dǎo)致CHH發(fā)生[10]。不同的基因突變組合,例如FGFR1+FGFR1或GNRHR+GNRHR或PROKR2+IR17LD、FGFR1+GNRHR、FGFR1+FGF8、FGFR1+KAL1、FGFR1+NELF、PROK2+PROKR2或FGFR1+PROKR2,均可能導(dǎo)致疾病發(fā)生[10-11]。本研究中,遺傳突變組的6例(6/9)患者存在雙基因突變,為“雙基因突變導(dǎo)致CHH發(fā)生”理論提供了更多證據(jù)。

這些基因突變會(huì)損傷GnRH神經(jīng)元功能。原因如下:1)FGF8是FGFR1的主要配體。FGF8-FGFR1信號(hào)通路在調(diào)節(jié)GnRH神經(jīng)元遷移和分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此FGFR1和FGF8突變組合會(huì)導(dǎo)致CHH[12]。2)Sema3a突變小鼠GnRH神經(jīng)元數(shù)量減少,但單純Sema3a雜合突變難以導(dǎo)致CHH。已經(jīng)報(bào)道的2例同時(shí)攜帶FGFR1和SEMA3A突變的CHH患者[13],和本研究中病例相似。3)HS6ST1編碼的蛋白,參與FGF8-FGFR1信號(hào)作用,突變影響GnRH神經(jīng)元遷移。4)LZTR1突變可能導(dǎo)致GnRH神經(jīng)元遷移障礙,引起CHH和雙側(cè)隱睪[14]。綜上所述,這些基因突變引發(fā)的致病性較弱,常需要另一個(gè)CHH基因突變才會(huì)致病。

本研究存在的局限性。1)未對(duì)突變基因進(jìn)行功能學(xué)驗(yàn)證,而只通過(guò)軟件進(jìn)行了預(yù)測(cè)。2)在遺傳突變組中,還有3例患者未發(fā)現(xiàn)另一個(gè)CHH相關(guān)基因突變。這和對(duì)候選CHH致病基因認(rèn)識(shí)不足有關(guān)?？赡艽嬖谄渌虏』蛲蛔?協(xié)同積累損傷作用而導(dǎo)致疾病發(fā)生。

總之,來(lái)自生殖表型正常父/母的FGFR1突變患者,常需另一個(gè)CHH相關(guān)基因突變的協(xié)同打擊才會(huì)導(dǎo)致CHH。研究結(jié)果拓展了對(duì)雙基因突變導(dǎo)致CHH的機(jī)制的認(rèn)識(shí)。