NT5C2在疾病及治療中的研究進(jìn)展

舒 玲，霍本念，宋 林

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 藥學(xué)部，國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室 兒科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400014

NT5C2所編碼的胞質(zhì)5’-核苷酸酶Ⅱ(cytosolic 5’-nucleotidase Ⅱ,cN-Ⅱ),可水解肌苷-5’-單磷酸(inosine 5’-monophosphate,5’-IMP)和其他嘌呤核苷酸,在細(xì)胞嘌呤代謝中發(fā)揮重要作用[1]。近年來,多項研究顯示NT5C2在人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療中均發(fā)揮作用[2-4]。核苷類似物作為癌、病毒性疾病等多種疾病的治療藥物,其在體內(nèi)可被cN-Ⅱ去磷酸化而導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生以及疾病的復(fù)發(fā)[5]。此外,NT5C2的表達(dá)與2型糖尿病、精神分裂癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展均有相關(guān)性[6-7]?，F(xiàn)有的研究已確定NT5C2及其突變與機(jī)體相應(yīng)的病理改變相關(guān)[8]。本文旨在對現(xiàn)有的NT5C2在疾病及治療中的研究進(jìn)行綜述,為基于NT5C2的相關(guān)研究和疾病的治療提供參考。

1 NT5C2概述

1.1 NT5C2結(jié)構(gòu)

NT5C2位于染色體10q24.32,其編碼的蛋白為cN-Ⅱ,為哺乳動物的7個已知5’-核苷酸酶之一[9]。該酶為兩個緊密連接的二聚體組成的同源四聚體,cN-Ⅱ有一個α/β結(jié)構(gòu)域,包含一個被8個α-螺旋包圍的8股反平行β-折疊,其核心區(qū)域包含了其底物核苷磷酸鹽的結(jié)合位點;而cN-Ⅱ的核心結(jié)構(gòu)域包含5個附加的α螺旋和一些參與亞基相互作用或效應(yīng)子結(jié)合的環(huán)結(jié)構(gòu)。晶體學(xué)分析發(fā)現(xiàn)根據(jù)變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的不同,cN-Ⅱ呈現(xiàn)兩種不同活性的構(gòu)象[1,10]。

1.2 NT5C2功能

NT5C2所編碼的cN-Ⅱ作為一種水解酶,廣泛分布于機(jī)體各組織器官,cN-Ⅱ酶主要參與6-羥基嘌呤為底物的核苷酸反應(yīng),優(yōu)先水解5’-IMP和單磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)等,通過去磷酸化生成肌苷和腺苷,調(diào)節(jié)核苷酸庫,維持細(xì)胞能量平衡[1]。在生理濃度下的ATP中,形成活性較高的構(gòu)象,反之,cN-Ⅱ活性降低,進(jìn)而導(dǎo)致AMP和IMP的積累,可能導(dǎo)致腺苷酸活化蛋白激酶的激活和腺苷的排泄[1]。其生物學(xué)作用為參與機(jī)體脫氧核糖核苷酸三磷酸和核糖核苷酸三磷酸的水平調(diào)節(jié),維持其體內(nèi)平衡。因此,cN-Ⅱ可以核苷類似物為底物,影響其體內(nèi)代謝及藥物濃度[11]。

2 NT5C2與急性白血病

急性白血病(acute leukemia,AL)為一種以骨髓中白血病細(xì)胞無限增殖、分化阻滯和凋亡受抑為特征的惡性克隆性疾病,主要包括急性淋巴細(xì)胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)和急性髓細(xì)胞性白血病(acute myeloid leukemia,AML)。ALL為小兒最常見的惡性腫瘤,仍有逐年上升趨勢,目前其治療產(chǎn)生約80% 5年無事件生存率,但復(fù)發(fā)后存活率降低[12-13]。6-巰基嘌呤(6-mercaptpurine,6-MP)、阿糖胞苷等核苷類似物為兒童ALL治療的重要藥物,其作為前體在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)激酶磷酸化生成活性代謝物,以抑制DNA生成,并殺滅腫瘤細(xì)胞。近年來,ALL耐藥和復(fù)發(fā)的防治得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,多項研究表明NT5C2表達(dá)與ALL及AML核苷類似物耐藥性和疾病復(fù)發(fā)有關(guān)[8,14]。

2.1 NT5C2高表達(dá)與急性白血病的相關(guān)性

NT5C2mRNA的高表達(dá)與ALL患者預(yù)后較差有關(guān),近期有兩項研究均顯示,急性白血病復(fù)發(fā)患兒骨髓樣本中NT5C2mRNA水平顯著高于完全緩解組患兒[15-16]。表明NT5C2mRNA的高表達(dá)與急性白血病患者預(yù)后較差和疾病復(fù)發(fā)相關(guān),因此在早期治療時進(jìn)行NT5C2mRNA表達(dá)水平的監(jiān)測有利于對疾病進(jìn)展的早期監(jiān)控和處理。

2.2 NT5C2突變與6-MP耐藥

cN-Ⅱ高表達(dá)可導(dǎo)致6-巰基嘌呤[mercapto-purin(hydrate),6-MP]的去磷酸化和清除,進(jìn)而減少其活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用,從而導(dǎo)致耐藥[5]。復(fù)發(fā)的ALL中獲得性NT5C2突變會阻礙DNA和巰鳥嘌呤核苷酸(thioguanine nucleotide,TGN)結(jié)合物的形成,是6-MP耐藥的一個常見機(jī)制[3]。有研究對NT5C2進(jìn)行靶向測序,評估NT5C2變異對ALL患兒6-MP代謝物的個體間差異的影響,結(jié)果顯示變異體rs58700372與NT5C2轉(zhuǎn)錄活性升高和6-MP活性降低(即產(chǎn)生較低的代謝TGN)有關(guān),表明NT5C2種系變異對巰代嘌呤藥物處置的患者間變異有顯著影響[3]。

為了研究6-MP耐藥的分子機(jī)制,有研究建立了一系列穩(wěn)定過表達(dá)野生型或突變型NT5C2的ALL細(xì)胞系(Nalm6和REH),在Nalm6和REH中,突變體NT5C2的異位表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞對6-MP的明顯耐藥,而過度表達(dá)野生型NT5C2的細(xì)胞對6-MP仍高度敏感,表明突變體NT5C2不僅是野生型的超活性形式,而可能獲得了與6-MP代謝相關(guān)的新催化功能,即NT5C2突變改變了6-MP體內(nèi)細(xì)胞代謝,且對內(nèi)源性核苷酸的平衡和巰嘌呤(thiopurine)誘導(dǎo)的代謝組學(xué)反應(yīng)可能造成了影響[5]。因此,多種機(jī)制可能被整合在一起,使攜帶NT5C2突變的白血病細(xì)胞具有6-MP耐藥性。

2.3 NT5C2突變與ALL復(fù)發(fā)

ALL復(fù)發(fā)是由于亞克隆的出現(xiàn),亞克隆通過基因改變獲得競爭優(yōu)勢,導(dǎo)致對治療中使用的一種或多種藥物產(chǎn)生耐藥性。亞克隆ALLNT5C2突變的存在與復(fù)發(fā)后較差的預(yù)后相關(guān)[14]。近來,有研究基于數(shù)字液滴聚合酶鏈反應(yīng),在6例兒童ALL患者復(fù)發(fā)前的外周血樣本中成功檢測到NT5C2的變異[8]。然而,有研究對初始診斷時采集的503例兒童ALL樣本隊列中的包含NT5C2在內(nèi)的7個復(fù)發(fā)相關(guān)基因進(jìn)行深度靶向測序,結(jié)果卻只在一例非復(fù)發(fā)病例中檢測到亞克隆NT5C2突變,原因可能是在診斷時激活NT5C2突變數(shù)量低,突變通常只能在非常小的細(xì)胞亞群中檢測到,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于該研究中的單分子的分子逆轉(zhuǎn)探針(single-molecule molecular inversion probe,smMIP)分析的檢測水平[17]。

3 NT5C2與2型糖尿病

2型糖尿病為一種代謝性疾病,其特點是在胰島素抵抗和相對胰島素不足的情況下出現(xiàn)高血糖,目前其病因尚不清楚,國內(nèi)外學(xué)者多認(rèn)為其為多基因遺傳性疾病。有研究顯示NT5C2為調(diào)節(jié)2型糖尿病發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵基因之一[18]。 高脂飲食小鼠中,Nt5c2敲除小鼠與野生型比較,體質(zhì)量/脂肪增加減少,葡萄糖耐量提高,血漿胰島素、三酰甘油和尿酸水平降低;Nt5c2敲除小鼠附睪脂肪細(xì)胞更小、更少,脂解率更高,表明小鼠Nt5c2缺失對體質(zhì)量增加、肥胖、胰島素抵抗和相關(guān)的高血糖有保護(hù)作用;Nt5c2的缺失可能通過增加磷脂酰肌醇3-激酶信號,提高胰島素在高脂血癥小鼠中的葡萄糖攝取量[6]。細(xì)胞試驗顯示大鼠胰島素瘤上皮細(xì)胞RIN-m5F 瞬時轉(zhuǎn)染Nt5c2可導(dǎo)致DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(DNA methyltransferase 1,DNMT1)表達(dá)下調(diào)且胰島素受體表達(dá)上調(diào),Nt5c2敲除可導(dǎo)致DNMT1過表達(dá)以及胰島素受體表達(dá)抑制,表明NT5C2參與了胰島素信號傳導(dǎo)[6]。目前僅有的研究表明NT5C2可能是治療2型糖尿病的一個靶點,但是這需要未來更多的相關(guān)研究去驗證。

4 NT5C2與精神分裂癥

現(xiàn)有研究顯示精神分裂癥(schizophrenia,SCZ)可能與胎兒和成人大腦中NT5C2表達(dá)降低有關(guān)[19]。另一項通過整合SCZ的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)匯總統(tǒng)計數(shù)據(jù),以及組織特異性表達(dá)數(shù)量性狀位點(eQTL)數(shù)據(jù)的研究,整合6種不同方法預(yù)測的這些致病基因,最終確定了包括NT5C2在內(nèi)的150個與SCZ相關(guān)的潛在候選基因[7]。NT5C2與SCZ有大量的關(guān)聯(lián)性研究,但在理解其潛在機(jī)制的過程仍是艱難的,未來需要進(jìn)一步探索。

5 NT5C2與孤獨癥譜系障礙

孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)為廣泛性發(fā)育障礙的典型疾病,對患者正常生活有極大影響,其病因尚未明確,近年來臨床上多認(rèn)為與基因異常改變有關(guān)[20]。2019年,一項針對640例中國北方漢族自閉癥患者的研究結(jié)果顯示rs11191580與孤獨癥譜系障礙無關(guān)[21];2020年,一項針對中國南方漢族中的602例ASD患者和604名健康受試者的對照研究,結(jié)果顯示男童rs11191580與孤獨癥譜系障礙具有相關(guān)性。該研究顯示在孤獨癥譜系障礙患者中NT5C2表達(dá)失調(diào);此外,rs111191580還可以調(diào)節(jié)NT5C2在幾個腦部亞組織的表達(dá)[20]。兩項研究的結(jié)果不一致,可能的原因是兩者樣本來源于不同區(qū)域,另外后者進(jìn)行了對照研究,可靠度更高。NT5C2與ASD的相關(guān)性還需要在更大的樣本中進(jìn)行確認(rèn)。

6 NT5C2與遺傳性痙攣性截癱

遺傳性痙攣性截癱是一種罕見的異質(zhì)性神經(jīng)退行性疾病,一般伴有精神發(fā)育遲滯和運(yùn)動障礙。cN-Ⅱ在維持脊髓和大腦嘌呤核苷酸和游離核苷酸的平衡中起著重要作用。NT5C2可以調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞中的蛋白質(zhì)翻譯,果蠅Nt5c2直系同源體的神經(jīng)元表達(dá)在爬升實驗中被證明會導(dǎo)致運(yùn)動缺陷[4]。有研究對一個沙特阿拉伯家庭的父母及兩例遺傳性痙攣性截癱患兒(年齡分別為5歲和3歲),以及100名健康人群(作為對照組)進(jìn)行血樣提取、全外顯子測序和桑格測序,結(jié)果顯示患兒在第6外顯子/內(nèi)含子交界處,NT5C2可能有一個純合子剪接體(enst00000343289: c.539+1G>T)的供體改變,且進(jìn)一步的對照組分析排除了突變的可能性,該剪接改變擴(kuò)大了NT5C2在神經(jīng)發(fā)育障礙中的突變譜,為進(jìn)一步解釋NT5C2與痙攣型雙邊麻痺性腦癱、發(fā)育遲緩和小頭畸形等之間的相關(guān)性提供了新的依據(jù)[22]。盡管有這樣的證據(jù),未來仍需要用NT5C2敲除試驗來證明兩者間的相關(guān)性。

7 NT5C2與冠心病

冠心病為全球致殘和死亡的主要原因,而遺傳因素為其發(fā)病關(guān)鍵因素之一。在GWAS匯總統(tǒng)計數(shù)據(jù)中顯示NT5C2是冠心病的候選基因[7]。最近,一項針對中國漢族人群的研究,納入501例冠心病患者作為試驗組和496名健康受試者作為對照組,基于dbSNP database等數(shù)據(jù)庫選擇在亞洲人群中最小等位頻率大于5%的NT5C2SNPs進(jìn)行檢測,包括rs79927334、rs7909022、rs2148198和rs79237883。結(jié)果顯示rs2148198與漢族人群冠心病的風(fēng)險密切相關(guān);進(jìn)一步分層分析顯示 rs2148198與男性以及61歲以下個體的冠心病風(fēng)險增加有關(guān)[23]。這些研究都表明了NT5C2與冠心病的相關(guān)性,為進(jìn)一步探究其相關(guān)機(jī)制提供依據(jù),未來需要更多深入的研究。

8 NT5C2與血壓

血壓是卒中和冠狀動脈疾病最強(qiáng)的遺傳風(fēng)險因素,與其相關(guān)的染色體10q24.32基因在人和斑馬魚之間高度保守。基于斑馬魚的研究顯示,nt5c2敲除可提高血流量、增加動脈脈搏等;在nt5c2敲除的情況下,抗高血壓藥物雷米普利無提高血流量的效果,表明nt5c2參與了高血壓的發(fā)生。該研究還發(fā)現(xiàn)nt5c2敲除可誘導(dǎo)另一高血壓相關(guān)基因Cnnm2下調(diào),Cnnm2敲除也可誘導(dǎo)nt5c2下調(diào)。此外,基因敲除的斑馬魚模型還表現(xiàn)出腎功能受損、腎素水平升高,提示nt5c2和Cnnm2依賴的血流參數(shù)增加與腎素-血管緊張素-醛固酮信號通路相關(guān)[24]。這表明NT5C2或是未來治療高血壓的基因靶點,為治療高血壓提供一個新方向。

9 問題與展望

綜上所述,現(xiàn)有研究顯示NT5C2與急性白血病、2型糖尿病、精神分裂癥、孤獨癥譜系障礙等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展都可能有相關(guān)性,相關(guān)突變機(jī)制及其在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制的闡明,可以為進(jìn)一步認(rèn)識疾病和臨床診療提供依據(jù)。目前,針對NT5C2的研究主要集中在急性白血病,已有的研究證實NT5C2可通過影響核苷類似物的體內(nèi)代謝而導(dǎo)致急性白血病治療中相關(guān)藥物耐藥的產(chǎn)生和疾病的復(fù)發(fā),國外越來越多的研究顯示cN-Ⅱ抑制劑的開發(fā)是防治ALL核苷類似物耐藥和疾病復(fù)發(fā)的重要途徑,并可見cN-Ⅱ核苷類抑制劑相關(guān)的研究報道,為ALL耐藥和復(fù)發(fā)提供了新的治療策略和途徑[25]。而在2型糖尿病、精神分裂癥等其余疾病中大多還停留在相關(guān)性研究,從相關(guān)性到了解其機(jī)制還有一段距離,仍需要相關(guān)的研究進(jìn)行探索,同時,由于NT5C2廣泛分布于機(jī)體各組織器官,可能參與了多種疾病的體內(nèi)過程,未來進(jìn)一步針對NT5C2在各疾病及治療中的作用開展研究仍是必要的,而基于NT5C2及cN-Ⅱ的新藥研發(fā)也有望成為相關(guān)疾病的新治療途徑。