基于PacBio16SrRNA基因全長測序調(diào)查某校園水體微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究

葉玨妃 張逸博 萬晶 黨晨原 付杰

關(guān)鍵詞：微生物多樣性；群落結(jié)構(gòu)；水體；16S rRNA基因全長測序

前言

微生物是淡水系統(tǒng)中的重要組成部分，其種類眾多且組成復(fù)雜，這種多樣性使得環(huán)境中微生物群落的結(jié)構(gòu)和代謝功能出現(xiàn)差異，進(jìn)而對水生生態(tài)系統(tǒng)的功能產(chǎn)生不同的影響。同時微生物對其所處水生環(huán)境的變化十分敏感，能夠反映出水環(huán)境的質(zhì)量和水生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。如今微生物研究廣泛采用16S rRNA基因測序技術(shù)，特別是近年來，16S rRNA基因全長測序技術(shù)的應(yīng)用，使得我們能夠獲得環(huán)境微生物群落的高分辨率結(jié)構(gòu)（精確到種、甚至菌株）。

空氣、土壤以及水體等是校園環(huán)境的重要組成部分，其環(huán)境狀況會對人們的身心健康產(chǎn)生影響。近年來關(guān)于校園土壤環(huán)境的研究集中于重金屬污染方面，空氣環(huán)境研究則主要關(guān)注微生物污染，水環(huán)境方面的研究主要關(guān)于理化指標(biāo)，如河流中的氮磷污染與富營養(yǎng)化、地表水中三氮的變化情況、雨水水質(zhì)分析等，而關(guān)于校園水體環(huán)境中微生物組成以及理化指標(biāo)對微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究相對較少。

因此研究以武漢市洪山區(qū)某高校水體作為研究對象，該校園分布著多處水體，主要包括源湖、南一樓西湖和東湖、醉晚亭西湖和東湖、東九湖以及仍在修復(fù)恢復(fù)期的湖溪河等。通過PacBi0 16S rRNA基因全長測序的方法來調(diào)查該校園水體微生物的組成結(jié)構(gòu)、豐度及多樣性，以加深對校園淡水生態(tài)系統(tǒng)的了解，為校園水體的治理和改善等措施提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)與理論參考。

1材料與方法

1.1樣本采集

根據(jù)《地表水與污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》（HJ/T 91-2002）進(jìn)行布點(diǎn)和采樣。水樣采集于2021年9月7日，采樣水體分別為源湖、南一樓湖西湖、南一樓湖東湖、醉晚亭西湖、醉晚亭東湖以及東九湖。現(xiàn)場采用便攜式儀器測量水樣的pH、溶解氧和溫度，剩余水樣保存于試劑瓶中運(yùn)回實驗室，部分樣本用于檢測化學(xué)需氧量、氨氮和總磷，剩余樣本冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2DNA提取和PCR擴(kuò)增

使用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒提取水樣中的微生物群落基因組DNA。對微生物的16SrRNA基因的V1-V9區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用的引物為27F5-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3以及1492R5-RGYTACCTTGTTACGACTT-3。使用2%的瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences， UnionCity．CA，USA）進(jìn)行回收產(chǎn)物純化。

1.3文庫構(gòu)建和測序

使用Pacific Biosciences SMRTbellTM TemplatePrep kit1.0試劑盒對擴(kuò)增子混合物進(jìn)行操作以構(gòu)建文庫，并在PacBio SequelⅡ上進(jìn)行測序。所有擴(kuò)增子測序由上海凌恩生物科技有限公司完成。測序數(shù)據(jù)以登錄號OEP003661（https：//www. biosi-no. org/node/index）保存在國家組學(xué)數(shù)據(jù)百科全書（NODE）中。

1.4文庫構(gòu)建和測序

使用SMRTLINK9.0分析軟件處理PacBio下機(jī)數(shù)據(jù)，從而獲得環(huán)形一致性CCS序列（circular con-sensus sequencing）。進(jìn)行操作分類單元OUT（Oper-ational Taxonomic Unit）聚類分析與數(shù)據(jù)統(tǒng)計。使用Mothur1.35.1計算Chao豐富度指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)，比較校園不同水體的微生物群落Alpha多樣性的差異。分別選取各樣本在門分類水平和屬分類水平上豐度最高的20個物種數(shù)據(jù)繪制組分圖。通過PCoA分析圖探討各水體微生物群落間的Beta多樣性。采用冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）進(jìn)一步探究分析環(huán)境因子對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。

2結(jié)果與分析

2.1校園各水體的基本理化性質(zhì)

實驗檢測了pH、溫度、溶解氧（DO）、化學(xué)需氧量（COD）、氨氮（NH2-N）、總磷（TP）共6項理化指標(biāo)，并且依據(jù)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB3838-2002）對各水體進(jìn)行地表水水質(zhì)評價（如表1所示）?！兜乇硭h(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中說明I類水主要適用于源頭水；Ⅱ類主要適用于集中式生活飲用水地表水源地一級保護(hù)區(qū)；Ⅲ類主要適用于集中式生活飲用水地表水源地二級保護(hù)區(qū)；Ⅳ類主要適用于一般工業(yè)用水區(qū)及人體非直接接觸的娛樂用水區(qū)；V類主要適用于農(nóng)業(yè)用水區(qū)及一般景觀要求水域。對比各項指標(biāo)可知，源湖、南一樓西湖和東湖、醉晚亭西湖湖水質(zhì)均為Ⅳ類水，醉晚亭東湖水質(zhì)達(dá)到了Ⅲ類水的要求，而東九湖水質(zhì)在V類水以下，不滿足作為景觀水體的要求。（見表1）

2.2校園水體微生物群落多樣性與物種組成分析

計算了校園6處水體的Alpha多樣性指數(shù)。南一樓西湖、南一樓東湖、源湖的Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均較高，Chao指數(shù)分別為3818.00、3750. 46、3932.00，Shannon指數(shù)為11.36、11.22和11.44。東九湖、醉晚亭西湖和醉晚亭東湖的Chao指數(shù)（分別為1239. 18、2809. 18、1951. 28）和Shannon指數(shù)（分別為9.38、9.09、8.96）均低于上述3處水。以上數(shù)據(jù)表明，南一樓西湖、南一樓東湖和源湖微生物群落的豐富度和多樣性都較高。而剩下的東九湖、醉晚亭西湖和醉晚亭東湖這3處水體的群落豐富度和多樣性則均較低。其中源湖的Chao指數(shù)和Shan-non指數(shù)最高，微生物群落的豐富度和多樣性都是最高的。Chao指數(shù)數(shù)值最低的是東九湖，具有最低的物種豐度，群落多樣性最低的水體是醉晚亭東湖，Shannon指數(shù)數(shù)值最小。

6個水體樣本中共有40個菌門，其中在門分類水平上，相對豐度排名前10的菌門如圖1（a）所示，變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacte-roidetes）和放線菌門（Actinobacteria）在6個水體樣本中均為優(yōu)勢菌門。東九湖和源湖中Proteobacteria和Bacteroidetes的豐度總和均超過了70%。但醉晚亭東湖、南一樓西湖和東湖中其余菌門的豐度總和均接近50%，醉晚亭西湖中Proteobacteria和Bacte-roidetes的豐度總和僅為33.51%，其余菌門的占比達(dá)到了66.49%。其余高豐度菌門在各樣本中的相對豐度也呈現(xiàn)出差異，藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）在醉晚亭西湖和東湖中的占比較高，分別為14.94%和15.90%，但在東九湖中僅為0.28%；其在南一樓西湖中的占比為11.94%，但在南一樓東湖中占比僅為5.78%。厚壁菌門（Firmicutes）在醉晚亭西湖中的占比為24.65%，但在源湖和醉晚亭東湖中占比較低，分別為1.2%和1.59%。醉晚亭西湖和東湖樣本相對豐度排名前5的菌門中，共有的優(yōu)勢菌門包括Proteobacteria、Cyanobacteria、Actinobacteria和浮霉菌門（Planctomycetes）；南一樓西湖和東湖樣本相對豐度排名前5的菌門中，共有的高豐度優(yōu)勢菌門包括Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes和Planctomycetes。

6個水體樣本中共含有727個菌屬，如圖1（b）所示為屬分類水平上相對豐度排名前20的菌屬。假單胞菌屬（Pseudomonas）和分支桿菌屬（Mycobacterium）為醉晚亭西湖和東湖、南一樓西湖和東湖樣本中含量較高的菌屬，Pseudomonas在4個樣本中的相對豐度分別為4.81%、27.83%、8.91%和6.54%，Mycobacte-rium的占比則分別為5.11%、8.33%、7.89%和9.39%。醉晚亭西湖中含量最高的菌屬為微小桿菌屬（Exiguobacterium），其相對豐度達(dá)到了23.11%。黃桿菌屬（Flavobacterium）在東九湖和源湖樣本中的含量較高，分別為7.64%和12.54%。萊茵海默氏菌屬（Pararheinheimera）在源湖中的含量較高，達(dá)到了8. 42%。硫酸曲菌屬（Sulfuricurvum）在東九湖樣本中的相對豐度較高，為9.87%。水體樣本中相對豐度排名前20的菌屬還包括利姆諾螺旋菌屬（Limno-spira）、中間根瘤菌屬（Mesorhizobium）、小梨形菌屬（Pirellula）、諾德拉菌屬（Nordella）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、茉莉亞菌屬（Moorea）、幾丁質(zhì)單胞菌屬（ Chitinimonas）、阿佐內(nèi)克蘇思菌屬（Azonexus）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）、新鞘氨醇菌（Novosphingobium）等。

2.3校園水體樣本間Beta多樣性分析

如圖2所示水體樣本的PCoA分析圖，結(jié)果表明醉晚亭西湖和東湖、南一樓西湖和東湖微生物的群落組成較為相似，上述4個水體樣本與東九湖、源湖樣本微生物組成的差異性較大。這說明東九湖和源湖樣本與其他4個水體樣本的物種組成具有較大差異。并且在所有水體樣本中，微生物群落結(jié)構(gòu)最相似的水體樣本是醉晚亭西湖和東湖。

采用冗余分析（RDA）探究環(huán)境因子對優(yōu)勢菌門相對豐度的作用，結(jié)果如圖3所示。源湖的菌群結(jié)構(gòu)受到環(huán)境因子NH3 -N、TP、pH的影響，南一樓西湖與醉晚亭東湖都主要受到pH、DO的影響，南一樓東湖受到環(huán)境因子COD、DO的影響，醉晚亭西湖受到COD、DO的影響，東九湖則主要受到NH3-N、TP、COD的影響。水體中的微生物群落結(jié)構(gòu)受到多種環(huán)境因子不同程度的影響，其中NH3-N、TP、DO對水體產(chǎn)生了較大影響。

3討論

水質(zhì)理化指標(biāo)評價結(jié)果顯示源湖、南一樓西湖和東湖、醉晚亭西湖和東湖的水質(zhì)均在Ⅳ類以上，只有東九湖水質(zhì)在V類以下，各個水體的DO、COD、氨氮和總磷均具有一定差別。Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果顯示，南一樓西湖、南一樓東湖和源湖微生物群落的豐富度和多樣性均較高，東九湖、醉晚亭西湖和醉晚亭東湖水體的群落豐富度和多樣性則均較低。

6個水體的微生物群落組成相似，主要由Pro-teobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Cyanobacteria等組成，其中絕大多數(shù)菌門均屬于Newton等人發(fā)現(xiàn)的21個典型淡水細(xì)菌門類。Proteobacteria、Bacte-roidetes和Actinobacteria的相對豐度均較高，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)這3個菌門均為湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌門。Bacteroidetes和Proteobacteria則是富營養(yǎng)化淡水系統(tǒng)中高豐度的微生物群落，徐超等人檢測到太湖藍(lán)藻水華暴發(fā)期間的優(yōu)勢細(xì)菌門類為Cyanobacteria、Actinobacteria和Proteobacteria，寇文伯等人發(fā)現(xiàn)鄱陽湖表層水體的菌群主要隸屬于Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria。醉晚亭西湖和東湖以及南一樓西湖的Cyanobacteria的相對豐度均較高，但東九湖中的Cyanobacteria豐度僅為0.28%。這可能是水體中氨氮和總磷含量的差異所導(dǎo)致，醉晚亭西湖和東湖、南一樓西湖中的氨氮含量均低于0.7mg/L，總磷含量低于0. 04mg/L，Cyanobacteria已被證明能夠在繁殖過程中消耗氮和磷，這表明醉晚亭西湖和東湖、南一樓西湖中的Cyanobacteria能夠有效利用水體中的氮磷實現(xiàn)豐度的增加。

屬分類水平上的分析結(jié)果顯示不同水體樣本中各菌屬的相對豐度比例差異較大，部分菌屬在某樣本中優(yōu)勢明顯，但在其余樣本中相對豐度占比極低。Pseudomonas和Mycobacterium為醉晚亭西湖和東湖、南一樓西湖和東湖樣本中含量較高的菌屬，但Mycobacterium在東九湖中的占比僅為0.51%；東九湖和源湖樣本中含量較高的菌屬是Flavobacterium，但醉晚亭東湖和南一樓西湖中的Flavobacterium相對豐度都在1.00%以下。

PCoA圖的分析結(jié)果表明醉晚亭西湖和東湖、南一樓西湖和東湖微生物的群落組成較為相似，上述4個水體樣本與東九湖、源湖樣本微生物組成的差異性較大。RDA分析表明水體的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性受到NH3 -N、TP、pH、COD、DO等環(huán)境因子的影響，其中NH3-N、TP、DO對校園水體的微生物群落產(chǎn)生了較大影響。

4結(jié)論

該校園中的源湖、南一樓西湖和東湖、醉晚亭西湖和東湖的水質(zhì)均在Ⅳ類以上，東九湖水質(zhì)在V類以下，80%的水體達(dá)到了《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中一般景觀水體的要求。不同水體微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性具有顯著差異，源湖、南一樓西湖和東湖的群落豐富度和多樣性均較高，東九湖、醉晚亭西湖和東湖水體則較低。具體表現(xiàn)為水體的菌門和菌屬的組成與豐度有所不同，呈現(xiàn)出復(fù)雜的變化情況。Be-to多樣性分析結(jié)果顯示空間距離小的水體的群落組成具有更大的相似性，醉晚亭西湖和東湖、南一樓西湖和東湖的組成相似，東九湖與源湖與上述水體群落結(jié)構(gòu)差異較大。水體群落多樣性受外界環(huán)境因素影響，總體上主要受到環(huán)境因子NH3-N、TP、DO的影響。