一株中度嗜鹽在極端條件下絮凝性質(zhì)的研究

興虹 王特 吳麗紅 安長偉

關(guān)鍵詞：微生物絮凝劑；四氫嘧啶；絮凝活性；高鹽制藥廢水

前言

微生物絮凝劑與人工合成的化學(xué)絮凝劑相比具有無毒、易生物降解、無二次污染的特點(diǎn)，在污水凈化處理領(lǐng)域顯示了較大的應(yīng)用價值。但是，微生物絮凝劑會因?yàn)楦啕}、高溫或低溫、極端pH、高濃度重金屬等不利因素而顯著降低絮凝活性，在諸如石油和天然氣生產(chǎn)、海水冷卻、皮革加工、制藥等行業(yè)廢水過程處理應(yīng)用中絮凝效率低下。提高微生物絮凝劑在極端環(huán)境下的絮凝活性的研究受到關(guān)注。

某些中度嗜鹽菌（如鹽單胞菌）能夠應(yīng)答環(huán)境某些因素（如高滲透壓）的脅迫合成滲透壓補(bǔ)償溶質(zhì)四氫嘧啶（1，4，5，6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrim-idinecar-boxylic acid）。四氫嘧啶能夠減輕熱脅迫、冷凍、干燥、高鹽、氧自由基、輻射、尿素和其他變性劑對蛋白質(zhì)、核酸、生物膜、甚至整個細(xì)胞的有害影響，對生物大分子及整個細(xì)胞具有抗逆保護(hù)作用。據(jù)報道四氫嘧啶分泌型的鹽單胞菌（Halomonas salina）在特定的條件下能夠合成并分泌四氫嘧啶，分泌至細(xì)胞外的四氫嘧啶將會對胞外大分子物質(zhì)（如多糖，蛋白質(zhì)等）具有抗逆保護(hù)作用。據(jù)此，文章擬篩選具有絮凝活性的四氫嘧啶分泌型菌株；考察該菌株微生物絮凝劑在30g/L NaCl的高嶺土懸浮液體系中的絮凝性質(zhì)；探討添加四氫嘧啶對該菌株微生物絮凝劑的抗逆保護(hù)作用；在此基礎(chǔ)上，考察該菌株微生物絮凝劑／四氫嘧啶共合成（在一個發(fā)酵過程中同時合成微生物絮凝劑和四氫嘧啶）發(fā)酵液在高鹽制藥廢水的固形物含量、色度和濁度的絮凝處理效果。

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

菌株分離樣品：采自某制藥廠污水處理池底泥。

發(fā)酵方法：菌株B01經(jīng)活化后．按1%接菌量轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基（30/300mL）中，30℃，120r/min培養(yǎng)72h。

絮凝活性測定方法：參照文獻(xiàn)[7]的分光光度計(jì)法。懸浮液：100mL0.4%（w/v）高嶺土懸浮液，NaCl濃度30g/L。用721型分光光度計(jì)在波長550nm處測定吸光值，計(jì)算絮凝率。絮凝活性用絮凝率來表示。F=（A-B）x100%，其中F為絮凝率；A對照的吸光度值；B為加入絮凝劑的吸光度值。

Ectoine濃度測定方法：參照文獻(xiàn)[8]的高效液相色譜方法。

濁度測定方法：參照國家標(biāo)準(zhǔn)（BG13200-91）的分光光度法。

色度測定方法：參照國家標(biāo)準(zhǔn)（BG11903-89）的鉑鈷比色法。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1微生物絮凝劑／四氫嘧啶共合成菌株篩選鑒定

從某制藥廠污水處理池底泥中分離篩選微生物絮凝劑／四氫嘧啶共合成菌株。菌株分離樣品按重復(fù)劃線法分離直至獲得純化的單菌落，挑選20個單菌落，培養(yǎng)菌株并進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵液在4℃，15000×g條件下離心15min，取發(fā)酵上清液測定絮凝活性及四氫嘧啶濃度。其中菌株HDM-081發(fā)酵上清液的絮凝活性和四氫嘧啶濃度最高，分別為39.7%和835.6mg/L。該菌株經(jīng)16SrDNA分析鑒定為Halomonas菌，命名為Halomonassp. strain HDM-081。Halomonassp. strain HDM-081臺旨夠在一個發(fā)酵過程中同時合成微生物絮凝劑和四氫嘧啶，二者均部分分泌至發(fā)酵液中。

2.2Halomonassp.strain HDM-081微生物絮凝劑的合成條件優(yōu)化

從Halomonassp. strain HDM-081發(fā)酵液中提取純化微生物絮凝劑，在考察的多種提取方法中，按文獻(xiàn)[3]提取產(chǎn)物的絮凝活性最高，以下絮凝劑的提取制備均按此方法進(jìn)行。考察培養(yǎng)基的碳源種類和濃度、氮源種類和濃度、pH和NaCl濃度對Halomonassp.strain HDM-081發(fā)酵合成微生物絮凝劑的影響，結(jié)果如圖1所示。將碳源分別設(shè)置為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乙酸鈉和檸檬酸鈉（以40g/L葡萄糖碳素濃度計(jì)），當(dāng)以葡萄糖作為碳源時，微生物絮凝劑合成量最高，為7.8g/L（圖1（a）），后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用葡萄糖作為碳源。調(diào)整葡萄糖濃度分別為20g/L、40g/L、60g/L和80g/L，當(dāng)葡萄糖濃度為60g/L時，微生物絮凝劑合成量最高，為9.1g/L（圖1（b）），優(yōu)化的葡萄糖濃度為60g/L。相同方法優(yōu)化氮源種類及其濃度，圖1（c）結(jié)果顯示，在氯化銨、硝酸銨、硫酸銨和硝酸鉀四種氮源中，硫酸銨作為氮源時微生物絮凝劑合成量最高，為9.1g/L；圖1（d）結(jié)果顯示，硫酸銨濃度為12.5g/L時，微生物絮凝劑合成量最高，為10.4g/L。優(yōu)化的氮源是硫酸銨，優(yōu)化氮源濃度為12.5g/L。將培養(yǎng)基初始pH分別設(shè)置為5、6、7、8和9，當(dāng)pH為7時，微生物絮凝劑合成量最高，為10.4g/L。優(yōu)化的培養(yǎng)基初始pH為7。在上述優(yōu)化好的條件下，設(shè)置培養(yǎng)基的NaCl濃度分別為30、60、90和120g/L，在NaCl濃度為60 g/L時，微生物絮凝劑合成量最高，為10.4g/L。綜上所述，Halomonassp. strain HDM-081合成微生物絮凝劑的優(yōu)化發(fā)酵條件為：60g/L葡萄糖為培養(yǎng)基碳源，12.5g/L硫酸銨為培養(yǎng)基氮源，培養(yǎng)基初始pH為7，培養(yǎng)基NaCl濃度為60g/L。在此優(yōu)化條件下，Halomonassp. strain HDM-081發(fā)酵培養(yǎng)72h合成微生物絮凝劑量為10.4g/L。

2.3Halomonassp.strain HDM-081微生物絮凝劑的絮凝性質(zhì)

測定絮凝劑在不同NaCl濃度、不同溫度、不同pH下的絮凝活性，絮凝劑添加量為0.8g/L，結(jié)果如圖2所示。將絮凝活性測定體系的溫度調(diào)整為10，20，25，30，35，40．45，50和60℃條件下，30℃～35℃時絮凝活性較高，分別為61.6%，65.3%和58.9%，當(dāng)溫度降低至10℃時絮凝活性為28.1%，當(dāng)溫度增加至60℃時絮凝活性為24.3%。最適溫度為35℃（見圖2（a》。將絮凝活性測定體系的pH調(diào)整為5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5和9條件下，pH7-8時絮凝活性較高，分別為65.3%，69.3%和64.2%。最適pH為7.5（見圖2（b））。將絮凝活性測定體系的NaCl濃度調(diào)整為0，15，30，45，60，75和90g/L條件下，NaCl濃度在0，15，30和45g/L時絮凝活性最高，分別為69.3%，70.4%，70.5%和68.4%，當(dāng)NaCl濃度增加至90g/L時絮凝活性為50.7%（為最高絮凝活性的72.1%）（見圖2（c））。該菌株在一定鹽濃度下具有最高絮凝活性，而且高濃度鹽對其影響較小。表明B01菌株的絮凝劑為耐鹽性絮凝劑。Halomonas sp.strain HDM-081微生物絮凝劑絮凝活性最高的條件是溫度為35℃，pH為7.5，NaCl濃度為30g/L。

2.4四氫嘧啶對微生物絮凝劑的抗逆保護(hù)作用

為了考察四氫嘧啶對微生物絮凝劑的抗逆保護(hù)作用，在極端條件下的絮凝活性測定體系中添加四氫嘧啶，提取純化微生物絮凝劑和四氫嘧啶的添加量分別為0.8g/L和400mg/L。極端條件下未添加及添加四氫嘧啶的微生物絮凝劑的絮凝活性如圖3所示。在100C的低溫條件下，絮凝活性由28.1%提高到56.2%，提高了99.8%。在60℃的高溫條件下，絮凝活性由21.3%提高到64.2%，提高了201.5%。在pH為5的酸性條件下，絮凝活性由32.5%提高到63%，提高了93.8%。在pH為9的堿性條件下，絮凝活性由49%提高到69.8%，提高了42.5%。在NaCl為90g/L的高鹽條件下，絮凝活性由50.7%提高到74.1%，提高了46.1%。上述實(shí)驗(yàn)表明，四氫嘧啶對微生物絮凝劑具有較顯著的抗逆保護(hù)作用。低溫、高溫、酸性、堿性和高鹽等不利條件會導(dǎo)致微生物絮凝劑大分子空間構(gòu)型的變化，因而造成絮凝活性的降低。在微生物絮凝劑中添加四氫嘧啶，會提高微生物絮凝劑大分子在逆環(huán)境中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而提高絮凝活性。

2.5微生物絮凝劑／四氫嘧啶共合成發(fā)酵液凈化處理高鹽制藥廢水

高鹽高氨氮制藥廢水是目前極難處理的廢水之一。其特點(diǎn)是廢水中鹽濃度和氨氮濃度高、廢水成分復(fù)雜、有機(jī)污染物種類多、有毒有害物質(zhì)多且有較強(qiáng)的生物抑制性。文章對某制藥廠產(chǎn)生的高鹽制藥廢水（Cl-濃度45.8g/L）進(jìn)行了凈化處理。在高鹽制藥廢水中添加微生物絮凝劑／四氫嘧啶共合成發(fā)酵液（添加量為2.5%，微生物絮凝劑濃度為0.3g/L，四氫嘧啶濃度為20.9mg/L），測定固形物含量、色度和濁度，結(jié)果如表1所示。由表1可見，固形物含量、濁度、色度的去除率分別為87.9%、77.8%和88.6%。林俊岳[10]等人研究H6菌能利用高鹽合成廢水生長微生物絮凝劑，但在0.5%～6%的鹽濃度范圍內(nèi)，隨發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液的絮凝能力均有所下降，絮凝率最高下降65.1%。研究使用的Halomonas sp.HDM - 081可以在高鹽（60g/L NaCl）下快速生長（如圖1（f）所示）并合成具有耐鹽性的微生物絮凝劑（圖2（c）），而四氫嘧啶的抗逆協(xié)助作用又使微生物絮凝劑的耐鹽性進(jìn)一步得到提升。因此Halomonas sp.HDM-081微生物絮凝劑／四氫嘧啶共合成發(fā)酵液對高鹽制藥廢水凈化處理效果顯著。

3結(jié)論

文章從污水池底泥中分離篩選的中度嗜鹽菌Halomonas sp. strain HDM-081，能夠在一個發(fā)酵過程中同時合成微生物絮凝劑和四氫嘧啶。合成微生物絮凝劑的優(yōu)化發(fā)酵條件為：60g/L葡萄糖為培養(yǎng)基碳源，12.5g/L硫酸銨為培養(yǎng)基氮源，培養(yǎng)基pH為7，培養(yǎng)基NaCl濃度為60g/L。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵培養(yǎng)72h合成微生物絮凝劑10.4g/L。微生物絮凝劑絮凝活性最高的條件為：35℃，pH為7.5，NaCl濃度為30g/L。四氫嘧啶對提取純化的微生物絮凝劑在低溫高溫、酸性堿性和高鹽環(huán)境下具有顯著的抗逆保護(hù)作用。用微生物絮凝劑／四氫嘧啶共合成發(fā)酵液凈化處理高鹽制荮廢水，固形物含量、色度、濁度的去除率分別為87.9%、77.8%、88.6%。Halomonas sp. strain HDM-081微生物絮凝劑／四氫嘧啶共合成發(fā)酵液對高鹽制藥廢水凈化處理效果顯著。