擬南芥CARK5激酶響應(yīng)脫落酸信號的研究

李柯萱 李小意 王若琳 楊毅

為了研究擬南芥脫落酸（Abscisic acid，ABA）受體的翻譯后修飾，本研究以能夠磷酸化ABA受體的激酶CARK5作為研究對象，通過構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因株系來檢測CARK5在ABA信號途徑中的功能.結(jié)果顯示： CARK5能夠促進ABA介導(dǎo)的抑制種子萌發(fā)、幼苗的形態(tài)建成以及主根的生長，但是過表達激酶失活型CARK5m（CARK5N250A）則跟突變體cark5表型類似.擬南芥中過表達CARK5增強植株抗旱性；ABA處理后，ABA響應(yīng)標記基因RAB18表達量增加.這些結(jié)果說明，CARK5通過可以磷酸化ABA受體，正調(diào)控ABA信號通路.

CARK5； 磷酸化； 脫落酸； 干旱脅迫

Q495A2023.036001

收稿日期： 2022-05-26

基金項目： 四川省國家自然科學(xué)基金（2022NSFSC0162）

作者簡介： 李柯萱（1997-）， 女， 四川自貢人， 碩士研究生， 研究方向為植物遺傳學(xué). E-mail： likexuan1312@163.com

通訊作者： 楊毅. E-mail： yangyi528@scu.edu.cn

Response of CARK5 kinase to ABA signaling in Arabidopsis

LI Ke-Xuan， LI Xiao-Yi， WANG Ruo-Lin， YANG Yi

（Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Education，? College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610065， China）

In order to explore the post-translational modification of Arabidopsis abscisic acid （ABA） receptor， this study constructed overexpressing CARK5 and kinase-dead CARK5m （CARK5N250A） in the wild type and T-DNA mutant cark5 plants by genetic and physiological assays， to analyze the functions of CARK5 in ABA signaling. The results showed that CARK5 can promote ABA-mediated inhibition of seed germination， seedling cotyledon and primary root elongation， but the overexpression kinase-inactive CARK5m （CARK5N250A） has a similar phenotype to the mutant cark5. In addition， overexpressing CARK5 enhanced plant drought resistance and ABA-marked gene RAB18 expression. Taken together， these data suggest that CARK5 positively regulates the ABA signaling pathway by phosphorylation of ABA receptors.

CARK5； Phosphorylation； Abscisic acid； Drought stress

1 引 言

植物能夠通過捕捉環(huán)境信號，然后激活植物激素介導(dǎo)的多種內(nèi)源途徑，進而影響植物從種子成熟、種子萌發(fā)到開花結(jié)果以及響應(yīng)生物或者非生物脅迫等各種生命活動［1，2］.其中脫落酸（Abscisicacid，ABA）是一種由類胡蘿卜素裂解而成的重要植物激素［3］，在植物中具有多種生理功能.ABA通過調(diào)控種子的休眠和萌發(fā)以及氣孔的開度等生理活動，來應(yīng)對干旱、高溫、高鹽等環(huán)境脅迫［4］.擬南芥響應(yīng)ABA信號通路的過程是：首先ABA受體PYR1/PYLs/RCARs（Regulatory Components of ABA Receptors/Pyrabactin Resistance/PYR like）感知ABA后，能夠抑制磷酸酶PP2C活性，激活激酶SnRK2s，使其磷酸化ABA信號通路的下游信號分子，最終響應(yīng)ABA信號.ABA受體作為ABA信號通路中的核心成員［5-7］，在擬南芥中總共有14個成員［8］.在14個成員中除了PYL13以外，其余13個都被證實能夠結(jié)合ABA.

自從ABA受體被發(fā)現(xiàn)以來，研究者也一直在研究其翻譯后修飾，其中ABA受體的磷酸化修飾在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用［9］.本實驗室前期研究篩選出能夠結(jié)合并使部分RCARs磷酸化的ABA受體激酶（Cytosolic? ABA Receptor? Kinase，CARK），該家族一共有11個成員，它們的激活環(huán)中都具有保守的天冬氨酰（N）.其中CARK1屬于擬南芥絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶RLCKⅧ亞家族，研究發(fā)現(xiàn)CARK1能夠通過結(jié)合并磷酸化RCAR3和RCAR11-14從而抑制PP2C活性，促進ABA信號通路［10，11］.除此之外，CARK3以ABA依賴的方式轉(zhuǎn)錄干擾果膠甲酯酶抑制物（PMEL）的轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)節(jié)擬南芥的花粉育性［12］.最近的研究也表明，CARK2、CARK4、CARK5、CARK7和CARK11磷酸化二聚化受體后，從而解聚，增強ABA結(jié)合能力［13］.由于CARKs在植物的生長發(fā)育以及抗逆性中的作用既存在冗余又可能有差異，所以有必要對每個成員在ABA信號途徑中的功能進行分析.因此，本研究選取能夠與RCARs相互作用的CARK5進行分析，探究其響應(yīng)ABA信號的表型和ABA下游基因的轉(zhuǎn)錄水平.

2 材料與方法

2.1 材 料

T-DNA插入突變的擬南芥種子cark5（SALK_136404）購買自網(wǎng)站擬南芥生物資源中心ABRC（http：//www.arabidopsis.org/）.野生型擬南芥（Arabidopsis thalian）為哥倫比亞野生型（Col-0）.擬南芥先播種在MS固體培養(yǎng)基（MS粉末加上2%蔗糖和0.8%的瓊脂粉）上培養(yǎng)5～7 d，等到開始長出真葉時再移栽到配置的營養(yǎng)土（蛭石∶營養(yǎng)土=1∶3混勻，并進行121 ℃高壓滅菌20 min后冷卻至室溫）.

2.2 實驗方法

2.2.1 擬南芥過表達和回補株系構(gòu)建 將目的基因構(gòu)建到pBI121載體中，回補株系用pZH01載體.構(gòu)建成功的載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，進行菌落PCR和測序檢測，確定構(gòu)建成功后將DH5α進行擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中.采用花絮侵染法［14］得到帶有卡那抗性（回補株系為利福平抗性）的T0代種子，再利用含抗性的MS平板進行篩選出能夠長出真葉的陽性株系，然后在土壤中培養(yǎng)傳代，利用孟德爾遺傳定律檢驗得到T2代株系.T2代種子再播種于相應(yīng)抗性的MS平板上，驗證純合株系.T3代種子用于表現(xiàn)分析.

2.2.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR） 將待測組織用液氮速凍后研磨，每50～100 mg組織用1 mL Trizol試劑對組織進行裂解，加入氯仿后在冰上沉淀10 min，使核蛋白復(fù)合物解離，再用異丙醇沉淀回收總 RNA.得到的總RNA后根據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，最后根據(jù)Takara熒光定量PCR酶使用說明書配制qRT-PCR反應(yīng)體系，體系及程序如表1所示，同時保證每個樣本技術(shù)重復(fù)三次，生物學(xué)重復(fù)三次.

2.2.3 ABA處理下種子萌發(fā)率統(tǒng)計 將每個株系約100顆種子春化3 d后消毒播種于含終濃度分別為0、0.3、1.0、3.0和10.0 μmol/L ABA的MS培養(yǎng)基中，置于溫室中培養(yǎng)，持續(xù)1 w，每天數(shù)萌發(fā)率.萌發(fā)率=萌發(fā)的種子數(shù)/種子的總數(shù).

2.2.4 ABA處理下幼苗形態(tài)建成實驗分析 每個株系播種約50顆種子于終濃度為0和0.3? μmol/L ABA的MS平板上，7 d后觀察它們子葉變綠情況，計算子葉變綠的比率.

2.2.5 ABA處理下根長實驗分析 每個株系擬南芥種子播種于MS平板，豎置生長2～3 d后選擇長度長勢相似的植株移植到1/2MS平板中，且加入30 μmol/L ABA.觀察它們主根伸長情況，7～8 d后拍照用imageJ軟件測量主根長度.

2.2.6 幼苗干旱及復(fù)水處理 將擬南芥種子春化后直接播種到土里，每個株系至少3盆，每兩天澆一次水，保證植物正常生長，生長兩周后，停止?jié)菜?，干?3 d后拍照記錄，再進行復(fù)水處理，連續(xù)澆水直到土壤吸水飽和，兩天后觀察植株存活率.

3 結(jié) 果

3.1 qRT-PCR鑒定CARK5轉(zhuǎn)基因株系

前期已經(jīng)從購買的種子中鑒定出cark5突變株系，然后構(gòu)建并篩選出了CARK5過表達株系OE-CARK5 #5和OE-CARK5 #31，并進行了qRT-PCR實驗進行驗證.qRT-PCR結(jié)果顯示cark5突變株系的CARK5基因表達水平幾乎未檢測到，說明該突變體為敲除突變體，用于后續(xù)分析；兩種過表達株系的CARK5表達量相比野生型都增加5倍以上（圖 1）.另外為了更好地驗證CARK5基因的功能，本實驗還構(gòu)建了cark5突變株的背景下回補CARK5激酶位點突變的株系com-CARK5m #1和com-CARK5m #9，如qRT-PCR結(jié)果所示，CARK5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對于野生型也有顯著提高（圖 1）.

3.2 ABA對CARK5轉(zhuǎn)基因株系種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成的影響

因為已有的研究表明CARK5能夠與ABA受體相互作用，所以本研究想探討它在擬南芥中是否調(diào)控ABA介導(dǎo)的種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成等生物學(xué)功能.首先進行了種子萌發(fā)實驗，結(jié)果顯示：不添加外源ABA的情況下，以及0.3 μmol/L低濃度ABA處理時，CARK5轉(zhuǎn)基因株系種子的萌發(fā)率都沒有明顯區(qū)別； 1.0 μmol/L ABA時，WT、cark5、OE-CARK5 #5、OE-CARK5 #31、com-CARK5m #1和com-CARK5m #9的萌發(fā)率分別為：40%、75%、35%、40%、54%和60%；當ABA濃度升高到3 μmol/L時，OE-CARK5 #5和OE-CARK5 #31種子幾乎不萌發(fā)，而cark5、com-CARK5m #1和com-CARK5m #9沒有顯著差異.因此，擬南芥中CARK5缺失之后，與野生型相比，對ABA的敏感程度降低，而過表達CARK5會增加植株對ABA的敏感程度.并且回補CARK5激酶活性位點突變的CARK5m到cark5株系后，com-CARK5m #1和com-CARK5m #9株系萌發(fā)率顯著高于野生型，而與cark5沒有顯著差異，都表現(xiàn)出對ABA不敏感（圖2a）.

雖然在0.3 μmol/L ABA處理下，CARK5轉(zhuǎn)基因植株的種子萌發(fā)率沒有明顯區(qū)別（圖2a），但是繼續(xù)培養(yǎng)10天后， WT、cark5、OE-CARK5 #5、OE-CARK5 #31、com-CARK5m #1和com-CARK5m #9的子葉綠化率比率分別為：8%、100%、20%、12%、94%和95%.com-CARK5m與cark5相似且都表現(xiàn)為ABA的不敏感，幼苗子葉變綠程度極高.而過表達株系與野生型都表現(xiàn)出了ABA抑制子葉變綠（圖2b）.綜上結(jié)果表明CARK5在ABA介導(dǎo)的抑制種子萌發(fā)和子葉變綠中起正調(diào)控作用.

3.3 CARK5在ABA處理下對根長伸長的影響

對CARK5轉(zhuǎn)基因株系在ABA介導(dǎo)下根伸長情況進行實驗分析.將MS培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d的幼苗轉(zhuǎn)移到不含ABA和含30 μmol/L ABA的1/2MS培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，結(jié)果如圖 3所示，在正常情況下，各株系的根長幾乎一致；而ABA處理之后，WT、cark5、OE-CARK5 #5、OE-CARK5 #31、com-CARK5m #1和com-CARK5m #9跟對照組的比較，根長分別抑制了45.8%、55.1%、31.7%、29.1%、67.4%和47.1%.過表達株系較于野生型株系對ABA敏感，突變體的主根伸長對ABA處理較不敏感，而回補激酶失活型CARK5，不能回補到野生型的表型.這些結(jié)果說明CARK5同樣依賴其激酶活性來影響ABA對根長的抑制作用.

3.4 CARK5轉(zhuǎn)基因株系對干旱脅迫的響應(yīng)

對2周大小的WT、cark5、OE- CARK5 #5、OE-CARK5 #31、com-CARK5m#1和com-CARK5m #9幼苗進行13 d的干旱處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：干旱13 d的時候，WT、cark5和com-CARK5m #1和com-CARK5m #9就已經(jīng)萎蔫了；相對而言，OE-CARK5 #5和OE-CARK5 #31脫水程度更低.復(fù)水2 d后發(fā)現(xiàn)，WT大部分幼苗恢復(fù)；而cark5、com-CARK5m #1和com-CARK5m #9的所有植株都因為脫水致死；而OE-CARK5的兩個株系都全部恢復(fù).如圖所示（圖4），所有株系在干旱處理前的長勢是一致的，因此可以得出OE-CARK5最耐旱，從而可以推斷CARK5在植物應(yīng)對干旱脅迫中起正調(diào)控作用.

3.5 ABA處理CARK5轉(zhuǎn)基因株系后調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄水平

CARK5與ABA受體能夠相互作用，因此本研究檢測了ABA信號通路中的標記基因RAB18來判斷它是否會響應(yīng)ABA信號通路.用50 μmol/L ABA處理10 d大小的WT、cark5、com-CARK5m #1、com-CARK5m #9、OE-CARK 5 #31.3 h后收樣，提取RNA，然后做qRT-PCR，檢測ABA信號響應(yīng)標記基因RAB18的相對表達量.如結(jié)果所示（圖5），ABA處理后RAB18的表達量相對于處理前都有顯著升高，其中在OE-CARK5#31中的表達量最高，在WT中次之，在cark5、com-CARK5m #1和com-CARK5m #9株系中最低，并且處理后它們都與野生型存在顯著性差異.因此，CARK5能促進ABA下游響應(yīng)基因的表達，相反，CARK5m不能激活A(yù)BA信號通路.

4 討 論

ABA受體的磷酸化是一種由不同的激酶引起的翻譯后修飾.例如，TOR磷酸化ABA受體PYL4（RCAR10），終止ABA信號來平衡植物的生長和抗逆性［15］.AEL酪蛋白激酶通過磷酸化136和182的絲氨酸來破壞ABA受體PYL1（RCAR12）的穩(wěn)定性，進而抑制植物對ABA的響應(yīng)，導(dǎo)致擬南芥應(yīng)對干旱脅迫的能力減弱［16］.而本實驗室前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CARK1磷酸化RCAR3、RCAR11抑制了PP2C活性，正向調(diào)節(jié)ABA信號，所以過表達CARK1能夠顯著提高擬南芥的抗旱性［11］. 已有研究表明CARKs偏好于與ABA受體亞家族III的成員相互作用，在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起冗余作用.有趣的是，CARK1、CARK4和CARK5與RCAR3相互作用，而CARK2、CARK7和CARK11不能［13］.這種差異可能是因為CARK基因是從共同的祖先基因復(fù)制而來的，并且在植物多樣化的過程中發(fā)生功能分化［17］. 例如，蛋白激酶AEL磷酸化ABA受體，從而降低其穩(wěn)定性，抑制ABA信號通路.說明不同的激酶與ABA受體存在相互作用，并且能夠磷酸化ABA受體家族不同的基因以及不同的位點，發(fā)生不同的ABA響應(yīng).CARK5與ABA受體RCAR3、RCAR11、RCAR12、RCAR13和RCAR14有相互作用，并且能磷酸化RCAR11、RCAR12、RCAR13和RCAR14［13］.但是CARK5在植物生長發(fā)育中具體表型還不明確，所以本研究在CARK5已有的分子研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建CARK5相關(guān)轉(zhuǎn)基因株系，進一步探討CARK5對幼苗響應(yīng)ABA在種子萌發(fā)和形態(tài)建成上的影響、成苗響應(yīng)干旱的影響以及對下游基因表達的影響.

對CARK5的轉(zhuǎn)基因株系的功能進行分析表明：CARK5能抑制種子的萌發(fā)、幼苗的形態(tài)建成以及主根的生長.磷酸激酶活性位點突變的com-CARK5m株系雖然mRNA的表達量仍然較高，但是卻影響了CARK5的功能，再次說明CARK5通過磷酸化ABA受體來發(fā)揮作用，進而影響擬南芥生長發(fā)育.那么CARK5是如何與特定的ABA受體作用的呢？前面提到CARK5和CARK1一樣都能夠與RCAR3相互作用，已有研究表明CARK1磷酸化ABA受體后，改變了它們的結(jié)構(gòu)，可能使它們更容易與ABA結(jié)合，特別是單體的狀態(tài)的RCARs，例如RCAR3;同時也可能導(dǎo)致本來是同源二聚體態(tài)的RCARs成為單體，從而暴露了結(jié)合PP2Cs的loop［18］，所以CARK5很可能與CARK1有同樣的作用機制，是否存在差異還需要進一步研究.

為了研究CARK5在非生物脅迫中的功能，對CARK5相關(guān)轉(zhuǎn)基因株系進行干旱處理，結(jié)果表明它們在調(diào)節(jié)干旱脅迫中起正調(diào)控的作用.并且過表達CARK5能夠使ABA誘導(dǎo)表達的下游標記基因RAB18顯著升高，說明CARK5磷酸化ABA受體后，提高RAB18轉(zhuǎn)錄水平，從而促進ABA信號通路，進而提高植物耐旱性.但CARK5是如何受ABA調(diào)控來影響ABA受體RCARs的磷酸化還需要繼續(xù)研究.因此需要進一步研究ABA是否誘導(dǎo)了CARKs的表達，使RCARs被磷酸化的比例增加或者結(jié)構(gòu)改變，從而促進ABA信號通路，或者是RCARs被磷酸化后，進一步引起ABA信號通路中其它蛋白結(jié)構(gòu)的改變進而影響ABA響應(yīng)，所以還需要進行更多實驗來進行驗證.CARK5在ABA信號途徑中功能的分析，有助于理解植物抗逆機理.

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引用本文格式：

中 文：? 李柯萱， 李小意， 王若琳， 等. 擬南芥CARK5激酶響應(yīng)脫落酸信號的研究［J］. 四川大學(xué)學(xué)報：? 自然科學(xué)版， 2023， 60：? 036001.

英 文：? Li K X， Li X Y， Wang R L， et al. Response of CARK5 kinase to ABA signaling in Arabidopsis ［J］. J Sichuan Univ：? Nat Sci Ed， 2023， 60：? 036001.