叢枝菌根真菌和不同形態(tài)氮對杉木幼苗根際土壤氮磷養(yǎng)分含量及其相關(guān)酶化學(xué)計量比的影響

雷梅　甘子瑩　譚世廣等

關(guān)鍵詞：叢枝菌根真菌；不同形態(tài)氮；根際土壤；酶活性；酶化學(xué)計量；杉木

中圖分類號：S791.27；S718.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-1498（2023）01-0059-09

叢枝菌根真菌（AMF）作為陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的微生物，能與陸地上80%的植物形成互惠共生體。前人研究發(fā)現(xiàn)，AMF在生態(tài)環(huán)境中不僅能提高植株對養(yǎng)分的吸收，促進(jìn)植株生長，而且對植株根際土壤中的養(yǎng)分循環(huán)和土壤肥力起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，AMF通過提高根際土壤酸性磷酸酶（AP）、脲酶（URE）和蛋白酶（PRO）的活性來提高土壤中的N、P養(yǎng)分含量。然而，對于AMF主要調(diào)節(jié)了土壤中可利用N、P含量，還是對總量也有影響以及AMF對N和P的調(diào)節(jié)程度是否一致仍還有很多爭議。有研究表明，AMF可以提高根際土壤有效N、P含量，降低了土壤總N、P含量；但也有研究發(fā)現(xiàn)，AMF提高了土壤中總N含量，降低了土壤有效N含量。還有一些研究認(rèn)為，AMF對N、P的調(diào)節(jié)程度存在差異，導(dǎo)致土壤N：P比在接種AMF后出現(xiàn)較大改變。如AMF接種降低了狗尾草（Setaria viridis （L.）Beauv.）根際土壤的N：P比，而AMF接種提高了桑苗（Morus a/ba L.）根際土壤的N：P比。由此可見，AMF接種對土壤有效N、P含量及N、P總量、土壤N：P比存在怎樣的影響？這種影響是否與N、P相關(guān)轉(zhuǎn)化酶活性或其化學(xué)計量比有關(guān)仍不清楚。

N素是陸地生態(tài)系統(tǒng)中三大營養(yǎng)元素之一，對植物的生長起著至關(guān)重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，施N能提高土壤酸性磷酸酶（AP）活性。也有研究發(fā)現(xiàn)，施N提高了土壤中總N、有效N含量，但降低了總P、有效P含量，提高土壤N：P化學(xué)計量比，加劇土壤P限制；但植株接種AMF后，N肥的添加能夠促進(jìn)其對N、P養(yǎng)分的吸收，從而降低土壤總N含量和N：P化學(xué)計量比，緩解土壤P限制。部分研究發(fā)現(xiàn)，N添加顯著提高了AMF接種植物根際土壤有效N、P含量及土壤AP和N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶（NAG）活性；但是不同形態(tài)氮對土壤氮磷轉(zhuǎn)化酶的影響存在差異。有研究發(fā)現(xiàn)，植株添加NH₄⁺-N后，對根際微生物酶活性產(chǎn)生一定的毒害，導(dǎo)致各種N相關(guān)酶活性降低；而也有研究發(fā)現(xiàn)，相對于NO₃^--N添加，NH₄⁺-N添加更容易導(dǎo)致土壤酸化，從而提高了土壤AP活性。雖然關(guān)于N添加對土壤N、P含量以及相關(guān)酶活性的化學(xué)計量比研究較多，但主要集中在施加單一形態(tài)N和N施加量上，關(guān)于AMF接種與不同形態(tài)N共同作用下會對土壤N、P含量和N、P相關(guān)酶活性及其化學(xué)計量比產(chǎn)生怎樣的影響？何種氮肥添加下更有利于AMF提高土壤N、P有效性有待進(jìn)一步研究。

杉木（Cunninghamia lanceolata （Lamb.）Hook.）是我國亞熱帶地區(qū)主要的人工樹種之一，面積達(dá)1096萬hm²，約占人工林面積的21.35%。杉木不僅面積范圍廣，還是AMF重要的宿主植物。前人研究表明，在亞熱帶地區(qū)N仍是杉木生長的主要限制性因素之一。目前，已有大量研究報道AMF與N添加對杉木生長與養(yǎng)分吸收的影響，但鮮有關(guān)于AMF與不同形態(tài)N添加對杉木根際土壤N、P養(yǎng)分含量、相關(guān)酶活性及化學(xué)計量比的研究報道。

鑒于此，本研究以1年生杉木幼苗為對象，通過向杉木接種AMF并添加不同形態(tài)N（NH₄⁺-N、NO₃^-N）來研究AMF與不同形態(tài)N對杉木根際土壤N、P含量和N、P相關(guān)酶活性以及化學(xué)計量比的影響。其研究結(jié)果有利于明確AMF接種與不同形態(tài)氮共同作用下對杉木根際土壤N、P的調(diào)節(jié)作用，為杉木人工林的可持續(xù)經(jīng)營管理提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。

1試驗材料

1.1土壤

土壤取自福建農(nóng)林大學(xué)南平校區(qū)西芹教學(xué)林場杉木人工林0～20 cm的表層土。將土壤過2 mm篩后放到121℃高壓滅菌鍋中滅菌2h備用。滅菌土壤銨態(tài)氮含量4.1mg·kg^-1，硝態(tài)氮含量12.21mg·kg^-1，總碳含量13.75g·kg^-1，總氮含量1.09g·kg^-1，全磷含量0.42g·kg^-1，有效磷含量12.68mg·kg^-1，pH值4.5。

1.2菌種

本試驗以摩西球囊霉（G.mosseae，Gm）為供試菌種，購買自北京農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所。選用玉米（Zea mays L.）為此次實驗的擴(kuò)繁宿主植物，玉米種子經(jīng)10%NaCIO消毒15 min，用無菌水（冷水經(jīng)高溫殺菌后冷卻）沖洗5次。用上述滅菌土壤種植玉米并接種AMF。90d后收獲玉米，去除玉米的地上部分，將盆中的所有混合物作為接種劑。

1.3植株

杉木種子滅菌處理同玉米種子，備用。

2研究方法

2.1試驗設(shè)計

本試驗共設(shè)置6種處理，為2種AMF菌種處理（接種AMF（簡稱+M）與未接種AMF（簡稱-M》分別與3種不同形態(tài)氮添加處理（不施肥（簡稱CK）、施NH₄⁺-N（簡稱NH₄）、施N₃^--N（簡稱NO₃），每個處理4個重復(fù)。2020年5月給每個花盆（花盆底直徑30 cm，高20 cm）中裝入滅菌土壤6 kg，在每個花盆距離土壤表層10 cm的地方放置500 g的接種劑，對照為加入等量的滅菌處理土壤。在每個花盆中隨機(jī)播種3粒杉木種子，出苗后進(jìn)行疏苗，每盆留1株長勢相當(dāng)?shù)挠酌?。杉木出?個月后（2020年9月）開始添加N肥（（NH₄）₂SO₄和KNO₃），N的添加量為6mg·盆^-1。之后在2020年11月又進(jìn)行了1次N肥添加，添加量與前一次相當(dāng)。在整個試驗期間將土壤水分含量保持在田間持水量的60%。

2.2樣品采集與試驗指標(biāo)測定

2.2.1樣品采集 培養(yǎng)結(jié)束后，去除土壤表層，采用抖落法收集杉木根際土，并在實驗室中將根際土中的根系去除，過2 mm篩，分2份保存。一份存于4℃冰箱，用于土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、可溶性有機(jī)氮含量及酸性磷酸酶（AP）、脲酶（URE）、酸性蛋白酶（PRO）、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（NAG）活性的測定；一份進(jìn)行風(fēng)干研磨，用于土壤全磷、有效磷、全氮的測定。收集一部分植株根系，存于4℃的冰箱中，用于植株根系叢枝菌根真菌侵染率的測定。隨后將植株的剩下部分先用105℃的烘箱殺青，再烘干至恒質(zhì)量并研磨，用于植株氮磷的測定。

2.2.2植物樣品測定 根系侵染率采用醋酸墨水染色法檢測；植株磷采用快速消煮-鉬銻抗顯色法，隨后在分光光度計上進(jìn)行測定；植株氮用元素分析儀（Elementarvario，德國）進(jìn)行測定。

2.2.3土壤樣品測定 全氮用元素分析儀（Elementarvario，德國）進(jìn)行測試；全磷測定以行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LY/T. 1999-11-01為準(zhǔn)，采用酸溶·鉬銻抗比色法，最后用分光光度計檢測；有效磷以行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LY/T 1233-1999為準(zhǔn)，采用碳酸氫鈉浸提.鉬銻抗比色法，最后用分光光度計檢測；銨態(tài)氮與硝態(tài)氮取鮮土于2mol·L^-1KCI溶液中浸提，隨后過濾，取過濾液于全自動間斷化學(xué)分析儀（SmartChem，意大利）中測定。AP、URE、PRO、NAG活性的測定用雙抗體夾心法，在酶標(biāo)儀（Labsystems Mulitiskab MS，芬蘭）352型進(jìn)行測定。

可溶性有機(jī)氮=可溶性總氮-礦質(zhì)氮。

2.3數(shù)據(jù)分析

利用Exce12010對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用orgin2019建庫作圖。利用SPSS25.0統(tǒng)計軟件的獨(dú)立樣本T檢驗對接種AMF與未接種AMF處理下的測試指標(biāo)平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。同一接種且不同施肥處理的統(tǒng)計分析用單因素方差分析中的鄧肯檢驗比較樣品間的差異顯著性，顯著性水平=0.05。

3結(jié)果與分析

3.1 AMF接種與不同形態(tài)氮添加對杉木根系侵染及氮磷吸收的影響

表1顯示：AMF接種對杉木根系侵染率、植株氮與磷吸收存在明顯的影響，而不同形態(tài)氮及其與AMF之間的交互作用對上述3個指標(biāo)無明顯影響。杉木接種AMF后的侵染率在60%左右，說明杉木與AMF形成良好的菌根共生體。此外，在未接種AMF的杉木根系中發(fā)現(xiàn)5%左右的侵染率，這是可接受的菌根侵染污染范圍。杉木接種AMF后顯著提高了植株對N、P的吸收（CK處理下P除外）（p<0.05），其中，植物N吸收量在CK、NH₄⁺-N和N₃^--N處理下分別增加59%±13%、116%±46%、23% +19%；植株P(guān)吸收量在添加NH₄⁺-N和N₃^--N處理下分別增加40%±20%、28% +14%。

3.2 AMF接種與不同形態(tài)氮添加對土壤全P和有效P的影響

圖1顯示：不同形態(tài)氮添加與AMF之間的交互作用對土壤全磷和有效磷沒有顯著影響。對土壤全P而言，接種AMF在一定程度上都降低了各處理下土壤全P的含量（p<0.05），且N₃^--N添加下土壤全P下降27%±1%.NH₄⁺-N處理下降10%±1%（圖1a）。對土壤有效P而言，接種AMF顯著提高了各處理下土壤有效P的含量（圖1b）（p<0.05），其中，CK、NH₄⁺-N以及NO₃¹-N處理下有效P含量分別增加53%±40%、39%±10%和69%±25%，NO₃^--N處理下有效P的提升幅度顯著高于NH₄⁺-N處理。

3.3 AMF接種與不同形態(tài)氮添加對土壤氮素的影響

表2顯示：接種AMF、不同形態(tài)氮添加及二者的交互作用對土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮均有顯著影響，而不同形態(tài)氮添加對全N有影響，但對可溶性有機(jī)氮（DON）沒有影響。與對照相比，氮添加顯著提高了接種與未接種AMF杉木土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量，而且NH₄⁺-N的添加對土壤銨態(tài)氮含量的提升作用強(qiáng)于硝態(tài)氮，而NO₃^--N添加對土壤硝態(tài)氮含量的提升作用明顯強(qiáng)于銨態(tài)氮（表2）（p<0.05）。與未接種AMF相比，杉木接種AMF使CK處理中全N含量下降了7%±2%；NO₃^--N處理下，硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和DON的含量分別下降36%±3%、36%±3%、68%±11%；NH₄⁺-N處理下，銨態(tài)氮和DON含量下降幅度為29%±5%與52%±10%；土壤銨態(tài)氮在NO₃^--N處理下的降幅顯著高于NH₄⁺-N處理（表2）。

3.4 AMF接種與不同形態(tài)氮添加對土壤酶活性的影響

圖2顯示：接種AMF與不同形態(tài)氮添加及二者的交互作用對AP、URE、PRO和NAG有顯著影響（AMF接種與不同形態(tài)氮添加對AP、NAG的交互作用除外）。與對照相比，氮添加顯著提高了土壤PRO活性，但添加NH₄⁺-N處理顯著降低了土壤NAG的活性（p<0.05）。接種AMF顯著提高了各處理下AP、URE（CK除外）和NAG的活性（圖2），其中，NO₃^--N處理對NAG活性的促進(jìn)作用（22%±6%）高于NH₄⁺-N處理（10%±2%），而NH₄⁺-N處理對URE的促進(jìn)作用（23%±23%）高于NO₃^--N處理（8%±12%）。

3.5 AMF接種與不同形態(tài)氮添加對土壤氮磷比以及相關(guān)酶化學(xué)計量比的影響

圖3表明：接種AMF與不同形態(tài)氮添加對URE：AP、PRO：AP、NAG：AP存在顯著影響，且二者的交互作用對URE：AP和NAG：AP存在顯著影響。不同接種處理和不同氮添加處理對根際土壤N：P比雖沒有顯著影響，但略微提高了土壤的N：P比。與未接種AMF相比，杉木接種AMF后普遍降低了土壤URE：AP、PRO：AP及NAG：AP的比值，其下降幅度分別為-2%～16%、17%～24%、2%～15%（圖3）；但不同形態(tài)氮添加對于不同土壤酶的化學(xué)計量比的下降幅度具有差異性，NO₃^--N處理下URE：AP和PRO：AP的下降幅度（分別為10%±3%和21%±4%）均高于NH4+-N處理（-2%±0.2%、17%±2%），而NH₄⁺-N處理下NAG：AP下降幅度（9%±5%）高于NO₃^--N處理（2%±2%）。

4討論

4.1 AMF接種與不同形態(tài)氮添加對土壤P含量及其相關(guān)酶活性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，杉木接種AMF后土壤有效P在根際富集，根際土壤AP活性顯著提高，而土壤全P含量則降低（圖1），這一研究結(jié)果與宰學(xué)明等的研究結(jié)果一致。本研究中，杉木接種AMF后提高了根際土壤中AP活性，可能是因為供試土壤來自亞熱帶地區(qū)，該地區(qū)土壤通常被認(rèn)為受P限制，接種AMF促進(jìn)土壤微生物分泌AP以緩解P限制。土壤AP可以促進(jìn)有機(jī)P礦化，從而提高土壤有效P含量，土壤總P降低可能是AMF擴(kuò)大植株根系，促進(jìn)植物對P的吸收（表1），導(dǎo)致土壤中部分P向植物體內(nèi)轉(zhuǎn)移。此外，AMF菌絲與植株根系能分泌有機(jī)酸酸化根際環(huán)境，從而促進(jìn)土壤中難溶性磷酸鹽（Ca10-P和O-P）的活化，并向有效態(tài)P轉(zhuǎn)化。

Yang等研究認(rèn)為，N添加會引起土壤酸化，從而加速P素的礦化以彌補(bǔ)無機(jī)P的不足，且磷酸酶是一種含N量很高的酶，N輸入刺激了微生物獲取更多的N元素并轉(zhuǎn)給磷酸酶，從而促進(jìn)有效P的增加。前人研究發(fā)現(xiàn)，在施肥初期相對于NO₃^--N，NH₄⁺-N處理更有利于提高土壤有效P含量，而在本研究中，杉木接種AMF后添加NO₃^--N下土壤有效P上升幅度高于NH₄⁺-N處理。這可能是由于杉木幼苗接種AMF后根際土壤中的微生物對NO₃^--N具有吸收偏好，土壤中NO₃^--N的增加為土壤微生物合成高N含量的磷酸酶提供了豐富的N源，使得土壤酸性磷酸酶活性也隨之增加。因此，NO₃^--N處理下有效P的上升幅度高于NH₄⁺-N處理。

4.2 AMF接種與不同形態(tài)氮添加對土壤N含量及其相關(guān)酶活性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，NH₄⁺-N和NO₃^--N的施加提高了接種與未接種AMF杉木根際土壤全N含量，表明N肥的添加有利于根際土壤全N的積累。然而，與未接種AMF相比，接種AMF在一定程度下降低了不同處理下杉木根際土壤中的NH₄⁺-N和NO₃^--N含量（其中NH₄⁺-N處理下銨態(tài)氮含量以及NO₃^--N處理下硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量顯著下降）（表2）。前人也有類似的研究結(jié)果，這是因為AMF能促進(jìn)杉木對N的吸收（表1），且杉木主要吸收土壤中的NH₄⁺-N和NO₃^--N，故AMF降低杉木根際土壤中無機(jī)N的累積。本研究中，杉木接種AMF并施N肥后，根際土壤中的DON相對于未接種顯著下降，這可能是因為AMF能提高土壤中N相關(guān)轉(zhuǎn)化酶的活性（圖2），而N相關(guān)轉(zhuǎn)化酶能促進(jìn)有機(jī)N的礦化，從而減少土壤中DON的含量。

在本研究中，接種AMF提高了杉木根際土壤URE和NAG活性（圖2）。這是因為AMF的菌絲體以及根滲出液對土壤微生物產(chǎn)生積極影響，從而對養(yǎng)分代謝產(chǎn)生促進(jìn)作用，并增強(qiáng)了土壤酶活性；但接種AMF后不同形態(tài)氮添加對不同土壤酶活性的影響具有差異性，添加NH₄⁺-N和NO₃^--N后PRO活性顯著高于CK（圖2），這與張雪等和馬宗斌等結(jié)果相似。張藝等認(rèn)為，N肥的添加緩解土壤有效N的限制，植物獲取N素增加，提高了土壤中PRO的活性。本研究中，杉木接種AMF后，NO₃^--N處理下NAG活性增幅最大，NH₄⁺-N處理下URE活性增幅最大（圖2）。說明NH₄⁺-N更有利于提高URE活性，NO₃^--N更有利于提高NAG活性。NH₄⁺-N和NO₃^--N對不同酶活性具有不同影響的原因可能是不同N形態(tài)對分泌不同氮轉(zhuǎn)化酶微生物的影響不同所致，因為微生物對不同形態(tài)N也存在吸收偏好。

4.3 AMF接種與不同形態(tài)氮添加對土壤N：P比及其酶化學(xué)計量比的影響

本研究中，與未接種AMF相比，杉木接種AMF后適度的提高了杉木根際土壤的N：P比，這是因為接種AMF對土壤全N影響不明顯，但卻顯著降低了土壤全P含量，從而導(dǎo)致土壤中N：P比提高。這表明AMF對土壤全P的調(diào)節(jié)作用明顯強(qiáng)于土壤全N。從土壤N、P元素相關(guān)酶活性的化學(xué)計量比看，雖然接種AMF顯著提高了土壤AP、URE、NAG活性（圖2），但接種AMF普遍降低了URE：AP、PRO：AP和NAG：AP的化學(xué)計量比（圖3），這表明AMF對土壤AP的促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于氮相關(guān)轉(zhuǎn)化酶。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能在于供試土壤取自亞熱帶紅壤地區(qū)，該地區(qū)土壤脫硅富鋁鐵化嚴(yán)重，導(dǎo)致土壤受P的限制明顯強(qiáng)于N限制，而接種AMF有利于緩解土壤P的限制，維持土壤N、P平衡。此外，NO₃^--N處理下URE：AP、PRO：AP的下降幅度均高于NH₄⁺-N處理。這表明，相對于添加NH₄⁺-N，NO₃^--N更有利于通過調(diào)節(jié)土壤氮磷轉(zhuǎn)化酶的活性及其化學(xué)計量比來維持土壤N、P平衡。

5結(jié)論

接種AMF有利于提高土壤有效P含量，降低土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、DON、全P含量，NO₃^--N處理下有效P含量增加幅度高于NH₄⁺-N處理，但土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量在NO₃^--N處理下的下降幅度高于NH₄⁺-N處理；接種AMF與不同形態(tài)N添加提高了土壤中URE、AP和NAG活性，但降低了土壤中URE：AP、PRO：AP和NAG：AP的化學(xué)計量比，其中，在NO₃^--N處理下土壤中URE：AP、PRO：AP的化學(xué)計量比的下降幅度高于NH₄⁺-N處理，說明AMF對土壤AP的促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于氮相關(guān)轉(zhuǎn)化酶。本研究表明，在亞熱帶地區(qū)特殊的生態(tài)環(huán)境中，杉木接種AMF有利于通過提高土壤氮磷轉(zhuǎn)化酶活性和改變氮磷轉(zhuǎn)化酶化學(xué)計量比來調(diào)節(jié)土壤氮磷含量，維持土壤氮磷平衡，且NO₃^--N處理下的調(diào)節(jié)效果強(qiáng)于NH₄⁺-N處理。為了促進(jìn)該地區(qū)土壤環(huán)境的氮磷良性循環(huán)，既要保護(hù)當(dāng)?shù)厣寄局幸汛嬖诘腁MF，且NO₃^--N肥的施用效果更優(yōu)。