一種小鼠背根神經(jīng)節(jié)原代神經(jīng)元細(xì)胞分離與培養(yǎng)的優(yōu)化方法

張皞晟 王培民

【摘要】 目的 探索一種可以大量快速培養(yǎng)活力好且衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞污染少的原代神經(jīng)元細(xì)胞的方法。方法 混合酶溶液消化體式顯微鏡下提取的背根神經(jīng)節(jié)（DRG），隨后接種于纖維連接蛋白提前包被的培養(yǎng)皿中，8 h后更換含5-氟尿嘧啶的維持培養(yǎng)基，抑制非神經(jīng)元細(xì)胞增殖。結(jié)果 分離培養(yǎng)的感覺神經(jīng)元細(xì)胞在培養(yǎng)過程中可維持15 d左右，部分細(xì)胞可維持更長時間。原代細(xì)胞于第3天即可觀察到交錯的軸突網(wǎng)絡(luò)，接種細(xì)胞密度大，衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞污染情況少，細(xì)胞在7 d之內(nèi)可投入使用，操作者經(jīng)短時間訓(xùn)練后即可快速掌握方法。結(jié)論 新方法在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，可獲取較多數(shù)量細(xì)胞活性好、純度高的原代神經(jīng)元細(xì)胞，相較傳統(tǒng)方法具有可操作性高，重復(fù)率高的優(yōu)勢。

【關(guān)鍵詞】 背根神經(jīng)節(jié)；神經(jīng)元細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；TRPA1

【中圖分類號】 Q813.1+1；R651 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】 1672-7770（2023）02-0189-06

Abstract：Objective To explore a method that can rapidly cultivate a large number of primary neurons with good vitality and less pollution of satellite glial cells. Methods Dorsal root ganglion（DRG） extracted under microscope was digested with mixed enzyme solution， and then inoculated into fibronectin coated culture dish. After 8 hours， the maintenance medium containing 5-fluorouracil was changed to inhibit the proliferation of non-neuronal cells. Results The isolated and cultured sensory neuron cells could last for about 15 days， and some of them could last longer. On the third day， the primary cells could observe the crisscross axon network. The density of the inoculated cells was high， and the pollution of satellite glial cells was less. The cells could be put into use within 7 days. The operator could quickly master the method after a short period of training. Conclusions The new method is improved on the basis of the traditional method， which can obtain a large number of primary neurons with good cell activity and high purity. Compared with the traditional method， the new method has the advantages of high operability and high repetition rate.

Key words： dorsal root ganglion； neuron cell； cell culture； TRPA1

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82074460）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20201501）

作者單位：210022 南京，南京大學(xué)現(xiàn)代生物研究院（張皞晟）；南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科（王培民）

通信作者：王培民

原代背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）感覺神經(jīng)元被廣泛運(yùn)用于瘙癢［1］、疼痛［2］、神經(jīng)損傷［3］、神經(jīng)再生、細(xì)胞間相互作用［4］以及軸突運(yùn)輸?shù)确矫娴难芯恐?。因此原代DRG感覺神經(jīng)元細(xì)胞的提取及培養(yǎng)，為識別新的藥物分子靶標(biāo)、基因功能、代謝差異等提供了材料［5-6］，然而如何有效且快速地提取培養(yǎng)原代DRG神經(jīng)元細(xì)胞仍是難題。小鼠DRG原代培養(yǎng)方法多種多樣，早期使用小鼠胚胎作為提取DRG感覺神經(jīng)元的材料，操作難度大、耗時較長，長時間的手術(shù)操作增加了污染風(fēng)險，體式顯微鏡下DRG提取難度極大，難以批量提取，所用試劑材料較多，耗費(fèi)較大，耗時也較長［7］。近兩年的研究中提出，使用馬血清替代胎牛血清，從而抑制非神經(jīng)元細(xì)胞增殖，但神經(jīng)元的功能與神經(jīng)元軸突分叉與再生長關(guān)聯(lián)較小，無血清也可滿足神經(jīng)細(xì)胞再生需求［8］；但成纖維細(xì)胞與衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞的存在對神經(jīng)元生長影響較大。因此，在不影響神經(jīng)元活性，盡可能減少衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞或成纖維細(xì)胞污染［9］的前提下，快速、大量地提取原代DRG感覺神經(jīng)元細(xì)胞，減少實(shí)驗(yàn)所需的花銷，保證足夠密度和數(shù)量的神經(jīng)元細(xì)胞，是后續(xù)實(shí)驗(yàn)成功的前提。在過去的基礎(chǔ)上，本研究比較并改良了原代DRG神經(jīng)元的提取方法，依據(jù)此方法，在多脊柱水平培養(yǎng)了DRG內(nèi)的感覺神經(jīng)元細(xì)胞，并降低了實(shí)驗(yàn)的操作難度及時間。培養(yǎng)的原代神經(jīng)元細(xì)胞，可以作為功能和遺傳學(xué)研究的工具來驗(yàn)證在動物模型中的分子靶點(diǎn)。通過膜片鉗記錄、鈣離子成像、免疫組化、基因敲除和病毒基因轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)方法，可以更準(zhǔn)確地描述感覺神經(jīng)元的基本生理特性［10］。這些方法可以幫助研究新的靶受體或通道、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞間信號傳遞等［11］。通過微陣列測序、RNA和全基因組測序等先進(jìn)方法，利用全神經(jīng)節(jié)或原代神經(jīng)元幫助識別小鼠慢性疼痛和瘙癢的生物標(biāo)志物已獲得一定的成效［12］。此外，原代培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元細(xì)胞具有新的治療干預(yù)包括基因治療和細(xì)胞活動的光遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)操作的潛力，可應(yīng)用于疼痛性疾?。?3］、神經(jīng)退行性疾?。?4］的病理生理及治療研究，為特異性藥物的研究及運(yùn)用提供研究目標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 材料 12只C57BL/6小鼠，雌雄不限，8周左右，體質(zhì)量約20～30 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。使用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行動物分組，分為舊方法組與新方法組。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑藥品 MEM-ALPHA培養(yǎng)基（BI，01-042-1ACS）；青霉素-鏈霉素溶液（HyCLone，SV30031）；35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（Nest，706001）；Collagenase Type I powder（Thermo，17100-017）；人血漿纖維連蛋白（fibronectin human plasma，Sigma，F(xiàn)0895-1MG）；脫氧尿嘧啶核苷（5-Fluoro-2′-deoxyuridine，Sigma， F0503-100MG）；分散酶（源葉生物，S25046-1g）；胎牛血清（FBS）（Gibco）；βⅢ-tubulin抗體（Sigma）；GFAP抗體（Sigma）；熒光二抗（anti-rabbit）；熒光二抗（anti-mouse）；曲拉通X-100（Triton X-100）；DAPI；多聚甲醛；PBS；ddH2O；QuickBlock免疫染色一抗稀釋液；QuickBlock免疫染色封閉液；免疫熒光染色二抗稀釋液；抗熒光淬滅封片液；TRPA1抗體（Affinity Biosciences）；TRPV4抗體（Affinity Biosciences）；TRPM8抗體（Affinity Biosciences）；tau抗體（Affinity Biosciences），synapsin抗體（Affinity Biosciences）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)所用主要儀器 CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱；體視顯微鏡；200目細(xì)胞篩；倒置式顯微鏡；熒光顯微鏡；眼科顯微鑷子（尖端有齒）；普通不銹鋼剪刀；顯微角膜剪直剪或彎剪（11.5 cm）；普通剪刀；鑷子；培養(yǎng)皿；流式細(xì)胞儀；HCA（Operetta， Perkinelmer，PE）。

1.2.3 用于提取與培養(yǎng)的試劑配置 （1）提取培養(yǎng)基：MEM-ALPHA培養(yǎng)基+2%血清，分裝為1 mL溶液并儲存在2 mL離心管中，全程置于冰上；（2）混合消化酶：I型膠原酶+分散酶（消化酶與分散酶各取100 mg溶于1 mL PBS或培養(yǎng)基內(nèi)制成母液，母液濃度為100 mg/mL，使用時稀釋成工作液，濃度為5 mg/mL），1 mL工作液裝在2 mL離心管置于冰上，分裝工作液在-20 ℃保存時間不多于3個月；（3）完全培養(yǎng)基：MEM-ALPHA培養(yǎng)基+10%FBS+1%雙抗；（4）Fibronectin：母液濃度為1 mg/mL，工作液：取20 uL溶于1 mL ddH2O；（5）5-Fluoro 1.5 mg/mL，取1 mL溶于100 mL ddH2O；（6）換液培養(yǎng)基：MEM-ALPHA培養(yǎng)基+5%FBS+1%雙抗+1% 5-Fluoro。

1.3 方法 小鼠DRG原代神經(jīng)元的提取與培養(yǎng)，擬使用兩種方法提取原代DRG神經(jīng)元細(xì)胞。方法一參考任旺等的研究［7］，改良方法如下。

1.3.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 在培養(yǎng)皿中滴加1 mL Fibronectin溶液提前包被培養(yǎng)皿，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中浸泡1 h，浸泡開始20 min后可以進(jìn)行DRG原代提取實(shí)驗(yàn)。浸泡開始后即刻準(zhǔn)備75%乙醇溶液用于小鼠消毒，提取培養(yǎng)基以臨時儲存DRG，混合消化酶溶液用于后續(xù)操作，準(zhǔn)備妥當(dāng)后可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 小鼠DRG的分離 小鼠備皮，脫頸處死，待完全死亡后置入提前預(yù)冷的75%乙醇溶液浸泡消毒3～5 min，待消毒完畢，沿背部正中線剪開小鼠皮膚，向兩側(cè)鈍性分離小鼠背部筋膜，此時可見小鼠背部白色韌帶組織，手術(shù)刀片沿韌帶棘突交界處迅速離斷韌帶，隨后使用刀柄向兩側(cè)鈍性分離小鼠背部肌肉群，露出肌肉下附著于橫突的韌帶，刀片分離后，迅速清理周圍肌肉組織，刀片離斷脊柱，取出脊柱后，含雙抗PBS沖洗，清除多余血液及影響視野的肌肉。

以下操作均在體視顯微鏡下操作，清洗脊柱后沿正中線自椎間孔處剪開錐體，分為左右兩半；必要時剪去棘突以方便分離錐體，清理椎間孔內(nèi)的脊髓組織與神經(jīng)纖維，注意動作輕柔緩慢，以防誤將DRG連同脊髓組織與神經(jīng)纖維一同清理；使用吸入PBS注射器沖洗椎間孔，清理多余血液，即可見側(cè)隱窩；DRG處于側(cè)隱窩內(nèi)，為淡黃色結(jié)節(jié)狀組織，兩端均有神經(jīng)纖維組織，使用帶齒眼科顯微鑷攝取DRG組織，輕輕提起后使用顯微角膜剪（直剪或彎剪）剪斷兩端神經(jīng)纖維；修理多余神經(jīng)纖維后，將DRG置于提取培養(yǎng)基內(nèi)；以相同方法攝取剩余DRG組織，提取過程中提取培養(yǎng)基全程置于冰上。見圖1。每只小鼠至少提取20個的DRG。

提取后，緩慢吸棄1.5 mL離心管中的提取培養(yǎng)基，加入混合消化酶工作液1 mL，水浴消化60～70 min，每10 min顛倒搖勻一次，注意動作輕柔。消化完成后，吸棄混合消化酶，加入完全培養(yǎng)基1 mL，槍頭吹打18下，此時經(jīng)消化的DRG組織分散，試管內(nèi)組織肉眼難見，含DRG細(xì)胞溶液過200目細(xì)胞篩清除雜質(zhì)，隨后使用1 mL完全培養(yǎng)基沖洗篩子一次， 1 000 rpm離心8.5 min。離心過程中取出事先準(zhǔn)備好的Fibronectin溶液包被的培養(yǎng)皿，吸取Fibronectin溶液（可重復(fù)使用2～3次），2 mL ddH2O清洗培養(yǎng)皿3次，最后一次清洗后ddH2O留在培養(yǎng)皿內(nèi)，防止培養(yǎng)皿過于干燥，待種板時吸棄。離心結(jié)束后，1 mL槍頭吸棄離心管液體，注意不要吸入底部沉淀，加入1 mL完全培養(yǎng)基重懸溶液，洗棄培養(yǎng)皿內(nèi)ddH2O，計數(shù)后種入35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)；隨后另補(bǔ)1 mL完全培養(yǎng)基，37 ℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～12 h。8～12 h后，使用“換液培養(yǎng)基”維持細(xì)胞生長，換液培養(yǎng)基內(nèi)含有5-氟尿嘧啶用于抑制衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞增殖，同時對非增殖性細(xì)胞（神經(jīng)元細(xì)胞）影響較小，隨后2～3 d更換培養(yǎng)基的1/2，最多取用存活15 d的DRG神經(jīng)元，培養(yǎng)時宜用35 mm培養(yǎng)皿以保持神經(jīng)元細(xì)胞的密度，維持神經(jīng)元細(xì)胞之間的突觸的高效連接。部分培養(yǎng)至第6天的DRG原代神經(jīng)元細(xì)胞使用LPS（5 μg/mL）干預(yù)8 h，用于后續(xù)高內(nèi)涵細(xì)胞成像拍攝免疫熒光圖片。

1.3.3 免疫熒光染色 按上述方法提取培養(yǎng)DRG原代神經(jīng)元細(xì)胞，分別在種板后的第3天、第5天及第7天進(jìn)行神經(jīng)元特異性的免疫熒光染色。一抗選取βⅢ-tubulin抗體與GFAP抗體。完全吸棄培養(yǎng)基，取1 mL的PBS溶液清洗培養(yǎng)皿（3次），Triton X-100孵育細(xì)胞，取1 mL的PBS溶液清洗培養(yǎng)皿（3次），2 mL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，取1 mL的PBS溶液清洗培養(yǎng)皿（3次）。配置βⅢ-tubulin與GFAP一抗（QuickBlock免疫染色一抗稀釋液配置），4 ℃冷庫孵育過夜，次日取1 mL的PBS溶液清洗培養(yǎng)皿（3次），取適量QuickBlock免疫染色封閉液，37 ℃封閉1 h，取1 mL的PBS溶液清洗培養(yǎng)皿（3次），37 ℃熒光二抗孵育1 h（免疫熒光染色二抗稀釋液配置），取1 mL的PBS溶液清洗培養(yǎng)皿（3次），自此時起，后續(xù)操作全程避光。DAPI染液孵育染色，孵育僅需1 min，取1 mL的PBS溶液清洗培養(yǎng)皿（3次），滴加適量抗熒光淬滅封片液。將培養(yǎng)皿置于免疫熒光顯微鏡下觀察、拍照。每次添加試劑時均需PBS清洗3次。這些圖像由HCA（Operetta、Perkinelmer、PE）拍攝。圖像分析由Columbus和Image J完成。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù) 含EDTA胰蛋白酶于37 ℃消化神經(jīng)元細(xì)胞3 min，顯微鏡下可見神經(jīng)元細(xì)胞之間的突觸連接，輕吹至分散；200目篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液，1 000 rpm/min離心5 min；加入2 mL 0.25%triton-X重懸細(xì)胞，室溫孵育10 min；離心后PBS洗滌兩次；加入βⅢ-tubulin（1∶200）500 μL，4 ℃孵育過夜；第2天4 ℃離心洗滌兩次，每管加入500 μL二抗室溫避光孵育1 h；4 ℃離心洗滌2次，1 mL PBS重懸細(xì)胞，準(zhǔn)備上機(jī)；陰性對照一抗二抗均用PBS代替，其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。

1.3.5 圖像和統(tǒng)計學(xué)分析 使用Image J進(jìn)行圖像處理，包括免疫熒光圖像merge及比例尺添加。所有計量數(shù)據(jù)資料統(tǒng)計使用GraphPad Prism（version 8.0.1），采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s） ，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)（Student's t-test），以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 感覺神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)時間為3 d時的神經(jīng)元細(xì)胞（圖2A），部分神經(jīng)元細(xì)胞被衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞所覆蓋（圖2B右側(cè)箭頭），但仍可見未被完全覆蓋的神經(jīng)元細(xì)胞膜，未較多被衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞包裹的神經(jīng)元細(xì)胞；隨著培養(yǎng)時間的增加，附著在神經(jīng)元細(xì)胞表面的衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞會脫離神經(jīng)元（圖2C ?右側(cè)箭頭），轉(zhuǎn)移并黏附在培養(yǎng)皿表面（左側(cè)箭頭示完全裸露的神經(jīng)元細(xì)胞）；第5～6 d時，神經(jīng)元細(xì)胞的胞質(zhì)大量暴露，此時可見神經(jīng)元細(xì)胞全部的胞體及周圍的突觸，衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞幾乎全部脫離神經(jīng)元細(xì)胞，此時的神經(jīng)元細(xì)胞可用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)或鈣成像實(shí)驗(yàn)。

2.2 免疫熒光染色鑒定 免疫熒光顯微鏡按標(biāo)準(zhǔn)步驟，拍攝了培養(yǎng)天數(shù)為6 d時的神經(jīng)元細(xì)胞（圖3）。

2.3 細(xì)胞純度測定 比較種板前細(xì)胞技術(shù)的結(jié)果顯示，改良法相較原方法能夠得到更多的細(xì)胞，細(xì)胞純度的鑒定方法參照前文提及文獻(xiàn)［5］中的方法，細(xì)胞純度可達(dá)90%。流式細(xì)胞術(shù)所示細(xì)胞純度結(jié)果見圖4。

2.4 炎癥相關(guān)神經(jīng)元TRPA1免疫熒光染色 為了進(jìn)一步明確所提取DRG原代神經(jīng)元細(xì)胞是否可用于炎癥相關(guān)研究，實(shí)驗(yàn)使用高內(nèi)涵細(xì)胞成像技術(shù)攝取的LPS干預(yù)后的神經(jīng)元細(xì)胞免疫熒光染色圖像，圖5為相鄰四個孔內(nèi)攝取的細(xì)胞圖像，圖5（a）為原代DRG神經(jīng)元TRPA1蛋白免疫熒光，圖（b）為DRG神經(jīng)元特異性標(biāo)志物βⅢ-tubulin蛋白免疫熒光；圖（c）為DRG神經(jīng)元細(xì)胞核Dapi免疫熒光染色；（d）Image J軟件合并TRPA1、βⅢ-tubulin、Dapi免疫熒光染色圖像。結(jié)果表明，神經(jīng)元胞體及突觸均有大量TRPA1表達(dá)。

3 討 論

本研究運(yùn)用原代細(xì)胞培養(yǎng)，免疫熒光，流式細(xì)胞術(shù)等方法，比較了傳統(tǒng)的小鼠DRG提取培養(yǎng)方法和優(yōu)化后的提取培養(yǎng)方法。研究結(jié)果顯示，通過βⅢ-tubulin、GFAP免疫熒光染色，流式細(xì)胞術(shù)等方法證明了改良后的提取培養(yǎng)方法具有一定的優(yōu)點(diǎn)，如細(xì)胞純度較高，提取培養(yǎng)步驟簡便，可重復(fù)性高等；TRPA1、Tau、Synapsin等蛋白的表達(dá)，提示這些原代神經(jīng)元細(xì)胞可以被用作研究疼痛、神經(jīng)損傷等方面的研究。

鑒于小鼠動物品系穩(wěn)定、易于繁殖且子代數(shù)量較多等優(yōu)點(diǎn)，小鼠神經(jīng)元常被選用于原代培養(yǎng)，這些神經(jīng)元被廣泛應(yīng)用于瘙癢、疼痛、神經(jīng)損傷與再生和軸突運(yùn)輸?shù)扰R床前研究［7］。近期研究中神經(jīng)元細(xì)胞的提取培養(yǎng)方法描述并不詳細(xì)，參照文中方法提取的原代神經(jīng)元細(xì)胞較少且存活率不高，步驟及所需試劑較多［7］。故在此基礎(chǔ)上提出一個用于提取培養(yǎng)小鼠脊髓背角DRG原代神經(jīng)元細(xì)胞的詳細(xì)方法。經(jīng)過大量嘗試，改良后的方法可以保證原代神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量與存活率，原代的神經(jīng)元細(xì)胞在第8～12 h時即可貼壁。此時換液可以棄去未貼壁細(xì)胞及脫落的衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞，在換液后的12～24 h后即可觀察到細(xì)胞呈現(xiàn)梭形，大部分細(xì)胞可觀察到神經(jīng)元標(biāo)志性的突起，神經(jīng)元的軸突數(shù)目逐步增加、延伸范圍逐漸擴(kuò)大；在3～4 d后即可觀察到清晰的神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)，神經(jīng)元周圍光暈明顯，貼壁緊密；在5～7 d時可見神經(jīng)元之間的軸突呈大量增加，神經(jīng)元之間形成了仍在逐步擴(kuò)大的軸突網(wǎng)絡(luò)，這些神經(jīng)元均可以投入后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用，同時這些細(xì)胞的最佳試用期在6～15 d內(nèi)。本研究參考并試驗(yàn)了國內(nèi)外文獻(xiàn)中提供的實(shí)驗(yàn)方法，具有以下的特點(diǎn)及優(yōu)勢：（1）選擇小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，其基因組與人類相似度較大鼠更高；（2）避免使用胎鼠，既往研究大量使用胎鼠作為研究對象，胎鼠胎齡掌握困難，剖腹取出的胎鼠易死亡，耗時極長、耗費(fèi)較大，此外胎鼠體積較小，操作難度高，組織極易損傷，影響術(shù)野，耗時長的前提下，分離出的細(xì)胞較少，細(xì)胞活性較差問題難以解決；（3）既往研究中大量使用DMEM/F12或Neurobasal培養(yǎng)基，價格高昂，用途局限，本研究使用MEM-ALPHA培養(yǎng)基，價格較低，且培養(yǎng)效果較好；（4）分離后的背根神經(jīng)節(jié)組織使用Ⅰ型膠原酶及分散酶混合消化，較單純使用胰蛋白酶消化可幫助衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞從神經(jīng)元細(xì)胞上脫落，也可幫助神經(jīng)元細(xì)胞分離，獲得更多的細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞存活率高；（5）提取培養(yǎng)基與換液培養(yǎng)基的成分不同，在神經(jīng)元細(xì)胞貼壁后，選用含1%的5-氟尿嘧啶的換液培養(yǎng)基，既往研究多使用阿糖胞苷抑制非神經(jīng)元細(xì)胞增殖，使用條件較為苛刻，同時抑制了神經(jīng)元的細(xì)胞活性，針對神經(jīng)元細(xì)胞無法增殖的特點(diǎn)，添加含1%的5-氟尿嘧啶和5%濃度FBS的換液培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，可以有效抑制非神經(jīng)元細(xì)胞，如小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，同時可以促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞生長，對神經(jīng)元細(xì)胞損傷較??；（6）選取免疫熒光鑒定神經(jīng)元細(xì)胞，優(yōu)先使用βⅢ-tubulin作為神經(jīng)元標(biāo)志蛋白，GFAP作為衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，分別選取不同種屬、不同顏色的熒光二抗以方便同時染色，βⅢ-tubulin作為神經(jīng)元細(xì)胞骨架，參與神經(jīng)發(fā)生和軸突的引導(dǎo)和維持［15］，表達(dá)量較高，方便染色，因此在染色時可幫助觀察到整個神經(jīng)元細(xì)胞。GFAP作為衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞最初包裹著分離出的DRG神經(jīng)元少數(shù)神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)GFAP，因此GFAP可用作區(qū)分衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞；（7）本研究培養(yǎng)皿包被時首選纖維連接蛋白，相較使用多聚賴氨酸，神經(jīng)元細(xì)胞貼壁所需時間大大減少，8～12 h即可使用換液培養(yǎng)基換液，提前抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的增殖，所得細(xì)胞活性更好、純度更佳；（8）在提取神經(jīng)元細(xì)胞時需要操作者大量的操作練習(xí)，熟悉流程，同時在練習(xí)的幫助下加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，盡可能縮短提取DRG所花費(fèi)的時間，以使神經(jīng)元原代細(xì)胞活性保持在最佳狀態(tài)。因流式細(xì)胞術(shù)所用非流式專用抗體，使用的為βⅢ-tubulin一抗間接標(biāo)記了神經(jīng)元細(xì)胞；此外，胰蛋白酶消化及離心操作均會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，甚至破碎、丟失，故神經(jīng)元細(xì)胞所占比例較低；使用傳統(tǒng)計數(shù)方法第6天時鏡下觀察計數(shù)，原代神經(jīng)元細(xì)胞純度可達(dá)90%，與傳統(tǒng)方法一致。此外為了驗(yàn)證此方法培養(yǎng)的原代神經(jīng)元細(xì)胞是否可用于疼痛、神經(jīng)損傷與再生等實(shí)驗(yàn)的研究，本研究使用熒光標(biāo)記了TRPA1、Tau、Synapsin等蛋白，發(fā)現(xiàn)這些蛋白均有表達(dá)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，這些神經(jīng)元細(xì)胞常用于瘙癢、疼痛、神經(jīng)損傷與再生等的研究。改良后的方法具有操作簡便、提取培養(yǎng)的細(xì)胞純度高、用途廣泛，同時價格便宜等優(yōu)點(diǎn)，為研究者提供了一種新的用于小鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法。

［參 考 文 獻(xiàn)］

［1］王德，劉雪婷，曾麗萍，等.神經(jīng)肽Y在DNFB誘發(fā)的ACD慢性瘙癢模型小鼠背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志，2021，35（3）：255-260.

［2］Wang KK，Wang SS，Chen Y，et al.Single-cell transcriptomic analysis of somatosensory neurons uncovers temporal development of neuropathic pain［J］.Cell Res，2021，31（8）：939-940.

［3］Geron M，Tassou A，Scherrer G.Sympathetic yet painful：autonomic innervation drives cluster firing of somatosensory neurons［J］.Neuron，2022，110（2）：175-177.

［4］Kivitz AJ，Gimbel JS，Bramson C，et al.Efficacy and safety of tanezumab versus naproxen in the treatment of chronic low back pain［J］.Pain，2013，154（7）：1009-1021.

［5］董甜甜，李世剛，唐和斌，等.小鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)新方法［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2019，40（2）：302-304.

［6］隋峰，杜新亮，張暢斌，等.一種原代培養(yǎng)大鼠DRG神經(jīng)元的新方法［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25（7）：971-973.

［7］任旺，胡朔丹，劉琳，等.施萬細(xì)胞樣細(xì)胞對大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞突起生長的影響［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2020，36（6）：605-611.

［8］Valtcheva MV，Copits BA，Davidson S，et al.Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures［J］.Nat Protoc，2016，11（10）：1877-1888.

［9］Sadler KE，Mogil JS，Stucky CL.Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals［J］.Nat Rev Neurosci，2022，23（2）：70-85.

［10］Miller RE，Tran PB，Ishihara S，et al.Microarray analyses of the dorsal root ganglia support a role for innate neuro-immune pathways in persistent pain in experimental osteoarthritis［J］.Osteoarthritis Cartilage，2020，28（5）：581-592.

［11］Taneja A，Di Iorio VL，Danhof M，et al.Translation of drug effects from experimental models of neuropathic pain and analgesia to humans［J］.Drug Discov Today，2012，17（15-16）：837-849.

［12］Chambraud B，Daguinot C，Guillemeau K，et al.Decrease of neuronal FKBP4/FKBP52 modulates perinuclear lysosomal positioning and MAPT/Tau behavior during MAPT/Tau-induced proteotoxic stress［J］.Autophagy，2021，17（11）：3491-3510.

［13］Deng CL，Hu CB，Ling ST，et al.Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal miR-21 as a therapeutic for retinal degeneration［J］.Cell Death Differ，2021，28（3）：1041-1061.

［14］Singh R，Cottle L，Loudovaris T，et al.Enhanced structure and function of human pluripotent stem cell-derived beta-cells cultured on extracellular matrix［J］.Stem Cells Transl Med，2021，10（3）：492-505.

［15］Saillour Y，Broix L，Bruel-Jungerman E，et al.Beta tubulin isoforms are not interchangeable for rescuing impaired radial migration due to Tubb3 knockdown［J］.Hum Mol Genet，2014，23（6）：1516-1526.

（收稿2022-03-07 修回2022-05-03）