DNA甲基化在钚輻射損傷機制中的研究進展

劉曉明　古曉娜　蘇麗霞等

關(guān)鍵詞：DNA 甲基化;輻射致癌;钚接觸人群

中圖分類號：Q691;Q7 文獻標識碼：A

钚是核工業(yè)中的主要放射性核素。Pu-239物理半衰期為2. 41×10⁴a，人體內(nèi)半減期為178a，其對人體的健康危害主要來源于衰變過程中釋放的高傳能線密度（LET）α 粒子，通過吸入、皮膚傷口進入人體，造成人員的內(nèi)照射損傷。钚為親骨性和親網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞系統(tǒng)的極毒放射性核素，進入人體后有約90%的钚在人體內(nèi)環(huán)境中遷移，主要分布在肺、肝臟、骨骼等器官組織中，可以導致肺癌、肝癌和骨肉瘤。國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）于2012 年將钚列為Ⅰ類致癌物。钚的輻射致癌效應是輻射防護與輻射生物效應研究領(lǐng)域的關(guān)注重點。

钚輻射致癌損傷的分子機制主要是由于α 粒子導致復雜的DNA 雙鏈斷裂集簇性損傷，加上自由基或二級電子的作用，產(chǎn)生繼發(fā)性DNA 損傷，其修復難度大、錯誤修復率高，最終導致染色體畸變、基因突變等生物效應[1] 。

事實上，電離輻射作為基因毒劑，損傷DNA分子就已啟動了細胞惡性轉(zhuǎn)化的程序，其關(guān)鍵點在于是否改變了某些關(guān)鍵基因（如癌基因、抑癌基因）的結(jié)構(gòu)和功能，導致細胞增殖失調(diào)和向惡性轉(zhuǎn)化。但直到目前，還沒有發(fā)現(xiàn)輻射誘發(fā)的基因突變具有明顯的位點特異性，突變熱點也少有報道。

因此，目前研究認為電離輻射除導致基因結(jié)構(gòu)的改變外，通過產(chǎn)生表觀遺傳改變，可導致某些關(guān)鍵基因的表達變化，影響生物學功能，如促使癌基因激活、抑癌基因失活、干擾細胞周期調(diào)控等。國際放射防護委員會（ICRP）103 號報告指出，電離輻射存在基于表觀遺傳的遠后效應，尤其是DNA 甲基化的改變[2] 。

1 DNA 甲基化與疾病關(guān)系

1. 1 DNA 甲基化及其生物學意義

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要形式，作為表觀遺傳學的一項重要內(nèi)容，日益受到人們的重視。表觀遺傳是指不改變基因原有序列而改變基因表型，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等最終導致基因表達量改變的一種生物學機制[3] 。

DNA 甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶（ DNA methyltansferase，DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，在基因組CpG 二核苷酸的胞嘧啶5碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團，形成5-甲基胞嘧啶的DNA 修飾序列[4] 。

DNA 甲基化具有多種生物學意義，生物體正常的DNA 甲基化維持，對于維護基因組穩(wěn)定性及基因正確的時空表達具有重要意義。如基因組結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、基因印跡、細胞分化、雌性個體X 染色體的失活和胚胎的正常發(fā)育等[5-6] 。

在基因組中，CpG 島是基因啟動子區(qū)的一段長約0. 5～2 kb 的CpG 富集區(qū)。人類基因組中約有29 000 個CpG 島，其中約一半分布于基因的啟動子區(qū)。不同基因啟動子區(qū)CpG 島的甲基化狀態(tài)是不同的，90% 以上的管家基因（ house-keepinggenes）啟動子區(qū)CpG 島是非甲基化的，而某些原癌基因及微衛(wèi)星序列區(qū)域的CpG 島則是高甲基化[7] 。甲基化模式的異常改變將直接導致人類疾病甚至癌癥的發(fā)生[8] 。

越來越多研究表明，異常甲基化及甲基化模式的改變與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[9] 。癌細胞具有甲基化異常的特征，即全基因組DNA低甲基化和啟動子區(qū)DNA 高甲基化[10] 。關(guān)于DNA 甲基化在腫瘤發(fā)生過程中作用機制，目前形成了以下結(jié)論：

①癌變細胞中出現(xiàn)基因突變的概率要遠遠低于預期。而在轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)高達5%的已知基因在腫瘤細胞中發(fā)生了異常的啟動子DNA 高甲基化[11-12] 。因此可以推測，與基因突變相比，DNA甲基化改變在細胞惡變過程中可能發(fā)揮了更大的作用。

②在哺乳動物細胞中，全基因組DNA 低甲基化是腫瘤形成的原因之一。全基因組DNA 低甲基化可通過增加染色體不穩(wěn)定性，引起轉(zhuǎn)座子異常表達及導致基因組印記丟失等機制促進腫瘤的發(fā)生及演進[13] 。

③幾乎所有的人類腫瘤中都存在腫瘤相關(guān)基因的異常甲基化。這些異常改變是腫瘤抑制基因失活的機制之一[14] 。

這些基因涉及細胞周期調(diào)控、細胞凋亡、細胞間信號傳導、DNA 損傷修復及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等過程。根據(jù)文獻調(diào)研，目前的研究多集中在以下幾類基因的研究，主要包括：細胞周期調(diào)控基因：p16、p15[15] 、APC[16] 、p14、p53、p73、RASSF1A[17-18] 、CDKN[19-20] 等; DNA 損傷修復基因： MGMT[11] 、hMLH1[12] 、BRCA1[21] ;腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因：DAPK、TIMP、E-cadherin[22] 。

1. 2 DNA 甲基化應用

DNA 甲基化作為腫瘤發(fā)生的早期分子事件，可能為腫瘤的臨床篩查、早期診斷、預后判斷提供一種新的生物標志物。而且已有研究表明，DNA甲基化譜具有明顯的腫瘤類型特異性。針對一種腫瘤，對其進行多種癌基因的甲基化檢測，可以繪制出該腫瘤的甲基化譜[23-24] 。近年來，國內(nèi)外學者通過不同腫瘤中相關(guān)基因甲基化異常的特點分析，目前已確定了許多以DNA 甲基化為基礎(chǔ)的潛在生物標志物并進行了腫瘤早期診斷的臨床研究[25] 。如GSTPI 基因甲基化異常頻發(fā)于前列腺癌中，但并不發(fā)生在良性增生的前列腺組織中，多個研究顯示尿液中GSTPI 基因甲基化檢測可準確的用于前列腺癌篩查[26-27] 。Belinsky 等[28] 檢測了吸煙者和肺癌患者痰液中的DAPK、P16、MGMT等基因，發(fā)現(xiàn)3 個以上基因甲基化陽性肺癌患者吸煙者是不吸煙者的6. 2 倍。進一步設(shè)計病例對照研究發(fā)現(xiàn)，基因甲基化隨著肺癌診斷的時間接近而增加， 以DAPK、P16、MGMT、 RASSF1A、GATA 等6 個基因作為評價指標，其中3 個以上基因甲基化陽性肺癌風險增加6. 5 倍，篩查肺癌的敏感性和特異性達到65%[29] 。

2 DNA 甲基化與電離輻射的關(guān)系

近年來，世界上一些研究機構(gòu)也在用各種分子生物學技術(shù)研究放射作業(yè)人群的健康效應，試圖從分子水平揭示輻射損傷機制。其中表觀遺傳修飾是研究熱點，電離輻射誘導的癌癥受MAPK、NF-κB、Wnt、mircroRNA 等相關(guān)信號分子的影響，表明表觀遺傳在輻射致癌機理中發(fā)揮關(guān)鍵作用[30] 。

DNA 甲基化是表觀遺傳學的一種重要形式，電離輻射誘導DNA 甲基化研究正在不斷深入。國際放射防護委員會（ICRP）103 號報告指出，電離輻射存在基于表觀遺傳的遠后效應，尤其是DNA 甲基化的改變[31] 。研究表明，電離輻射誘導的DNA 甲基化改變與輻射暴露劑量、類型和持續(xù)時間相關(guān)[32] ，并且具有明顯的組織特異性和劑量特異性[33] 。

電離輻射導致機體全基因組DNA 低甲基化，DNA 低甲基化狀態(tài)可引起堿基錯配未完全修復，從而導致染色體畸變率增加。Lee 等[34] 對核電廠工作人員（年有效劑量為53 mSv）職業(yè)輻射暴露誘導DNA 甲基化改變的隊列分析提示，低劑量電離輻射職業(yè)暴露也可能造成機體DNA 甲基化的改變，全基因組甲基化水平與輻射劑量呈負相關(guān)。DNA 甲基化水平與工人染色體畸變相關(guān)，認為職業(yè)接觸低劑量輻射會影響DNA 甲基化水平，輻射誘導的DNA 甲基化改變可能與染色體畸變有關(guān)。Kuzmina 對前蘇聯(lián)切爾諾貝利核電廠清理工人的體內(nèi)DNA 甲基化進行分析，受照組為切爾諾貝利83 名核電廠清理工人（ 累積劑量范圍： 30 ～480 mSv）和21 名其他核工人（ 累積劑量范圍：11～994 mSv），對照組為208 名為未受照人員。通過p16/ INK4A、p14/ ARF、RASSF1A 和GSTP1 啟動子甲基化水平研究發(fā)現(xiàn)，p16/ INK4A 和GSTP1基因的甲基化水平顯著高于對照組，且與輻射暴露相關(guān)，不受其他因素影響[35] 。

3 DNA 甲基化在钚輻射致癌機制中的研究

DNA 甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，全體基因組的低甲基化、癌基因調(diào)控區(qū)的低甲基化和抑癌基因調(diào)控區(qū)的高甲基化與癌癥的發(fā)生和進展相關(guān)。钚輻射導致的基因組不穩(wěn)定性是其致癌的機制之一，而基因組的DNA 甲基化與基因組不穩(wěn)定性相關(guān)，因此DNA 甲基化模式改變導致基因組不穩(wěn)定性進而導致钚輻射致癌的機制具有重要意義[36-37] 。

流行病學研究結(jié)果提示，Mayak 工人患肺腺癌的風險明顯高于對照組，并且與钚暴露有很高的相關(guān)性[38] 。美國Lovelace 呼吸研究所與俄羅斯SUBI 聯(lián)合進行了一項關(guān)于Mayak 核工業(yè)工人肺癌分子標志物的研究。

2004 年，該研究組收集了71 例Mayak 核工廠钚接觸工人及69 例非受照組工人（對照組），兩組均為肺腺癌患者，工人暴露于钚的吸收劑量和γ外照射劑量的中位數(shù)分別為520 mGy 和1 330mGy。對71 名Mayak 肺腺癌工人的DNA 甲基化分析，肺的累積劑量在1 ～ 15 cGy 時，發(fā)生一個基因甲基化占35%，兩個以上基因甲基化36%;累積劑量在16 ～ 137 cGy 時，發(fā)生一個基因甲基化占35%，兩個以上基因甲基化50%。根據(jù)統(tǒng)計分層分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，钚暴露與p16 甲基化間存在著明顯的劑量反應關(guān)系;钚內(nèi)照射暴露最高的工作人員，其肺腺癌中p16 甲基化的風險比對照組增加3. 5 倍[39] 。

2007 年，對66 名受照工人和63 名非受照工人（對照組） 的腺癌進行了GATA - 5、PAX5β 和H-cadherin 基因甲基化檢測。結(jié)果顯示，至少有一個基因發(fā)生甲基化;受照工人肺腺癌中甲基化率93%，而對照組中甲基化率為66%;與對照組相比，Mayak 工人腫瘤中GATA-5 甲基化率顯著增加?；騿幼痈叨燃谆瘜е禄蚴Щ畹念l率增加和腫瘤抑制基因（如GATA-5）的靶向性可能是與輻射暴露相關(guān)的肺癌風險增加的主要因素[40] 。另外，對396 名既往受照工人（钚接觸者且無癌癥人群） 的痰基因（ p16、MGMT、DAPK、RASSF1a、PAX5α、PAX5β、GATA-4 和GATA-5）的甲基化進行檢測與分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Lovelace隊列相比，Mayak 工人痰中甲基化超過4 個的工人數(shù)量顯著增加。

Kuzmina 等[41] 通過研究49 名Mayak 工人外周血白細胞的某些基因的甲基化水平，研究其年齡和輻射暴露對某些基因高甲基化的影響。受照組（年齡為67～84 歲）γ 外照射的累積劑量959 ～4 095 mGy，钚的累積劑量0 ～ 21. 8 mGy;同時選取50 名與年齡匹配的非接觸者，研究細胞周期調(diào)控基因（ RASSF1A、p16/ INK4A、p14/ ARF、TP53、ATM）、抗氧化防御（SOD3）基因的甲基化頻率等。結(jié)果顯示，暴露組8 個基因中至少一個基因的啟動子甲基化率（71. 4%） 顯著高于對照組（40%）。與對照組相比，受照組個體GSTP1、TP53、SOD3 啟動子中CpG 島甲基化的頻率顯著升高，與年齡相關(guān)的RASSF1A 和p14/ ARF 基因甲基化可能與輻射暴露有關(guān)。

除人群流行病學研究外，國內(nèi)外部分學者在細胞水平進行了關(guān)于DNA 甲基化在α 粒子導致的輻射損傷機制研究。研究認為輻射誘發(fā)細胞惡性轉(zhuǎn)化影響了DNA -PKs（ 參與DNA 修復） 的活性，該蛋白在非同源重組和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用[42-43] 。而目前認為DNA 甲基化異常是正常轉(zhuǎn)錄調(diào)控缺失的一種機制[44] 。

Yamada 等[45] 利用預先建立的二氧化钚吸入導致的鼠肺癌細胞模型分析p16 甲基化情況。結(jié)果顯示，在鼠肺上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的早期即出現(xiàn)p16啟動子區(qū)甲基化現(xiàn)象，使p16 基因失活，p16基因表達的缺失可能在钚導致的肺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

軍事醫(yī)學科學院隋建麗等[46-47] 研究了α 粒子照射細胞傳代培養(yǎng)不同時期部分DNA 修復基因結(jié)構(gòu)或表達變化，發(fā)現(xiàn)受照細胞在惡性轉(zhuǎn)化早期（5～20 代），DNA 修復基因ATM、DNA-PKcs 的表達就受到抑制，XRCC-5 基因發(fā)生了堿基突變，部分DNA 修復基因如MGMT 和細胞周期G2 -M調(diào)控基因發(fā)生甲基化導致表達抑制。

4 小結(jié)

通過Mayak 隊列研究钚致肺癌與DNA 甲基化的相關(guān)性結(jié)果提示，钚致肺癌的進展過程中涉及了多種基因異常甲基化，這些基因甲基化異?？赡茉陬械妮椛鋼p傷過程中發(fā)揮了重要作用。體外的細胞實驗結(jié)果也提示，特定基因在α 輻射損傷早期由于發(fā)生甲基化導致表達抑制。上述研究結(jié)果均提示DNA 甲基化在钚輻射損傷機制中起著重要的調(diào)控作用，那么在α 粒子導致DNA 雙鏈斷裂過程中，DNA 甲基化如何發(fā)揮作用？ 需要進一步探索研究。