拉薩長期不同施肥青稞田土壤固氮菌分離鑒定

馬瑞萍,戴相林,劉國一,謝永春,普布貴吉,張國新

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所,西藏拉薩 850000;2.河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所,河北唐山 063299)

青稞(HordeumvulgareL.)是西藏主要的糧食作物,其播種面積占西藏糧食作物總播種面積的75.3%,產(chǎn)量占西藏糧食作物總產(chǎn)量的 76.3%,維持青稞高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)是實現(xiàn)西藏糧食安全的重要保障[1]。拉薩地處青藏高原中部,具有海拔高、紫外線強和低溫干旱的氣候特點[1],土壤氮素含量低,pH偏堿性,故不利于銨態(tài)氮肥的施用[2]。同時,作為典型的生態(tài)脆弱區(qū)和氣候變化敏感區(qū)[3-4],化肥的過量施用會導(dǎo)致青藏高原環(huán)境污染問題。因此,如何在生態(tài)環(huán)境友好的前提下保障青藏高原青稞產(chǎn)量穩(wěn)定是當前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的首要任務(wù)。

氮素是植物生長發(fā)育所需的大量營養(yǎng)元素之一,也是農(nóng)作物生產(chǎn)中最常見的養(yǎng)分限制因子[5]。生物固氮是陸地生態(tài)系統(tǒng)中氮的重要來源,為大氣氮的利用提供了可能[6]。自Berthelot發(fā)現(xiàn)微生物能夠固氮以來,人們對生物固氮的研究已經(jīng)超過了130年[7]。生物固氮分共生固氮和自生固氮,相對于共生固氮,自生固氮雖然速率低,但時空分布廣泛,可為土壤-植物系統(tǒng)提供每年約0～60 kg·hm-2的氮素輸入量[1,6,8-10]。因此,自生固氮作為一種環(huán)境友好型和可持續(xù)性的供氮方式,可部分替代無機氮肥以減輕由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中過量施氮導(dǎo)致的環(huán)境污染。生物固氮主要靠固氮微生物實現(xiàn),不同作物類型、土壤理化性質(zhì)、時空分布和氣候因子對固氮微生物的豐度、多樣性、活性和群落組成影響不同。

施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的農(nóng)藝措施之一, 施肥通過改變土壤理化性質(zhì)而影響固氮菌的生存環(huán)境,進而影響固氮菌多樣性和群落組成及其固氮酶活性[11]。有研究表明,固氮微生物組成對不同施肥模式的響應(yīng)不同[12-19]。目前,針對不同植物內(nèi)生固氮菌[20]和不同氣候、土壤、植被環(huán)境下非共生固氮菌多樣性、群落結(jié)構(gòu)及不同作物種類非共生固氮菌固氮量研究較多[20-24],而針對長期不同施肥條件下高原地區(qū)農(nóng)田土壤固氮菌篩選、鑒定的研究少見報道。本研究擬尋找西藏高原青稞田長期不同施肥模式下土壤中可培養(yǎng)固氮微生物,明確其固氮能力,為利用當?shù)毓痰Y源研制更加安全環(huán)保的生物肥料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

土壤樣品:供試土壤采集于西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院四號試驗地長期定位試驗土壤,試驗地位于西藏自治區(qū)拉薩市(29°38′N,91°02′E),海拔 3 662 m,屬高原溫帶半干旱季風氣候區(qū)。試驗開始于2018年,種植模式為青稞-青稞-青稞-油菜輪作,6種施肥模式見表1,小區(qū)面積20 m2,設(shè)置重復(fù)4次,小區(qū)間澆筑1 m深水泥板防止耕層土壤水肥側(cè)向運移。于2021年4月,根據(jù)S型多點混合法采集各小區(qū)耕層(0～20 cm)土壤樣品6份,置于4 ℃保溫箱中迅速帶回實驗室進行后續(xù)分析。

表1 土壤長期定位試驗各處理施肥情況

固氮菌富集培養(yǎng)液:蔗糖10 g,氯化鈉0.2 g,碳酸鈣1 g,七水合硫酸鎂0.2 g,磷酸二氫鉀0.5 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0～7.2。

固氮菌分離培養(yǎng)基:固氮菌富集培養(yǎng)基加 1.5%～2.0%瓊脂。

固氮菌純化和保存培養(yǎng)基:蔗糖10 g,氯化鈉0.2 g,碳酸鈣1 g,七水合硫酸鎂0.2 g,磷酸二氫鉀0.5 g,酵母膏0.5 g,蒸餾水1 000 mL,pH值 7.0～7.2,固體加1.5%～2.0%瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 固氮菌的分離

取10 g新鮮土樣放入盛有100 mL固氮菌富集培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中,100 r·min-1、28 ℃富集培養(yǎng)72 h,取0.1 mL懸浮液轉(zhuǎn)入有100 mL固氮菌富集培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中,100 r·min-1、28 ℃富集培養(yǎng)72 h;重復(fù)3次。取富集培養(yǎng)后的懸液1 mL,依次稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度梯度;分別吸取不同濃度菌懸液0.1 mL在分離培養(yǎng)基上均勻涂布,重復(fù)3次;涂布好的平板于28 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d,挑取單菌落用平板劃線法進行菌種純化。將純化后的單菌落涂布于純化保存斜面上,編號,4 ℃保存。

1.2.2 固氮菌的鑒定

形態(tài)學鑒定:將1.2.1中純化得到的單菌落進行同樣條件平板劃線培養(yǎng),觀察菌落顏色、大小、形狀、邊緣、干濕、表面光滑程度等。

16s rDNA序列分析鑒定:提取分離得到的每個單菌落的DNA作為模板,采用16s rDNA通用引物進行PCR,目標片段1 500 bp。引物由上海生物工程有限公司合成,正向引物27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物1492r:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系:2×Master(上海生物) 25 μL,引物(20 μM)1 μL,模板2 μL,用ddH2O補足50 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃變性30 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共30個循環(huán); 72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。測序由上海生物工程有限公司完成,在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)blast進行序列比對,確定它們的屬水平分類學地位。

1.2.3 固氮酶活性測定

采用乙炔還原法:將待測菌株接種于含10 mL純化保存培養(yǎng)基的25 mL小瓶中,30 ℃培養(yǎng)2 d;將棉塞換成膠塞密封,抽出10 %氣體后加入1.5 mL C2H2,分別培養(yǎng)2、4、6和8 d;從瓶中抽取混合氣體0.2 mL注入氣相色譜儀中,測定C2H2、C2H4的產(chǎn)生情況。色譜參數(shù):不銹鋼層析柱2 mm×1 000 mm,柱溫150 ℃,氫離子火焰檢測器溫度20 ℃,載氣為氮氣,氣體流量30 mL·min-1。用下列公式計算固氮酶活性(nmol·h-1·mL-1):

固氮酶活性=(58.0×Se×T×Pe)/(Sb×Te×P×t×V)

式中,Se為乙烯峰面積;T為開氏絕對溫度(T=273.13K);Pe為試驗條件下的大氣壓強(Pa);Sb為乙炔峰面積;Te為試驗條件下的溫度(K);P為絕對大氣壓強(P=101 324.72 Pa);t為培養(yǎng)時間;V為氣體體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離狀況分析

由表2 可見,從CK0、CK、F、M、FM和FS 6種不同施肥模式的土壤樣品中分別分離得到形態(tài)不同的菌株6株、10株、6株、9株、10株和9株,即CK和FM處理土壤中各分離出固氮菌10株;M和FS處理各分離出9株;單施化肥(F)和撂荒(CK0)處理土壤中可培養(yǎng)固氮菌種類最少,各分離出6株,共50株菌。觀察各菌株形態(tài)特征,發(fā)現(xiàn)不同施肥處理土壤中分離出來的菌株有部分形態(tài)特征較相似,疑似同種菌株,部分菌株只分離自某一特定施肥處理土壤。圖1為部分菌株在平板上生長情況。

表2 不同施肥模式土壤中固氮菌形態(tài)

2.2 固氮菌屬水平分類學地位

由表3可以看出,分離自6個不同施肥處理土壤的50個菌株分別屬于14個屬。CK0處理中分離出的6株菌分別屬于伯克霍爾德氏菌屬、類芽孢桿菌屬、葉桿菌屬、鏈霉菌屬、鞘胺醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬。CK處理中分離出的10株菌屬于伯克霍爾德氏菌屬、葉桿菌屬、鏈霉菌屬、假食酸菌屬、芽單胞菌屬、甲基細菌屬、鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬、紅球菌屬、農(nóng)桿菌屬。F處理中分離出的6株菌屬于伯克霍爾德氏菌屬、類芽孢桿菌屬、葉桿菌屬、鏈霉菌屬、假食酸菌屬、鞘胺醇單胞菌屬。M處理中分離出的9株屬于伯克霍爾德氏菌屬、類芽孢桿菌屬、葉桿菌屬、鏈霉菌屬、假食酸菌屬、鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬 、紅球菌屬、農(nóng)桿菌屬。FM處理中分離出的10株菌屬于伯克霍爾德氏菌屬、葉桿菌屬、鏈霉菌屬、假食酸菌屬、鞘胺醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、甲基細菌屬、鏈霉菌屬、土地桿菌屬、芽孢桿菌屬、類諾卡氏屬。FS處理中分離出的9株菌屬于伯克霍爾德氏菌屬、葉桿菌屬、鏈霉菌屬、假食酸菌屬、鞘胺醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、鏈霉菌屬、土地桿菌屬、類諾卡氏屬。說明分離自不同土壤的部分菌株系同屬。

表3 固氮菌屬水平分類學地位

2.3 固氮菌固氮酶活性分析

由表4 可見,分離得到的50株固氮菌中,固氮酶活性范圍在0.11～1.31 nmol·h-1·mL-1之間,其中固氮酶活性最高的菌株為CK4、F5、M5、FM4和FS4,均屬于假食酸菌屬,分別分離自CK、F、M、FM、FS處理,酶活性均接近1.31 nmol·h-1·mL-1;

表4 固氮菌固氮酶活性

葉桿菌屬各菌株固氮酶活性最低,為0.11 nmol·h-1·mL-1;伯克霍爾德氏菌屬、葉桿菌屬、鏈霉菌屬固氮酶活性較低,但分布較為廣泛,存在于所有處理土壤中,說明其對土壤環(huán)境適應(yīng)能力較強。對于分別屬于假食酸菌屬、芽孢桿菌屬、紅球菌屬和農(nóng)桿菌屬的13個菌株CK4、F5、M5、FM4、FS4、CK06、CK8、M7、FM9、CK9、M8、CK10、M9,其固氮酶活性均高于0.8 nmol·h-1·mL-1,具有高效固氮能力。CK和M處理土壤中分離到高效固氮能力菌株最多,均有4株;FM處理土壤中分離出高效固氮能力菌株2株;CK0、F、FS處理各分離出1株。由此可見,施用化肥使土壤中可分離固氮菌種類減少,說明固氮菌對土壤微環(huán)境較敏感。

3 討 論

本研究顯示,從不同施肥處理土壤中篩選的分別屬于假食酸菌屬、芽孢桿菌屬、紅球菌屬和農(nóng)桿菌屬的13個菌株CK4、F5、M5、FM4、FS4、CK06、CK8、M7、FM9、CK9、M8、CK10、M9,具有高效固氮能力。這與前人研究一致,如Fu等[25]發(fā)現(xiàn),假食酸菌屬是活躍的固氮微生物類群,在土壤、植物和水環(huán)境中廣泛存在;劉振東等[5]對不同產(chǎn)區(qū)青稞根部可培養(yǎng)內(nèi)生固氮菌的多樣性研究,發(fā)現(xiàn)11株高固氮酶活性的菌中,有5株菌屬于芽孢桿菌屬;王惟帥等[26]對馬鈴薯根際固氮解磷微生物進行分離與鑒定,發(fā)現(xiàn)歸屬于紅球菌屬的N34菌株活性最高。

有研究表明,不同施肥模式對土壤固氮微生物多樣性、群落組成和活性影響不同;施用化肥會降低土壤固氮微生物多樣性和活性[14,27],施用有機肥則反之[13]。本研究中,單施化肥處理土壤可培養(yǎng)固氮菌種類較CK處理減少,且屬于芽孢桿菌屬、紅球菌屬和農(nóng)桿菌屬的高效固氮菌在F處理中均未培養(yǎng)出,而單施有機肥處理土壤則培養(yǎng)出了假食酸菌屬、芽孢桿菌屬、紅球菌屬和農(nóng)桿菌屬的全部高效固氮菌株。這可能是由于有機肥的施用為固氮微生物提供了充足的碳源,從而促進其生長[17]。本研究還顯示,化肥配施秸稈處理下,雖然可培養(yǎng)的固氮微生物種類較CK處理變化不大,但高效固氮菌種類卻顯著減少。這與前人研究結(jié)果相類似,即長期施用化肥或化肥加秸稈還田會抑制土壤固氮微生物活性,降低其豐度[28-29],可能是由于秸稈還田后前期秸稈腐解和微生物爭氮所致。另外, CK處理可培養(yǎng)固氮菌和高效固氮菌種類較CK0處理均顯著增加,可能是撂荒的自然狀態(tài)下,拉薩4月份長期無降水,因水分缺乏,土壤微生物活動受限導(dǎo)致其固氮微生物種類減少。

本項目組前期研究結(jié)果[1]表明,假食酸菌屬是青稞田土壤中固氮菌的優(yōu)勢菌屬,且在土壤、植物和水環(huán)境中廣泛存在[26,30]。本研究中,CK、F、M、FM、FS處理中均培養(yǎng)出了假食酸菌屬菌株,而CK0中未分離出,說明假食酸菌對施肥模式具有較強的適應(yīng)性,而對于是否耕種青稞較敏感,可能在西藏較為特殊的氣候環(huán)境條件下,假食酸菌屬固氮菌與青稞根系存在某種共生互利關(guān)系,具體有待進一步探索。

本研究還發(fā)現(xiàn),不同施肥模式土壤可培養(yǎng)高效固氮菌相似性呈3類,CK與M有4株、FM有2株、CK0、F與FS均只培養(yǎng)出1株。羊糞腐解速率高于秸稈[31],能更快速地提供易分解有機碳作為固氮微生物生長的碳源,而秸稈含有較多纖維二糖及纖維素,施入土壤后分解速度慢,使固氮微生物自身生長受限;化肥的施用則增加了土壤銨態(tài)氮含量,抑制了固氮酶活性[32],因此F與FS處理較CK和M處理高效固氮菌種顯著 減少。

4 結(jié) 論

本研究從6個長期不同施肥模式下的土壤中,共分離得到50株形態(tài)不同的固氮菌,并從其中篩選出了13種高效固氮菌株,分別是CK4、F5、M5、FM4、FS4、CK06、CK8、M7、FM9、CK9、M8、CK10、M9,對應(yīng)的屬水平分類學地位分別是假食酸菌屬、芽孢桿菌屬、紅球菌屬和農(nóng)桿菌屬。

施用化肥會減少土壤中高效固氮菌種類,不施化肥或施用有機肥能豐富土壤中高效固氮菌 種類。