功能性引導骨再生屏障膜的組織工程設計

王 焱

(中山大學附屬口腔醫(yī)院，光華口腔醫(yī)學院，廣東省口腔醫(yī)學重點實驗室，廣東省牙頜系統(tǒng)修復重建技術與材料工程技術研究中心，廣州 510055)

引導骨再生（guided bone regeneration，GBR）術是一種被廣泛應用于口腔種植和牙周臨床的技術，其通過屏障膜的使用，在牙齦軟組織與骨缺損之間建立生物屏障，阻擋上皮和成纖維細胞長入骨缺損區(qū)，為成骨細胞增殖、新骨形成提供一個相對封閉的環(huán)境，從而達到引導骨組織再生和定向修復的目的[1]。理想的引導骨再生屏障膜應具有良好的機械性能，包括良好的空間維持性能和臨床可操作性，良好的生物性能如生物相容性、生物活性、組織選擇性和抗菌性等，以適配復雜的口腔組織環(huán)境并促進新骨形成[1]。

在各類GBR 膜材料中，天然高分子材料來源的屏障膜，如膠原、明膠、殼聚糖、絲素蛋白等，生物相容性相對較好，但通常機械強度低、降解速度快，難以支撐大面積骨缺損的再生空間[2]，且功能較為單一。因此，人工合成功能性GBR 屏障膜材料的研發(fā)對于臨床具有重要意義。目前，人工合成可吸收聚合物膜的細胞親和性和骨傳導活性仍較弱[3]，且其降解過程可能釋放酸性副產(chǎn)物引起炎癥反應[4]，影響臨床效果。近年來，廣大學者從口腔軟硬組織固有的再生環(huán)境和再生過程出發(fā)，基于骨組織工程的策略，將骨再生相關分子、成骨活性細胞與支架材料三者復合，并結合先進的納米工程技術，調(diào)控材料的功能成分和理化結構，從而獲得可以適配組織再生過程各種活性分子、活性細胞、組織生長需求的新型功能屏障膜，以獲得更理想的臨床療效，滿足臨床更高的需求。本文就近年基于組織工程理論對GBR 功能屏障膜材料進行改性的技術及方法進行總結梳理，以期為廣大臨床及科研工作者提供參考。

1 功能成分調(diào)控

屏障膜在GBR 過程中不僅僅起到被動物理屏障作用，更能發(fā)揮主動的生物活性功能促進骨組織再生?；诠墙M織工程原理，通過改變屏障膜支架的成分和結構，可調(diào)控成骨細胞的黏附、增殖、分化，促進新生骨的沉積。其中，屏障膜功能成分的調(diào)控策略主要包括添加骨再生相關生長因子、生物活性骨替代材料、促成骨活性藥物或化學成分、骨免疫調(diào)控的金屬活性離子、抗菌成分等。

1.1 添加骨再生相關生長因子

如何調(diào)控多種具有不同生物活性的生長因子在骨再生的相應階段發(fā)揮作用，模擬自然成骨過程，是近代骨組織工程的主要研究熱點。屏障膜可以作為成骨相關生長因子的良好緩釋載體，形成生物活化功能性膜，促進成骨活性細胞的增殖和表達。目前常用的促骨組織生長因子主要有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、血小板源生長因子（platelet-derived growth factor, PDGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor, IGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor, TGF-β）等[5]。BMP是骨組織工程中應用和研究最廣泛的生長因子之一，具有促進間充質(zhì)干細胞定向分化增殖為成骨細胞的能力。它可以與各種具有不同性質(zhì)的GBR 載體膜結合，賦予膜促進骨再生的生物活性[6]。目前在屏障膜材料中添加生長因子的主要技術難點在于生長因子的活性保持、有效/安全濃度的控制和釋放控制。另外，生長因子的成本也是產(chǎn)品臨床轉(zhuǎn)化中需考慮的另一因素。

1.2 添加生物活性骨替代材料

將具有骨傳導性的骨替代材料如磷酸鈣、羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）、β-磷酸三鈣被加入屏障膜中，能起到促進成骨細胞的增殖和分化、增強新骨礦化沉積、促進骨組織再生的作用。研究報道磷酸鈣改性的絲基膜可檢測到更顯著的新骨形成[7]。還有研究使用電噴霧或超聲涂布方法對聚（D，L-乳酸）/聚（D，L-丙交酯-乙交酯）膜表層進行HA 納米粒子涂布，涂層聚合物膜顯示出更好的成骨細胞代謝活性[8]。自20 世紀60 年代后期以來，用于組織工程再生醫(yī)學的生物活性玻璃被廣泛開發(fā)和應用。生物活性玻璃具有良好的軟硬組織黏附性，以及骨傳導、骨誘導和促血管生成特性，被認為是第三代生物醫(yī)學材料[9]。將其通過表面涂層技術涂覆在生物屏障膜表面，可達到明顯的功能改善。Dau 等的研究已顯示通過旋轉(zhuǎn)噴涂法制備的二氧化硅增強納米HA 涂層膠原膜顯示出顯著提升的促血管化特性[10]。

1.3 添加促成骨活性藥物或化學成分

部分促成骨的藥物或化學成分可影響局部成骨微環(huán)境，從而調(diào)控成骨過程。雙膦酸鹽通過減弱破骨細胞活性來干擾骨轉(zhuǎn)換過程，從而減少骨破壞吸收。Vab Oirschot B 等報道了睪酮和阿倫膦酸鹽藥物涂層的PLA 膠原膜顯示出優(yōu)于無藥物對照組的骨再生效果[11]。還有部分研究報道了化學藥物辛伐他汀、化學分子N-甲基吡咯烷酮[12]和GlyT2-IN-1（Yoda1）[13]、生物活性提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯[14]等化學藥物應用于改良屏障膜性能的實驗，結果均顯示出一定的促骨再生效果。此外，一些其它動植物活性成分如BMP-2 相關肽P28，釉原蛋白和淫羊藿苷也已應用于骨組織工程[15]，表現(xiàn)出可應用于GBR 屏障膜改性的促成骨潛能?？傮w而言，目前關于藥物成分應用于屏障膜的研究較少且較為分散，在其研發(fā)過程中，藥物成分的生物安全性和細胞毒性需要重點關注，部分藥物促組織再生的具體機制還需更進一步探究。

1.4 添加骨免疫調(diào)控的金屬活性離子

近年來，功能性GBR 屏障膜的研發(fā)除了關注干細胞成骨分化的直接調(diào)控，還關注對干細胞分化的微環(huán)境尤其是免疫微環(huán)境的管理，通過創(chuàng)造利于成骨分化的局部微環(huán)境，誘導新骨的形成。研究表明，金屬活性離子如鋅（Zn）、鎂（Mg）、鈷（Co）和鍶（Sr）等具有良好的成骨調(diào)控和免疫調(diào)控作用[16]。在可吸收膠原膜降過程中，微量金屬活性離子的釋放可以調(diào)節(jié)局部的成骨微環(huán)境，促進骨再生。鋅是一種有效的骨免疫調(diào)節(jié)劑，影響巨噬細胞極化和成骨細胞分化[17]。有研究報道金屬有機框架晶體修飾的電紡不對稱雙層聚己內(nèi)酯/膠原（PCL/Col）膜實現(xiàn)了鋅離子的pH 響應性釋放，在體外和體內(nèi)均顯示骨誘導性和血管生成增強[18]?？傮w而言，金屬活性離子可賦予屏障膜活性功能，不易分解，作用效果較穩(wěn)定，作為骨免疫調(diào)控因子用于骨組織工程研發(fā)可吸收功能屏障膜具有良好應用前景。需注意的是，金屬離子的作用具有濃度依賴性，其釋放速率和濃度調(diào)控是優(yōu)化其在屏障膜中作用的關鍵環(huán)節(jié)。

1.5 添加抗菌成分

細菌雖然不直接參與骨組織再生過程，但細菌感染引起的炎癥反應會激活破骨細胞，抑制成骨細胞的生長，引發(fā)骨吸收。因此，在膜中添加抗菌成分能有效降低術后感染的風險，在一定層度上保障新骨的正常生成?？咕煞种饕ㄟ^涂層方式和結構載藥緩釋系統(tǒng)應用于功能屏障膜。聚乙二醇、超疏水結構涂層、生物膜基質(zhì)降解酶涂層、銀納米粒子涂層、二氧化鈦光活性涂層等物質(zhì)被廣泛用于抗菌屏障膜的制作[15]。靜電紡絲作為一種新的納米支架制備技術，可用于制備載藥緩釋系統(tǒng)。常用的抗菌藥物和化合物如阿司匹林、阿奇霉素、甲硝唑、抗菌肽等可通過靜電紡絲技術裝載進電紡納米纖維膜中，且可通過改變加工參數(shù)來調(diào)控藥物的裝載效率和釋放特性[19]。Boda 等人通過靜電紡絲法將一種負載抗菌肽D-GL13K 的氧化果膠的涂覆于殼聚糖膜上，結果顯示載有抗菌肽的殼聚糖膜具有優(yōu)異的抗菌性能[20]?？股睾推渌咕钚晕锏脑谄琳夏ぶ械母郊邮褂眯枰P注其耐藥性和細胞毒性，如何更好地負載抗菌成分、調(diào)控其特異性釋放和長時間發(fā)揮作用仍是研究熱點。

2 理化結構調(diào)控

基于組織工程原理，除了功能成分，屏障膜的孔隙結構、表面形貌、降解速度、膜層數(shù)結構、仿生礦化等都可在一定程度上調(diào)控細胞遷移、黏附等生理活動，最終影響GBR 技術的效果。

2.1 屏障膜的孔隙結構

孔隙結構是GBR 屏障膜的一個重要性質(zhì)，屏障膜材料的孔隙率和孔隙大小會影響長入細胞的類型，包括牙齦上皮細胞、成纖維細胞、免疫炎癥細胞、血管組織及骨組織細胞等。選擇合適的孔隙率和孔隙大小，對于促進骨組織的生長起著至關重要的作用。在膠原膜材料中，隨著孔隙率和孔隙大小的增加，巨噬細胞M2 相關標志物表達增加，而M1 相關的標志物表達下降[21]。據(jù)報道，e-PTFE膜5-30 μm 大小的孔隙容易導致細菌污染和軟組織的牢固附著。隨后開發(fā)的具有亞微米0.2 μm 孔徑的高密度(d)-PTFE，可避免此種現(xiàn)象[22]。Gutta 等研究提示鈦膜中超過1 mm 的大孔徑可以促進更好的骨再生[23]。目前臨床及實驗室報道的各類屏障膜的孔隙率和孔隙大小各不相同，最佳的膜孔隙率和孔隙大小也尚無定論，需要更加嚴格地控制實驗因素，通過進一步的系統(tǒng)研究去驗證。同時，膜的多孔性和滲透性在局部骨缺損區(qū)促進骨愈合的具體作用機制也需進一步探究。

2.2 屏障膜的降解速度

對于可吸收屏障膜，其降解速度應該與新骨的形成速度相匹配，以維持局部輪廓。天然膠原膜雖然具有良好的生物相容性，但仍存在降解不規(guī)則、降解速率過快、空間穩(wěn)定性差等問題，通常只能維持30 天左右，容易導致手術部位塌陷[24]。目前可有以下幾種方法改進：1）多層膜疊加獲得更加致密的結構以及更長的降解時間；2）通過各種方法增加膠原蛋白交聯(lián)度，從而降低降解速度；3）通過添加其他降解時間更長的生物材料，如生物陶瓷、碳和聚合物材料等；4）采用人工材料如PLA，PLGA，PCL 等，通過靜電紡絲等技術制備成納米纖維支架材料，延長降解時間，同時可獲得良好的比表面積、機械強度和仿生效果[25]。另外，更為理想的多功能GBR 膜材料還可充當藥物或生物分子的載體，降解速度可適配GBR 過程不同細胞的生長需求以及不同階段成骨和抗菌需求，因此，膜的成分、結構及降解行為也可根據(jù)不同的階段的組織再生需求去進行材料設計，從而達到理想的材料基因工程的理念。

2.3 多層屏障膜

設計不同功能和結構的多層屏障膜可賦予屏障膜更加豐富的性能，以滿足更加復雜的臨床要求。每層膜應具有不同的結構特性：內(nèi)層（疏松層）高孔隙率有利于成骨細胞的粘附和增殖，同時穩(wěn)定血凝塊，促進軟組織在雙層膜中的整合。外層（致密層）的孔隙率較小且強度大，阻止成纖維細胞向骨缺損區(qū)的遷移，允許干細胞和營養(yǎng)物質(zhì)通過，同時維持成骨空間。此外，雙層膜結構之間存在的間隙應能夠促進組織整合[26]。有研究利用靜電紡絲和光交聯(lián)技術制備了明膠甲基丙烯酰胺（gelatin methacrylamine，GelMA）/ 聚乙二醇二丙烯酸酯（poly ethylene glycol diacrylate，PEGDA）雙層膜。該膜具有纖維納米結構和水凝膠性質(zhì)的雙層結構，內(nèi)層具有高孔隙率而外層具有低孔隙率?？刂平宦?lián)時間和PEGDA 比例也可以調(diào)節(jié)雙層膜的物理性質(zhì)、降解速率、細胞粘附和增殖[26]。功能梯度膜（functionally gradient membrane, FGM) 也是一種特殊的多層屏障膜。其成分或結構呈連續(xù)或梯度分布，因此除了結構，其功能也呈梯度變化[27]。多層屏障膜是一種新的發(fā)展趨勢，可用于克服單一材料的不足。利用不同膜材料或不同制備技術，如3D 打印、空氣等離子體、靜電紡絲和光交聯(lián)的組合、紫外線照射或化學溶液浸漬和交聯(lián)的組合等，可制作不同結構不同特性的多層膜，使其發(fā)揮更加全面的作用。但另一方面，復雜的制備工藝和高制作成本一定程度上又限制了其生產(chǎn)和應用。

2.4 仿生礦化

仿生礦化，即模擬天然組織的化學成分和微觀結構，通過分子仿生合成、分子自組裝等技術，人為調(diào)控無機礦物在有機物模板上的沉積，從而制備出具有高度模擬生物礦化組織的顯微分級結構和優(yōu)異力學性能的無機有機復合材料[28]。膠原模板本身具備優(yōu)異的生物相容性，其所含的礦化鈣磷晶體可模擬天然骨組織的無機成分；與此同時，仿生礦化膠原材料本身具備的三維多孔結構又使其具有優(yōu)良的骨傳導性, 為血管和新生骨組織提供了良好的生長空間[29]。

通過仿生礦化的方法對膠原膜材料進行改進, 可獲得顯著提升的機械強度和骨傳導性等性能以適應臨床應用的需求。有研究通過偶聯(lián)高分子量聚丙烯酸可實現(xiàn)膠原類屏障膜的纖維內(nèi)自礦化，該仿生礦化膠原膜可通過激活線粒體動力學途徑促進間充質(zhì)干細胞的成骨分化，同時基于該仿生礦化策略可提高膠原基質(zhì)的剛度，為間充質(zhì)干細胞介導的骨組織再生提供有利的機械力學信號[30]。近期有研究報道了具有免疫調(diào)控作用的imRNA- 無定形磷酸鈣礦化前體介導的仿生礦化膠原膜，該材料不僅在骨缺損區(qū)域完成了快速礦化，還能通過激活JAK2/STAT3信號通路誘導巨噬細胞表型分化促進血管化骨再生進程[31]。

總之，仿生礦化可賦予屏障膜優(yōu)異的成分和結構特性，利于骨再生。此外，通過在仿生礦化膠原內(nèi)添加生物活性因子等還可進一步賦予其促進干細胞的黏附、增殖和成骨分化的能力，具有良好的應用前景。

3 電化學調(diào)控

骨組織修復和再生的過程需要多種生理信號，包括生物化學信號、機械信號和電信號，它們共同作用以保障組織形態(tài)和功能的恢復。天然骨組織本身具有壓電效應，它在響應機械活動時產(chǎn)生的電荷/電位能夠促進骨的生長。而電活性生物材料能夠直接對細胞傳輸電化學信號以誘導干細胞成骨分化和促進組織再生[32]。電活性生物材料可以分為壓電材料和導電材料。其中壓電材料由于其響應機械變形而產(chǎn)生電荷/電勢的能力，可以在骨缺損區(qū)形成仿生電學微環(huán)境，具有良好的骨誘導性，在骨組織工程領域顯示出巨大的潛力。

用于骨組織工程的壓電材料類型主要包括了人工聚合物如聚L-乳酸（poly L-lactide，PLLA）、聚偏氟乙烯（poly vinylidene fluoride，PVDF) 、聚偏氟乙烯-三氟乙烯（Poly vinylidene fluoride-trifluro ethylene，PVDF-TrFE）、聚羥基丁酸酯等；陶瓷類材料如HA、鈮酸鋰、鈦酸鋇、氮化硼納米管等[32]。近年來，通過使用具有壓電活性的屏障膜材料或者在屏障膜中添加電活性材料使其具有壓電活性已受到越來越多的關注。目前關于壓電材料應用于屏障膜的研究主要集中于人工聚合物材料和陶瓷材料及其復合材料。有研究證實，具備電活性的PLLA 膜具有可吸收性和良好的促成骨能力，化學改性后的PLLA 胺基生物膜可以促進細胞的黏附和增殖，增加體外實驗骨缺損區(qū)的新骨形成[33]。還有研究表明，含5%鈦酸鋇納米顆粒的PVDF-TrFE 膜具有和天然骨組織接近的壓電系數(shù)，可以誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化，能有效地促進血管化成骨[34]。通過調(diào)整壓電成分在屏障膜中的比例或者壓電膜本身的壓電系數(shù)，可改變膜材料表面及內(nèi)部的電學微環(huán)境，使其有利于新骨形成，從而改善骨缺損局部組織再生的進程，這也成為調(diào)控屏障膜性能的一種重要的電化學策略。壓電屏障膜材料的未來研究方向是對材料親水性、壓電性能和表面形貌進行改進，并結合藥物遞送和抗菌性能的提升，以及與干細胞的結合運用。

4 挑戰(zhàn)及展望

基于組織工程策略的新型功能性GBR 屏障膜研發(fā)，總體理念在于調(diào)控材料的功能成分和理化結構，以期獲得可以適配組織再生過程的局部再生微環(huán)境需求的新型功能屏障膜。隨著生物材料、納米技術、組織工程等的發(fā)展，新型GBR 屏障膜的研發(fā)內(nèi)容更加多元化，分支也更加廣泛，但目前尚無一種新型膜能完全滿足理想GBR 屏障膜的所有要求，關于屏障膜的研發(fā)，目前大部分研究也仍處于實驗室階段；同時，一些深入的分析研究也有待進行，如各種因子、成分負載于膜上作用的交互作用、時空效應和潛在機制等，確定合適的改性方法和材料的組合仍應是未來研發(fā)屏障膜的主要方向?？傊滦凸δ苄訥BR 屏障膜從實驗室材料設計、研發(fā)到最終臨床轉(zhuǎn)化仍有很長的路要走，但是遵循組織工程學的原理去進行材料設計將是未來重要的一種趨勢。

衷心感謝王小雙博士在本文文獻檢索及資料整理等方面所做的大量工作。