治療用噬菌體的優(yōu)點(diǎn)、問題與對策

◆作者：杭柏林 李雯琪 曹荔

◆單位：河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院

抗生素的負(fù)面作用日益嚴(yán)重，世界很多國家和地區(qū)逐漸禁止使用抗生素促生長劑，中國于2020 年開始禁止在飼料中添加任何抗生素。因此，抗生素替代品就受到了人們的廣泛關(guān)注。其中，噬菌體（bacteriophage，phage）是一種較好的抗生素替代品，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。噬菌體是感染、裂解細(xì)菌的病毒，在自然界中廣泛存在。根據(jù)裂解效應(yīng)的差異，可分為裂解性噬菌體（或稱烈性噬菌體、毒性噬菌體）和溶原性噬菌體（或稱溫和噬菌體）。裂解性噬菌體可直接裂解宿主細(xì)菌，導(dǎo)致其死亡。溶原性噬菌體大多數(shù)情況下會將其基因組整合到宿主菌的染色體上，并隨著宿主菌基因組的復(fù)制而復(fù)制，通常情況下并不裂解宿主菌。因此，臨床上常常使用裂解性噬菌體（下文中都簡稱為噬菌體）來預(yù)防和治療細(xì)菌性感染。噬菌體對真核細(xì)胞沒有毒害作用，在“后抗生素時代”被認(rèn)為是具有較好前景的抗生素替代品（侯忠余等，2022）。雖然噬菌體治療方法在20 世紀(jì)初已出現(xiàn)，但現(xiàn)在的“復(fù)興”趨勢卻是由細(xì)菌耐藥危機(jī)驅(qū)動而形成的。近年來，隨著細(xì)菌耐藥性的日益嚴(yán)重，噬菌體在對抗細(xì)菌感染方面的作用再次受到廣泛關(guān)注。目前，作為一種天然“抗菌藥物”，噬菌體在較多領(lǐng)域如養(yǎng)殖、食品、醫(yī)療等都有較好的應(yīng)用，被認(rèn)為是對抗致病菌的重要武器。本文主要就噬菌體的優(yōu)點(diǎn)、問題與對策進(jìn)行簡要介紹，希望為噬菌體制劑的臨床應(yīng)用與開發(fā)提供一些參考。

1 優(yōu)點(diǎn)

與抗生素相比，噬菌體具有很多優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)是噬菌體吸引人們研究與使用的“驅(qū)動力”。

1.1 特異性強(qiáng)

噬菌體一般只殺滅對應(yīng)宿主細(xì)菌，通常不會跨越種或?qū)俚慕缦蕖Ｊ删w能專一地引起宿主細(xì)胞的裂解而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，為致病菌的防控提供了一種新的手段（侯忠余等，2022）。這種特異性與細(xì)菌表面受體和噬菌體表面受體結(jié)合蛋白（反受體）的相互作用有關(guān)（Flayhan 等，2012）。雖然隨著噬菌體與宿主菌的相互作用以及研究的不斷深入，這種特異性或?qū)Ｒ恍詴饾u被“打破”，但相對于抗生素、抗菌肽、中藥制劑等抗菌物質(zhì)而言，噬菌體的特異性還是很強(qiáng)的。

1.2 安全、無殘留

噬菌體對人和動物沒有毒副作用，不會產(chǎn)生殘留（周艷等，2014；孫利廠等，2018），被認(rèn)為對人和動物是安全的（Yen 等，2017；呂霖等，2019；Rehman s等，2019）。噬菌體進(jìn)入機(jī)體后，對機(jī)體和內(nèi)源性組織的正常運(yùn)轉(zhuǎn)沒有影響（聶若男等，2019）。當(dāng)宿主菌被全部裂解后，噬菌體也會被機(jī)體的免疫系統(tǒng)所清除（Kortrlght 等，2019；李虹嬌等，2021），即噬菌體隨宿主菌的消亡而消亡（曹振輝等，2012），從而表現(xiàn)出無殘留的特點(diǎn)。因此，某些國家和地區(qū)已經(jīng)批準(zhǔn)了某些噬菌體制劑在臨床上的應(yīng)用。例如，歐洲的某些國家已經(jīng)使用某些噬菌體制劑用來治療人類皮膚金黃色葡萄球菌感染（Zhang 等，2015），美國FDA 已經(jīng)批準(zhǔn)李斯特菌噬菌體制劑在芝士和禽產(chǎn)品上作消毒用（Fischetti 等，2005）。

1.3 對環(huán)境友好

因?yàn)槭删w具有特異性，只能裂解特定的細(xì)菌。所以，噬菌體對自然生物群落中的細(xì)菌沒有干擾作用（龍門等，2016），對環(huán)境中的固有微生物沒有破壞作用（曹振輝等，2012）。因此，噬菌體也被認(rèn)為是有效且安全的生態(tài)環(huán)境凈化用生物制劑（葛展霞等，2018）?；诖?，噬菌體的應(yīng)用范圍將進(jìn)一步得到拓寬。

1.4 可穿透生物被膜，對耐藥菌有效

耐藥菌對人和動物相關(guān)疾病的治療與防控提出了挑戰(zhàn)。生物被膜是賦予細(xì)菌耐藥性的一個重要原因。而噬菌體可破壞細(xì)菌的生物被膜（Phee 等，2013）。噬菌體感染、裂解生物被膜外層的細(xì)菌，新形成的噬菌體穿透生物被膜進(jìn)入生物被膜內(nèi)層，繼續(xù)感染內(nèi)層的細(xì)菌，直至裂解完所有細(xì)菌（Khalifa 等，2016；楊羽等，2022）。噬菌體產(chǎn)生的解聚酶具有清除生物被膜的能力（Majkowska-Skmbek 等，2018）。噬菌體TSK1 處理培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌后可使其生物被膜量降低85% ～100%（Tabassum 等 ，2018）。當(dāng)噬菌體DM33 感染后，銅綠假單胞菌就失去了形成生物被膜的能力（Zegans 等，2009）。噬菌體可以隨細(xì)菌的進(jìn)化而對自身進(jìn)行修飾，使其具有裂解耐藥菌的能力（李虹嬌等，2021）。噬菌體在解決耐藥菌感染方面具有很好的應(yīng)用前景（Rehman s 等，2019），被認(rèn)為是潛在的“超級細(xì)菌的有效克星”（葛展霞等，2018）。這個特點(diǎn)是目前人們研究與開發(fā)噬菌體的主要“推動力”。

1.5 生產(chǎn)與使用的成本低

生產(chǎn)噬菌體的成本比較低（李帥華等，2020）。制備噬菌體制劑所需的原材料均非常容易獲得。噬菌體以指數(shù)方式進(jìn)行增殖，劑量放大效應(yīng)明顯（曹振輝等，2012）。所以，應(yīng)用時劑量不會很高。同時，不需要反復(fù)多次給藥（吳立婷等，2022）。因此，使用成本也相應(yīng)地不會很高。

1.6 劑型與給藥途徑多樣化

可以將噬菌體制成不同的劑型，如清洗液、軟膏、粉末、敷料、面霜、霧化劑等（舒飛鴻等，2022）。噬菌體應(yīng)用有多種給藥途徑。注射給藥途徑包括肌肉注射、腹腔注射、靜脈注射、皮下注射；局部給藥途徑包括皮膚局部給藥、眼局部給藥、耳局部給藥、口腔局部給藥、鼻腔局部給藥或霧化吸入、尿路給藥、直腸給藥等（舒飛鴻等，2022）?？诜o藥也是常見的給藥途徑，但要避免胃酸的影響。其他不常用途徑還包括浸浴、噴霧等。針對不同的感染部位以及局部感染或全身感染的差異，可選擇不同劑型的噬菌體制劑通過不同給藥途徑進(jìn)行應(yīng)用。這個特點(diǎn)非常有利于噬菌體的具體應(yīng)用。

1.7 不影響正常菌群

正常菌群對機(jī)體的健康具有重要作用。噬菌體不損害生物機(jī)體內(nèi)共存的微生物群落（聶若男等，2019；劉暢等，2022）。噬菌體具有很強(qiáng)的特異性，主要對其靶菌具有裂解作用，但對腸道內(nèi)的其他正常菌群沒有干擾作用（曹振輝等，2012；馬艷香等，2012）。這個特點(diǎn)也是噬菌體對人和動物安全的另一個方面。

1.8 來源廣泛

噬菌體在自然界中的分布非常廣泛，有細(xì)菌的地方就會有噬菌體，含量也非常豐富（聶若男等，2019；Brussow 等，2022）。因此，自然界中的噬菌體被認(rèn)為是可以利用的豐富的抗菌資源庫（Wommack 等，2000）。以臨床上的目標(biāo)菌為“釣餌”，可以從多種環(huán)境中“釣”（分離）到相應(yīng)的噬菌體，且分離率較高。例如，從多種食物如碎牛肉、豬肉等肉制品、奶制品、生菜等中分離出許多針對沙門菌的噬菌體（聶若男等，2019）。

2 問題

雖然噬菌體具有較多的優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)際應(yīng)用時也面臨一些問題。

2.1 突變的耐受菌

噬菌體與細(xì)菌之間存在著“此消彼長”的演化關(guān)系。在演化的過程中，細(xì)菌可能發(fā)生突變，通過阻止細(xì)菌吸附（Chen 等，2017）、流產(chǎn)感染（Hyman 等，2010）、CRISPR-Cas（Rostol 等，2019）等方式對原來有效的噬菌體產(chǎn)生耐受現(xiàn)象，從而使得原來有效的噬菌體變得無效。這是應(yīng)用噬菌體治療細(xì)菌感染時最常見的問題（林焱等，2022）。雖然噬菌體也會產(chǎn)生新的突變來應(yīng)對耐受細(xì)菌，但需要重新篩選和評估，而這個工作相當(dāng)繁瑣的。

2.2 存在免疫原性

噬菌體有著相對復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，具有較好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)人和動物產(chǎn)生較好的體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體中存在有抗噬菌體作用的中和抗體，而這種中和抗體是影響噬菌體治療效果的重要因素之一（王冉等，2019）。

2.3 菌株和毒株的不同導(dǎo)致效果的差異

不同細(xì)菌和不同噬菌體因來源不同而有著不同的生物學(xué)特性。對于一株給定的噬菌體針對臨床中同一種細(xì)菌的不同菌株時，其感染能力和抑菌能力會存在差異（Mahmoud 等，2018；林焱等，2022），就可能會出現(xiàn)不同的結(jié)果。因此，寬噬菌譜的噬菌體在臨床應(yīng)用時會遇到不同的菌株，從而會表現(xiàn)出裂解效果的差異。同樣，針對同一株細(xì)菌的不同噬菌體毒株對宿主菌的感染能力和抑菌能力也存在著差異，也可能會出現(xiàn)不同的結(jié)果。

2.4 環(huán)境中存在滅活噬菌體的理化因素

應(yīng)用時噬菌體必須是活的。而具體應(yīng)用時，環(huán)境中存在著各種影響噬菌體存活的物理性和化學(xué)性因素，如溫度、紫外線、有機(jī)溶劑、酸堿度（pH）等對噬菌體的裂解效果有著不同程度的影響。噬菌體P65 在30～45 ℃時有較好的裂解活性，在70 ℃時基本失活，在pH 4～10 時裂解活性較穩(wěn)定，在pH 2 時基本失活，隨著紫外線照射時間延長而裂解活性逐漸降低（侯忠余等，2022）。環(huán)境中可能存在著保護(hù)細(xì)菌的物質(zhì)或抗病毒物質(zhì)，如脂肪（GILL 等，2006）、乳清蛋白（O'FLAHERTY 等，2005）等，從而影響噬菌體的裂解效果（侯忠余等，2022）。只有能夠耐受體內(nèi)外環(huán)境的噬菌體才能走向應(yīng)用（肖小平等，2021）。

2.5 噬菌譜較窄

噬菌體的噬菌譜（或稱宿主譜）一般都較窄，從而表現(xiàn)出特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。然而，這也限制了噬菌體的應(yīng)用。雖然現(xiàn)在有一些研究報(bào)道稱分離到了對不同種屬細(xì)菌或?qū)δ撤N細(xì)菌的不同血清型菌株或不同種菌株具有裂解作用的噬菌體。例如，炭疽芽孢桿菌噬菌體AP631 還可以不完全裂解部分蠟樣芽孢桿菌（張慧娟等，2016）；噬菌體C6 對非致病性大腸桿菌（E.coli 22）和致病性大腸桿菌（包括大腸桿菌O157(E.coli W1)、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC W3、STEC W5)、腸致病性大腸桿菌（EPEC 143)）具有裂解作用（林焱等，2022）；噬菌體qbNJl4 對來自不同宿主且可致不同癥狀的14 株腸道內(nèi)大腸桿菌和13 株腸道外大腸桿菌具有裂解作用（姜珊等，2015）；某些噬菌體可跨屬感染細(xì)菌，如噬菌體L6jm 可感染豬霍亂沙門菌和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（張玉宇等，2020）；噬菌體LP8 可裂解產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌和威爾斯李氏桿菌（李天昊等，2022）。雖然可以通過將不同嗜菌譜的噬菌體制成噬菌體雞尾酒混合制劑來拓寬噬菌譜，但是，這個譜還不夠?qū)挕?/p>

2.6 可能存在的安全性問題

某些噬菌體的基因組中可能含有耐藥基因、毒力因子基因和整合酶基因，從而導(dǎo)致耐藥因子的傳遞。因此，在篩選到一株噬菌體后應(yīng)進(jìn)行全基因組測序，仔細(xì)分析后判斷其安全性。在制備噬菌體制劑時，如果僅簡單地通過過濾方法除去宿主菌，收集濾液進(jìn)行應(yīng)用，可能會因?yàn)榱呀夂笏拗骶募?xì)胞碎片、內(nèi)毒素、表達(dá)的毒力物質(zhì)、質(zhì)粒DNA 等導(dǎo)致對使用宿主的安全性問題。因此，應(yīng)用時應(yīng)使用精制的純度高的噬菌體。某些噬菌體在應(yīng)用到人或動物機(jī)體時，有時會出現(xiàn)輕微的或一過性的不適（舒飛鴻等，2022）。也許對于某些免疫力極低人員或極個別不同體質(zhì)的人或動物可能是不適合使用噬菌體的。某些裂解性噬菌體可向溶原性噬菌體轉(zhuǎn)變，進(jìn)而會改變宿主菌的毒力和致病性。

3 對策

解決上述這些問題，對加快噬菌體的開發(fā)與臨床應(yīng)用具有重要意義。

3.1 混合、聯(lián)用，開發(fā)噬菌體源物質(zhì)，應(yīng)對耐受菌

存在對噬菌體耐受的細(xì)菌是影響噬菌體應(yīng)用的一個重要因素。噬菌體雞尾酒制劑是幾種不同的噬菌體混合制成的制劑。當(dāng)耐受菌對其中的某種噬菌體產(chǎn)生耐受，但對另一種噬菌體不一定也產(chǎn)生耐受，從而可以延長制劑的使用時間。噬菌體聯(lián)合抗生素進(jìn)行使用，可以降低噬菌體和抗生素的使用劑量，降低細(xì)菌對噬菌體和抗生素形成耐受性的概率。噬菌體復(fù)制時產(chǎn)生的溶菌酶、解聚酶、內(nèi)溶素等對突變的耐受菌仍有較好的抗菌活性。噬菌體來源的內(nèi)溶素穩(wěn)定性高，細(xì)菌對其沒有耐受性，將可能成為替代噬菌體的新選擇（舒飛鴻等，2022）。

3.2 通過化學(xué)與基因工程方法，避開免疫原性的影響

因免疫原性而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體可能加快噬菌體的清除，從而影響噬菌體的使用效果。選擇低免疫原性的噬菌體可以避免適應(yīng)性免疫應(yīng)答，或者通過化學(xué)修飾來降低噬菌體的免疫原性，延長噬菌體在體內(nèi)的半衰期，或者將噬菌體進(jìn)行包被以規(guī)避中和抗體的作用，或者通過生物技術(shù)去除噬菌體上賦予免疫原性的蛋白，從而提高噬菌體的治療效果（王冉等，2019）。

3.3 因“株”設(shè)案，達(dá)其最大功效

噬菌體的毒株不同，使用效果會不同。在篩選噬菌體時，要將具體某株噬菌體的生物學(xué)特性充分了解清楚，然后根據(jù)這些特性設(shè)計(jì)具體的使用方案，才能達(dá)到相應(yīng)效果。

3.4 提高穩(wěn)定性，確保噬菌體活著

只有活的噬菌體才能發(fā)揮相應(yīng)的裂解功能。因此，要通過各種方法來確保噬菌體活著。通過多方篩選或通過基因工程方法改造以獲得高環(huán)境穩(wěn)定性的噬菌體，或者對噬菌體進(jìn)行包被技術(shù)處理如微囊化以提高噬菌體的存活率。

3.5 拓寬噬菌譜，擴(kuò)大應(yīng)用范圍

寬譜噬菌體具有重要的應(yīng)用價(jià)值（許方方等，2021）。如能像抗生素那樣具有較寬泛的抗菌譜，噬菌體將得到更廣泛的應(yīng)用。將針對不同菌的噬菌體表面的反受體通過基因工程方法展示在同一種噬菌體上，可擴(kuò)大噬菌體的嗜菌譜。在實(shí)驗(yàn)室條件下，將噬菌體A 與菌B 共培養(yǎng)使其發(fā)生共演化，篩選后獲得可裂解菌A 和菌B 的噬菌體AB，將噬菌體AB 再與菌C 共培養(yǎng)使其發(fā)生共演化，篩選后獲得可裂解菌A、菌B 和菌C 的噬菌體ABC，如此循環(huán)進(jìn)行“共演化-篩選”過程，將可能獲得寬嗜菌譜的噬菌體。

3.6 多點(diǎn)多面檢測噬菌體及其制劑，確保安全

噬菌體對人和動物的安全性直接決定了其臨床應(yīng)用價(jià)值。在分析完噬菌體的溶原/裂解性能后，對裂解性噬菌體可先進(jìn)行全基因組測序，分析其攜帶毒力因子和耐藥基因等情況，再對安全的裂解性噬菌體進(jìn)行精制?？山梃b動物病毒的純化方法來純化噬菌體（梁莉等，2010）?？傊?，在篩選可應(yīng)用的噬菌體時應(yīng)注意多方面的檢測與分析，最終選擇對人和動物安全的噬菌體。

4 展望

噬菌體在細(xì)菌性疾病治療與預(yù)防領(lǐng)域的應(yīng)用潛力巨大，值得深入開發(fā)與研究。雖然已經(jīng)有部分噬菌體制劑在生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)行應(yīng)用，但是還有許多工作需要進(jìn)一步完善。（1）我國關(guān)于噬菌體產(chǎn)品生產(chǎn)和制造的標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)法規(guī)還相當(dāng)少，需建立完善的噬菌體應(yīng)用安全評價(jià)體系以保證噬菌體生產(chǎn)應(yīng)用中每個環(huán)節(jié)的安全性。（2）在國家層面上加大對噬菌體治療的基礎(chǔ)研究投入，建設(shè)全國性甚至世界性的噬菌體庫，并進(jìn)行資源共享，提升噬菌體治療的價(jià)值。（3）“噬菌體+X（抗生素、抗菌肽、中藥制劑、疫苗、微生態(tài)制劑、后生元等）”的聯(lián)合使用可以拓寬噬菌體的應(yīng)用范圍，是值得深入開發(fā)研究的方向。（4）利用噬菌體展示技術(shù)開發(fā)新型噬菌體，以提高穩(wěn)定性或和拓寬嗜菌譜。（5）革蘭陰性的宿主菌被裂解后釋放的內(nèi)毒素可能對人和動物機(jī)體產(chǎn)生負(fù)面作用，如何規(guī)避這一問題，同時確保噬菌體的裂解活性，目前還需深入研究。

參考文獻(xiàn)：（略）