核酸檢測(cè)技術(shù)鑒別轉(zhuǎn)基因食品

肖付剛，谷蒙林，張堯軒，王德國(guó)，丁長(zhǎng)河，張國(guó)治

（1. 許昌學(xué)院 食品與藥學(xué)院，河南許昌 461000；2. 河南省食品安全生物標(biāo)識(shí)快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南許昌 461000；3. 河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450000）

0 引言

自1996年轉(zhuǎn)基因作物被大規(guī)模推廣以來(lái)，全球轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅猛發(fā)展。2019年，全球29 個(gè)國(guó)家種植了1.904 億hm2的轉(zhuǎn)基因作物，比1996年增加12 倍[1]。我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展也大力支持，國(guó)產(chǎn)抗蟲(chóng)棉、抗蟲(chóng)水稻、耐除草劑大豆等都取得了重大進(jìn)展，目前國(guó)內(nèi)已批準(zhǔn)進(jìn)入商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物有轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因番木瓜[2]。為保障消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)， 《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》 規(guī)定，我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)行最嚴(yán)格的零閾值強(qiáng)制標(biāo)識(shí)制度。轉(zhuǎn)基因檢測(cè)作為轉(zhuǎn)基因研究體系中的重要一環(huán)，重要性日益凸顯。在轉(zhuǎn)基因食品的鑒別中，常用的方法有核酸檢測(cè)、蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)、光譜分析、組學(xué)分析等。主要對(duì)近年來(lái)核酸檢測(cè)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用、原理、優(yōu)缺點(diǎn)等方面進(jìn)行綜述，以期從核酸檢測(cè)方面揭示轉(zhuǎn)基因技術(shù)的問(wèn)題，推進(jìn)核酸檢測(cè)技術(shù)的研究及在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 轉(zhuǎn)基因食品現(xiàn)狀

轉(zhuǎn)基因食品是通過(guò)提取基因片段進(jìn)行生物基因組重組或人工合成DNA 片段，轉(zhuǎn)入特定生物內(nèi)使其和生物基因重組，并表現(xiàn)出特定性狀和遺傳特性[3]。

轉(zhuǎn)基因食品可降低農(nóng)業(yè)成本，提高產(chǎn)量，為農(nóng)民乃至社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。但是也有人認(rèn)為外來(lái)基因會(huì)破壞食物中的營(yíng)養(yǎng)成分，存在安全隱患。為消除消費(fèi)者疑慮，國(guó)際權(quán)威組織已出臺(tái)多部評(píng)估轉(zhuǎn)基因食品安全性的條例，目前已經(jīng)形成一套科學(xué)、完善的轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)估體系[4]。其中，“實(shí)質(zhì)等同”原則是轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)的重要原則之一。據(jù)我國(guó)調(diào)查顯示，近50%的消費(fèi)者在購(gòu)買(mǎi)轉(zhuǎn)基因食品時(shí)會(huì)謹(jǐn)慎對(duì)比和選擇，因此對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識(shí)是很有必要的。

2 核酸檢測(cè)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品鑒別中的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，核酸檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)[5]、物種鑒別[6]、基因檢測(cè)[7]等方面。在轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)中，核酸檢測(cè)技術(shù)可以分為3 類(lèi)：基因芯片、PCR 技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。PCR 技術(shù)是國(guó)標(biāo)中常用的檢測(cè)方法[8]。

2.1 基因芯片技術(shù)

基因芯片又稱(chēng)DNA 芯片、生物芯片，是20 世紀(jì)80年代中期提出來(lái)的。其原理是將大量的DNA片段或者寡核苷酸片段密度有序地排列在固相載體上，稱(chēng)為基因芯片；同時(shí)提取待檢樣品的DNA（或mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到熒光標(biāo)記的cDNA） 探針，與芯片進(jìn)行雜交，通過(guò)掃描芯片上的熒光強(qiáng)度，應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析后可獲得樣品中大量的基因序列和表達(dá)水平的信息[9]。基因芯片技術(shù)是一種高通量檢測(cè)方法，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的報(bào)道已有很多，但是該方法耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、探針合成復(fù)雜，限制了其推廣使用[10-11]。

2.2 PCR 技術(shù)

PCR 技術(shù)原理類(lèi)似于DNA 的天然復(fù)制過(guò)程，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物使目的基因擴(kuò)增，包括變性、退火、延伸3 個(gè)過(guò)程。在轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)中，PCR 技術(shù)被廣泛使用，主要包括普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR）、多重PCR（Multiplex PCR），數(shù)字PCR（droplet digital PCR）?，F(xiàn)就其靈敏度、優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)如下。

常用核酸檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較見(jiàn)表1。

表1 常用核酸檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

為使試驗(yàn)結(jié)果達(dá)到更好的效果，研究人員更傾向于將幾種方法相結(jié)合。邢珍娟等人[16]建立的多重?zé)晒釶CR 不僅適用于轉(zhuǎn)基因玉米成分篩查，也適用于大豆、水稻等多種作物轉(zhuǎn)基因成分篩選鑒定，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.05%。劉二龍等人[17]建立的基于轉(zhuǎn)基因甜菜GTSB77 的雙重微滴數(shù)字PCR，在20 μL 反應(yīng)體系中定量下限（LOQ） 均為1.84 拷貝/ μL，檢測(cè)下限（LOD） 均為0.61 拷貝/ μL，可滿(mǎn)足相關(guān)部門(mén)對(duì)GTSB77 及制品的監(jiān)控、安全評(píng)價(jià)和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警等業(yè)務(wù)的精準(zhǔn)定量的需求。數(shù)字PCR 的最新研究是通用LNA 探針介導(dǎo)的液滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ULNAddPCR） 方法，可用于轉(zhuǎn)基因水稻T2A-1，T1C-19，G6H1 的定量分析[18]。

2.3 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種在PCR 的基礎(chǔ)上衍生出來(lái)的技術(shù)，能夠在恒溫條件下對(duì)目的基因擴(kuò)增。根據(jù)反應(yīng)原理不同，目前已發(fā)展的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP） 技術(shù)、重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA） 技術(shù)、交叉引物等溫?cái)U(kuò)增（Cross Prime Amplification，CPA） 技術(shù)、滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling Circle Amplification，RCA） 技術(shù)等。

主要等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其首次報(bào)道時(shí)間軸見(jiàn)圖1。

圖1 主要等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其首次報(bào)道時(shí)間軸

其中，LAMP 技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品的鑒別中應(yīng)用最為廣泛，其次是RPA 技術(shù)。CPA 技術(shù)是繼LAMP 技術(shù)后研究的一種新的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方面還鮮有報(bào)道。RCA 技術(shù)是一種簡(jiǎn)單高效的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，主要用于醫(yī)療診斷、環(huán)境檢測(cè)、食品安全等方面。梯形溶解溫度等溫?cái)U(kuò)增（Ladder-Shape Melting Temperature Isothermal Amplification，LMTIA） 技術(shù)是試驗(yàn)團(tuán)隊(duì)在LAMP 技術(shù)和PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的一種新型等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)具有高特異性和高敏感度，具有廣闊的應(yīng)用前景[19]。

2.3.1 LAMP 技術(shù)

LAMP 技術(shù)由日本學(xué)者Notomi T 等人[20]發(fā)明，而后不斷改進(jìn)，克服了傳統(tǒng)PCR 反復(fù)升降溫且檢測(cè)周期相對(duì)較長(zhǎng)的缺點(diǎn)。主要利用4～6 條特異性引物對(duì)靶標(biāo)序列6～8 個(gè)區(qū)域進(jìn)行識(shí)別，在Bst DNA 聚合酶催化作用下，恒溫條件（60～65 ℃） 中實(shí)現(xiàn)目的序列的批量擴(kuò)增[21]。LAMP 技術(shù)操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高，在轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、油菜中得到了廣泛應(yīng)用。最新研究，LAMP-TaqMan 能夠在65 ℃，20 min 內(nèi)擴(kuò)增DNA，已成功用于擴(kuò)增和檢測(cè)主要農(nóng)作物（大豆、玉米、水稻等） 的食物樣品中的DNA[22]。利用熒光染料，能夠可視化鑒別轉(zhuǎn)基因食品，熒光效果明顯，靈敏度甚至可低至0.005%，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[23]。

2.3.2 RPA 技術(shù)

RPA 技術(shù)是一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，對(duì)溫度有很強(qiáng)的適應(yīng)性，在常溫下即可完成擴(kuò)增。其反應(yīng)原理是在恒溫條件下，重組酶與擴(kuò)增引物結(jié)合形成復(fù)合物，并在雙鏈DNA 模板中尋找靶位點(diǎn)，定位后就會(huì)引發(fā)鏈交換反應(yīng)并啟動(dòng)DNA 合成，對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增[24]。該方法對(duì)設(shè)備要求不高，短時(shí)間內(nèi)即可完成擴(kuò)增。目前，已有多篇關(guān)于RPA 技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品鑒別的報(bào)道[25-26]。Wang X F 等人[27]提出了一種基于雙重重組酶聚合酶擴(kuò)增（DRPA） 的快速簡(jiǎn)便的轉(zhuǎn)基因作物現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)系統(tǒng)，并與橫向流動(dòng)生物傳感器（LFB） 相結(jié)合，20～30 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，縮短了檢測(cè)時(shí)間，減少污染。通過(guò)在RPA 反應(yīng)體系中加入熒光染料，可實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)果的可視化檢測(cè)。謝實(shí)龍等人[28]建立的MON89788 實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)方法，絕對(duì)檢測(cè)限可達(dá)到40 拷貝，檢測(cè)時(shí)間僅為實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的0.07～0.13 倍。

2.3.3 CPA 技術(shù)

CPA 技術(shù)是中國(guó)首個(gè)具有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的體外擴(kuò)增技術(shù)。CPA 技術(shù)是在Bst DNA 聚合酶、擴(kuò)增引物和2 條交叉引物的作用下完成擴(kuò)增。通過(guò)2 條交叉引物CPF 和CPR 的不斷雜交延伸和DNA 聚合酶的鏈置換作用，使得DNA 拷貝數(shù)不斷增加，從而達(dá)到基因擴(kuò)增的效果[29]。翟聰聰?shù)热薣30]針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63 的3'端邊界序列設(shè)計(jì)5 條CPA 引物進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，可以較好地區(qū)分轉(zhuǎn)基因水稻Bt63 和其他品系的轉(zhuǎn)基因水稻及其他轉(zhuǎn)基因生物，具有較好的特異性，檢測(cè)限可達(dá)到0.1%。CPA 技術(shù)較LAMP 技術(shù)而言不需要昂貴的設(shè)備，也避免了EB 等有毒物質(zhì)；較PCR 而言避免了二次污染，操作簡(jiǎn)單。但是該技術(shù)反應(yīng)體系復(fù)雜、方法不穩(wěn)定，容易造成假陽(yáng)性，應(yīng)用受到了限制。

2.3.4 LMTIA 技術(shù)

團(tuán)隊(duì)在PCR 和LAMP 技術(shù)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的（LMTIA） 技術(shù)[19]，與其他擴(kuò)增方法相比，LMTIA 技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)是非熱、非酶促單鏈模板擴(kuò)增[31-32]。團(tuán)隊(duì)已經(jīng)建立了LMTIA 檢測(cè)食品中植物源特異性基因建立內(nèi)標(biāo)方法，并用于檢測(cè)肉制品中植物成分，所建立的LMTIA 方法在最優(yōu)溫度57 ℃時(shí)，靈敏度為10 pg/μL玉米基因組與10 pg/μL 紅棗基因組，可檢出肉制品摻入0.1%的玉米淀粉[31]。下一步將開(kāi)展LMTIA 技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中的應(yīng)用研究，擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域。

3 結(jié)語(yǔ)

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因食品行業(yè)發(fā)展前景愈發(fā)光明。在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)日趨成熟的同時(shí)，也面臨著新的難題，比如轉(zhuǎn)基因食品的基因編輯信息不透明、DNA 片段化等，增加了檢測(cè)難度。開(kāi)發(fā)高靈敏度、低成本、高通量、檢測(cè)范圍更廣的轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)成為未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。對(duì)于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)方法的改進(jìn)，主要是簡(jiǎn)化DNA 的提取方法，避免因降解導(dǎo)致的假陰性；提升準(zhǔn)確度，開(kāi)發(fā)靈敏度更高、更便捷、成本更低，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的技術(shù)。新的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)，如電化學(xué)DNA 傳感器、CRISPR 基因編輯技術(shù)給轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。

總之，新的背景下，還需要提升消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的認(rèn)識(shí)，用科學(xué)、發(fā)展的眼光看待轉(zhuǎn)基因食品，相關(guān)部門(mén)也應(yīng)該建立更加嚴(yán)格的檢測(cè)機(jī)制，確保轉(zhuǎn)基因食品安全，發(fā)揮轉(zhuǎn)基因食品的最大價(jià)值。