轉(zhuǎn)基因作物培育中考點分析和應(yīng)用

邵江樵

(浙江省寧波市效實中學)

自1996年首例轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用以來,全球轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用快速發(fā)展。品種培育呈現(xiàn)代際特征,目前全球轉(zhuǎn)基因生物新品種已從抗蟲和抗除草劑等第一代產(chǎn)品,向改善營養(yǎng)品質(zhì)和提高產(chǎn)量的第二代產(chǎn)品,以及工業(yè)、醫(yī)藥和生物反應(yīng)器等第三代產(chǎn)品轉(zhuǎn)變。轉(zhuǎn)基因作物的種植不僅提高農(nóng)作物產(chǎn)量,并且通過減少農(nóng)藥、化肥的使用,在改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境方面也顯示出巨大的優(yōu)勢。

轉(zhuǎn)基因作物的培育需要經(jīng)過目的基因載體的構(gòu)建、載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌與植株共培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化植株的篩選和鑒定四個環(huán)節(jié)(如圖1)。以轉(zhuǎn)基因作物培育為情景的試題已成為選拔性考試中的熱點。

圖1 轉(zhuǎn)基因植物的培育示意圖

考點1:Ti質(zhì)粒的改造

Ti質(zhì)粒是農(nóng)桿菌介導基因轉(zhuǎn)化的重要部件,它是農(nóng)桿菌擬核區(qū)外的遺傳物質(zhì),為雙鏈環(huán)狀DNA分子,包括T-DNA區(qū)、毒性區(qū)(vir區(qū))、接合轉(zhuǎn)移區(qū)和復(fù)制起始區(qū)4部分(如圖2)。其中,T-DNA區(qū)和毒性區(qū)參與了外源基因的轉(zhuǎn)移整合。

圖2 Ti質(zhì)粒

T-DNA區(qū)是根瘤農(nóng)桿菌侵染植物細胞時,在相關(guān)蛋白的作用下被切割下來整合至植物基因組的一段DNA分子。該區(qū)段分布一些與激素合成相關(guān)的基因,其表達產(chǎn)物能引起植物細胞激素紊亂,進而導致在根莖交界處長出一團不規(guī)則的帽狀結(jié)構(gòu)——冠癭瘤的形成,嚴重影響植物的生長。

毒性區(qū)(vir區(qū))是位于T-DNA以外的一段DNA分子,其基因編碼的蛋白質(zhì)(如限制性核酸內(nèi)切酶等)在T-DNA轉(zhuǎn)移、整合中起輔助作用,其本身不會與植物基因組整合。

用于基因工程的載體分子量越大轉(zhuǎn)化率越低,Ti質(zhì)粒長度約200 kb左右,片段過大,不易操作。所以野生型Ti質(zhì)粒需去除T-DNA區(qū)中的致瘤基因才能應(yīng)用于植物基因工程。實踐中常見的操作是雙元載體系統(tǒng):

微型Ti質(zhì)粒含T-DNA;缺失vir基因;含有復(fù)制起點、標記基因和多克隆位點,能整合外源基因輔助Ti質(zhì)粒含一整套vir區(qū)基因;缺失T-DNA區(qū)

兩種質(zhì)粒構(gòu)建完成后,采用一定的方法將它們轉(zhuǎn)入同一株農(nóng)桿菌中,構(gòu)成雙元載體系統(tǒng),就能使T-DNA整合至植物基因組中。

應(yīng)用:植物被野生型農(nóng)桿菌感染后會產(chǎn)生瘤狀結(jié)構(gòu),主要原因是農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒中含有生長素合成基因(A)、細胞分裂素合成基因(B)(如圖3所示)。

圖3

為防止農(nóng)桿菌侵染植物細胞后使植物產(chǎn)生瘤狀結(jié)構(gòu),必須把T-DNA片段上的基因________(用字母表示)敲除或替換掉。

【參考答案】A、B

考點2:雙酶切

酶切的目的是使目的基因和Ti質(zhì)粒之間具有相同的黏性末端,便于在DNA連接酶的催化下形成重組的Ti質(zhì)粒。雙酶切可以避免目的基因和Ti質(zhì)粒的自身環(huán)化、避免反向連接,確保目的基因的順利表達。對兩種限制性核酸內(nèi)切酶的選擇需要考慮限制酶的識別序列,黏性末端、目的基因的轉(zhuǎn)錄方向和標記基因等。

應(yīng)用:目的基因和Ti質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點如圖4所示,為了獲得重組Ti質(zhì)粒,應(yīng)當挑選的限制性核酸內(nèi)切酶是________。

圖4

【參考答案】SalⅠ和KpnⅠ

【解析】為了使重組Ti質(zhì)粒含有標記基因——青霉素抗性基因,不能選擇限制酶ScaⅠ;又要切割目的基因左端,則必選限制酶SalⅠ;為切割目的基因的右端,在限制酶EcoRⅠ和KpnⅠ之間,需考慮目的基因表達的方向圖示,只能選擇限制酶KpnⅠ。

考點3:影響重組DNA分子(重組Ti質(zhì)粒)形成效率的因素

構(gòu)建好的基因表達載體需要包括目的基因、標記基因、啟動子、終止子和復(fù)制原點等。標記基因用于檢測目的基因是否導入,啟動子和終止子調(diào)控目的基因的表達,其中啟動子的作用是與RNA聚合酶結(jié)合驅(qū)使目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。重組DNA分子形成的效率受目的基因和載體的質(zhì)量和濃度、是否有互補的黏性末端、DNA連接酶的活性和量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和pH等因素的影響。

應(yīng)用:當載體和外源DNA用同樣的限制性內(nèi)切酶,或是用能夠產(chǎn)生________的同裂酶等切割時,所形成的DNA末端就能夠彼此相匹配,可以被DNA連接酶(T4連接酶)催化生成________,形成重組DNA分子。但是,當靶片段(外源DNA)的末端與載體不匹配時,必須轉(zhuǎn)換其中一個或兩個片段的末端,以便使之連接。

【參考答案】相同的黏性末端 磷酸二酯鍵

考點4:重組Ti質(zhì)粒導入時對農(nóng)桿菌的處理

細胞處于能吸收和容納外源DNA的狀態(tài)稱為感受態(tài),經(jīng)特定處理后處于感受態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞。處理常用的是氯化鈣法:先將快速生長的農(nóng)桿菌置于經(jīng)低溫(0℃)預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中,會造成細胞膨脹,同時Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)(介于液態(tài)與晶態(tài)之間的結(jié)構(gòu),既有液體的流動性,又有類似晶體結(jié)構(gòu)的有序性),促使細胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來,離開所在區(qū)域,誘導細胞成為感受態(tài)細胞。

當加入外源DNA后,Ca2+與外源DNA結(jié)合形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基-磷酸鈣復(fù)合物,并附著在細菌細胞膜的外表面上。再將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下經(jīng)短暫的熱脈沖處理(90 s),細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)會發(fā)生劇烈擾動,并隨機出現(xiàn)許多間隙(孔洞),致使細胞膜通透性增加,便于外源DNA分子進入感受態(tài)細胞。

由于細胞膜的流動性,這種短時熱沖擊所致的間隙(孔洞)又可以被細胞自身所修復(fù)。

細菌細胞壁的成分是肽聚糖,壁的多孔性允許水和一些化學物質(zhì)通過,大分子的物質(zhì)不能通過,而CaCl2溶液處理可以使細胞壁出現(xiàn)孔洞,從而提高細胞壁的通透性。

應(yīng)用:(浙江省2018年4月選考生物卷,節(jié)選)取CaCl2處理過的農(nóng)桿菌與重組質(zhì)粒在離心管內(nèi)進行混合等操作,使重組質(zhì)粒進入農(nóng)桿菌,完成________實驗。在離心管中加入液體培養(yǎng)基,置于搖床慢速培養(yǎng)一段時間,其目的是________。

【參考答案】轉(zhuǎn)化 使CaCl2處理過的農(nóng)桿菌恢復(fù)細胞的正常狀態(tài)

考點5:影響重組Ti質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌效率的因素

在轉(zhuǎn)化過程中,并不是全部受體細胞都會導入重組DNA分子,真正導入的只是少數(shù)細胞,影響重組Ti質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌效率的因素有①重組DNA的質(zhì)量和濃度;②農(nóng)桿菌的生長狀態(tài)與密度;③適宜的培養(yǎng)時間和條件等。

實驗證明,大于30 kb的重組質(zhì)粒將很難進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當加入外源DNA的量過多或體積過大時,則會使轉(zhuǎn)化率下降。一般DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細胞體積的5%,1 ng的cccDNA(共價閉環(huán)DNA)即可使50 ul的感受態(tài)細胞達到飽和。

最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液,不要用已經(jīng)多次轉(zhuǎn)接,或貯存在4℃的培養(yǎng)菌液。細胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細胞數(shù)在5×107個左右為佳,密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。

整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行,注意防止被DNA酶或雜DNA所污染,否則會影響轉(zhuǎn)化效率或引起雜DNA的轉(zhuǎn)入。整個操作均需在冰上進行,不能離開冰浴,否則細胞轉(zhuǎn)化率將會降低。

應(yīng)用:(浙江省2018年11月選考生物卷,節(jié)選)為提高將重組DNA分子導入受體細胞的效率,除考慮導入方法、篩選條件、防止污染外,還需考慮的主要因素有________________(答出2點即可)。

【參考答案】重組DNA的質(zhì)量和濃度、受體細胞的生長狀態(tài)與密度

考點6:篩選導入重組DNA分子(重組Ti質(zhì)粒)的農(nóng)桿菌

常用的方法為利用標記基因(抗性基因)在添加相應(yīng)抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選。

將目的基因?qū)胫参锛毎?采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。含有目的基因的農(nóng)桿菌可根據(jù)標記基因進行篩選。若農(nóng)桿菌在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上都可以生長繁殖,農(nóng)桿菌中________(填“是”或“否”)含有目的基因。原因是________。

【參考答案】否 在構(gòu)建重組質(zhì)粒時,為防止目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化、避免反向連接,可選用HindⅢ和SalⅠ兩種限制酶,這樣含有目的基因的質(zhì)粒中抗四環(huán)素的基因被破壞

考點7:農(nóng)桿菌侵染植物細胞的轉(zhuǎn)化過程

圖6 農(nóng)桿菌侵染植物細胞的轉(zhuǎn)化原理的示意圖

轉(zhuǎn)化過程如下:

①當植物受到創(chuàng)傷后,會分泌酚類化合物,吸引農(nóng)桿菌移向植物細胞,然后與植物細胞相關(guān)受體蛋白特異性結(jié)合。

②農(nóng)桿菌細胞膜上的相關(guān)受體蛋白結(jié)合酚類化合物后,使Ti質(zhì)粒上的毒性區(qū)(Vir區(qū))上的系列基因激活并表達出多種蛋白,包括DNA聚合酶和限制性核酸內(nèi)切酶等。限制性核酸內(nèi)切酶作用于T-DNA的底鏈上,將其切割形成單鏈T-DNA分子,單鏈T-DNA分子與特定蛋白結(jié)合形成不成熟T鏈復(fù)合物;另一些蛋白結(jié)合在農(nóng)桿菌與植物細胞之間形成具有轉(zhuǎn)運功能的通道,協(xié)助不成熟T鏈復(fù)合物和一些蛋白進入植物細胞中。在轉(zhuǎn)運途中,不成熟T鏈復(fù)合物和有關(guān)蛋白結(jié)合,構(gòu)成成熟T鏈復(fù)合物。

措姆嗚嗚地哭著，米九不停地揉搓著雙手，措姆的聲音又帶著濃重的鼻音：我本來想生個孩子證明了自己，他會讓我回去的，可萬萬沒想到，他在我隆起大肚子時，娶了個更年輕，更漂亮的，讓我徹底沒了回家的路。米九低低地嘆氣：姆姆，人生還很漫長，說不定他老了就后悔了，他就會把你接回家。措姆幽幽地：他都娶第三個老婆了，我還有什么盼頭？米九還是努力著讓措姆開心：也說不準，他前些天還給我打探你的消息呢！措姆哀怨：你就騙我吧，每次你都這樣說，可他看到我時躲得遠遠的，根本都不想見我。

③成熟T鏈復(fù)合物和一些植物細胞蛋白進一步識別結(jié)合,在植物細胞蛋白的協(xié)助下,經(jīng)核孔復(fù)合體到達細胞核,最終在一些特定植物蛋白的協(xié)助下,含有目的基因的T-DNA與植物細胞基因組完成整合。

整合具有隨機性:整合幾個目的基因,整合到哪一條染色體,整合到染色體上的位置都是隨機的。

應(yīng)用1:(浙江省2018年11月選考生物卷,節(jié)選)農(nóng)桿菌介導法是目前植物轉(zhuǎn)基因的常用方法,該方法的基本過程是農(nóng)桿菌感染植物時,________,并將其插入到受體細胞的基因組中。

【參考答案】攜帶目的基因的T-DNA轉(zhuǎn)移到受體細胞

應(yīng)用2:(浙江省2021年1月選考生物卷,節(jié)選)三葉青為蔓生的藤本植物,以根入藥。由于野生三葉青對生長環(huán)境要求非?？量?以及生態(tài)環(huán)境的破壞和過度的采挖,目前我國野生三葉青已十分珍稀。

依據(jù)基因工程原理,利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染三葉青帶傷口的葉片,葉片產(chǎn)生酚類化合物,誘導發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒上vir系列基因表達形成________和限制性核酸內(nèi)切酶等,進而從質(zhì)粒上復(fù)制并切割出一段可轉(zhuǎn)移的DNA片段(T-DNA)。T-DNA進入葉片細胞并整合到染色體上,T-DNA上rol系列基因表達,產(chǎn)生相應(yīng)的植物激素,促使葉片細胞持續(xù)不斷地分裂形成________,再分化形成毛狀根。

【參考答案】DNA聚合酶 愈傷組織

考點8:影響植物細胞轉(zhuǎn)化效率的因素

從農(nóng)桿菌介導法的轉(zhuǎn)化原理可知,農(nóng)桿菌的生長狀態(tài)、農(nóng)桿菌的菌液濃度、植物細胞對農(nóng)桿菌的敏感性(來源、發(fā)育狀態(tài)和基因型等)、共同培養(yǎng)的時間和溫度、共同培養(yǎng)的pH、侵染方式、超聲波、表面活性劑等因素會影響植物細胞轉(zhuǎn)化效率。提高轉(zhuǎn)化率的措施:①添加表面活性劑增強農(nóng)桿菌和植物細胞間的吸附能力;②人為提高酚類化合物的含量,更加高效地激活vir基因表達;③采用超聲波處理植物,使植物組織形成微傷口,增加農(nóng)桿菌的感染概率;④添加抗氧化劑去除植物細胞由于農(nóng)桿菌感染形成的過氧化物,減少植物組織培養(yǎng)中愈傷組織的褐化,提高轉(zhuǎn)化效率。

應(yīng)用:在利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物受體細胞的過程中,為了吸引農(nóng)桿菌移向植物受體細胞,需添加________物質(zhì)。

【參考答案】酚類

考點9:對宿主細胞的選用要求

宿主細胞應(yīng)具備的特點:①具有優(yōu)良性狀;②有較高的遺傳穩(wěn)定性;③細胞全能性表達充分;④易被農(nóng)桿菌侵染等。

應(yīng)用1:(浙江省2020年7月選考生物卷,節(jié)選)為獲得轉(zhuǎn)基因植株,農(nóng)桿菌侵染的宿主一般要選用具有優(yōu)良性狀、較高的遺傳穩(wěn)定性、________及易被農(nóng)桿菌侵染等特點的植物材料。若植物材料對農(nóng)桿菌不敏感,則可用________的轉(zhuǎn)基因方法。

【參考答案】細胞全能性表達充分 顯微注射

應(yīng)用2:(浙江省2022年6月選考生物卷,節(jié)選)為提高培育轉(zhuǎn)基因植株的成功率,植物轉(zhuǎn)基因受體需具有較強的________能力和遺傳穩(wěn)定性。對培養(yǎng)的受體細胞遺傳穩(wěn)定性的早期檢測,可通過觀察細胞內(nèi)________形態(tài)是否改變進行判斷,也可通過觀察分裂期染色體的________,分析染色體組型是否改變進行判斷。

植物轉(zhuǎn)基因受體全能性表達程度的高低主要與受體的基因型、培養(yǎng)環(huán)境、繼代次數(shù)和________長短等有關(guān)。同時也與受體的取材有關(guān),其中受體為________時全能性表達能力最高。

【參考答案】再生 細胞核 形態(tài)特征和數(shù)量 培養(yǎng)時間 受精卵

考點10:侵染后處理

與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后的外植體表面及淺層組織中常常共生大量農(nóng)桿菌,使轉(zhuǎn)基因植物容易生冠癭瘤,對外植體的正常生長會產(chǎn)生不利影響,必須進行脫菌培養(yǎng)以殺死和抑制農(nóng)桿菌的生長。

方法:把共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移到含抑菌劑——抗生素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)生長,實現(xiàn)脫菌(去除農(nóng)桿菌)和防止雜菌污染的目的。

選用的抗生素主要有青霉素類(羧芐青霉素、氨芐青霉素、青霉素g等)、頭孢霉素類(頭孢霉唑林鈉、頭孢霉哌酮鈉、頭孢拉定、頭孢霉西林鈉、頭孢霉曲松鈉等)和大環(huán)內(nèi)脂類(紅霉素、白霉素等),目前使用最多的是500 mg/L的頭孢霉素。

原理:各種抑菌劑對細菌的作用機理不盡相同,青霉素類抗生素與蛋白質(zhì)結(jié)合,抑制轉(zhuǎn)肽酶交聯(lián)反應(yīng),從而阻礙細胞壁粘肽的合成,使細菌的細胞壁缺損,菌體高滲膨脹裂解,進而誘導粘肽水解酶激活而溶菌;頭孢霉素類抗生素對細菌的作用機理與青霉素類相似;大環(huán)內(nèi)脂類抗生素是通過阻礙細菌蛋白質(zhì)合成來抑制細菌繁殖。

通常需5～6次繼代培養(yǎng),直至培養(yǎng)基不產(chǎn)生農(nóng)桿菌的菌落。

應(yīng)用:(浙江省2021年1月選考生物卷,節(jié)選)依據(jù)基因工程原理,利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染三葉青帶傷口的葉片,葉片產(chǎn)生酚類化合物,誘導發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒上vir系列基因表達形成DNA聚合酶和限制性核酸內(nèi)切酶等,進而從質(zhì)粒上復(fù)制并切割出一段可轉(zhuǎn)移的DNA片段(T-DNA)。T-DNA進入葉片細胞并整合到染色體上,T-DNA上rol系列基因表達,產(chǎn)生相應(yīng)的植物激素,促使葉片細胞持續(xù)不斷地分裂形成愈傷組織,再分化形成毛狀根。剪取毛狀根,轉(zhuǎn)入含頭孢類抗生素的固體培養(yǎng)基上進行多次________培養(yǎng),培養(yǎng)基中添加抗生素的主要目的是________。

【參考答案】繼代 殺滅發(fā)根農(nóng)桿菌

考點11:篩選轉(zhuǎn)化體

在目的基因?qū)胧荏w細胞時,并不是每個細胞的染色體上都會整合含目的基因的T-DNA,可以利用抗生素作為選擇劑,用于篩選轉(zhuǎn)化體。氨基葡萄糖苷類抗生素(卡那霉素、新霉素、潮霉素等)是常用的選擇劑。抗生素抗性基因是篩選轉(zhuǎn)基因植物常用而有效的標記基因,轉(zhuǎn)基因植物中所用的抗生素抗性基因包括nptⅡ(提供卡那霉素、新霉素抗性)、aph(4)-Ⅰ(提供潮霉素抗性)、bla(提供氨卞青霉素抗性)、aae(提供慶大霉素抗性)等。

選擇劑能夠?qū)D(zhuǎn)基因植物進行篩選實質(zhì)上是抗生素抗性基因起作用。由于不同植物的不同外植體對抗生素的敏感性不一樣,在轉(zhuǎn)化之前應(yīng)對選擇劑設(shè)置一系列的濃度梯度,找出既能有效抑制非轉(zhuǎn)化細胞生長,又對轉(zhuǎn)化細胞影響較小的篩選劑濃度。

應(yīng)用:通過生物工程技術(shù)對油菜進行改造,以得到含有基因A的油菜,流程如圖7。

圖7 轉(zhuǎn)基因油菜的培育示意圖

圖7過程④中要防止雜菌污染的原因是________?？梢酝ㄟ^在培養(yǎng)基中添加________作抑菌劑,理由是________。

【參考答案】雜菌會競爭培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì),還可能產(chǎn)生有毒有害物質(zhì) 適宜濃度的潮霉素 重組質(zhì)粒的T-DNA中含有潮霉素抗性基因,會與目的基因A一起插入油菜體細胞染色體的DNA上,它的成功表達使轉(zhuǎn)化細胞具有對潮霉素的抗性而成活,而雜菌與非轉(zhuǎn)化細胞由于潮霉素的作用死亡

考點12:目的基因在植物細胞中的檢測

分子水平:用同位素標記的目的基因作探針,使用核酸分子雜交技術(shù)檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄;用抗原—抗體雜交技術(shù)檢測目的基因指導的蛋白質(zhì)的合成。

個體水平:對個體進行抗性試驗。

應(yīng)用1:(浙江省2019年4月選考生物卷,節(jié)選)將抗病基因通過轉(zhuǎn)基因的方法導入植物的分生組織可獲得抗病性強的植株。若在試管苗期間用分子水平方法判斷抗病基因是否表達,應(yīng)檢測________(A.質(zhì)粒載體 B.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 C.抗性基因 D.病原微生物)

【參考答案】B

應(yīng)用2:圖8表示“華恢l號”抗蟲水稻主要培育流程:

圖8

組建理想的載體需要對天然的質(zhì)粒進行改造。圖9是天然土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖(示部分基因及部分限制酶作用位點),據(jù)圖分析人工改造質(zhì)粒時:

圖9

①用限制酶Ⅰ處理,其目的是:去除質(zhì)粒上的________和________(填基因),保證T-DNA進入水稻細胞后不會促進細胞的分裂和生長;要使抗蟲基因能成功表達,還應(yīng)插入________。

②若用限制酶Ⅱ分別切割經(jīng)過①過程改造的理想質(zhì)粒和帶有抗蟲基因的DNA分子,并構(gòu)成重組Ti質(zhì)粒。分別以含四環(huán)素和卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)已成功導入抗蟲基因的水稻胚細胞,觀察到的細胞生長的情況是:在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中________,含卡那霉素的培養(yǎng)基中________。