淫羊藿苷對環(huán)磷酰胺致小鼠卵巢早衰的影響

薛美昭 ，趙均

1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619；2.山西白求恩醫(yī)院，同濟(jì)山西醫(yī)院，山西 太原 030032

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40歲前因卵巢功能衰竭而出現(xiàn)月經(jīng)稀少或閉經(jīng)4個月以上的婦科內(nèi)分泌疾病，以閉經(jīng)、雌激素缺乏、促卵泡激素（FSH）水平升高為主要表現(xiàn)，常伴有出汗、焦慮、抑郁、記憶力減退等癥狀[1]。POF病因復(fù)雜，目前已知的致病因素包括染色體異常、自身免疫性疾病、病毒感染等[2]。環(huán)磷酰胺是臨床常用的烷化劑類化療藥物，其毒性可造成細(xì)胞DNA斷裂，導(dǎo)致DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成受阻。卵巢是環(huán)磷酰胺生殖毒性的主要靶器官，研究表明，卵巢對化療毒性非常敏感，化療藥物引發(fā)的POF占患病總?cè)藬?shù)的25%以上，許多化療患者卵巢功能受到嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致絕經(jīng)期提前，卵巢功能紊亂，甚至不育[3]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎虛是POF發(fā)生的根本原因，沖任不調(diào)為POF發(fā)病關(guān)鍵因素[4]，因此常采用補(bǔ)腎法調(diào)節(jié)激素水平，改善POF臨床癥狀[5]。淫羊藿為補(bǔ)腎助陽之要藥，在治療閉經(jīng)、不孕、POF等卵巢功能失調(diào)性疾病方面有顯著療效[6]。淫羊藿苷是淫羊藿的有效成分之一，對生殖系統(tǒng)具有較好的保護(hù)作用[7]。本研究以環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠POF模型，觀察淫羊藿苷對模型小鼠血清性激素水平、卵巢病理形態(tài)及卵巢組織基因表達(dá)的影響，揭示淫羊藿苷治療POF的作用機(jī)制，為中藥防治POF提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康雌性C57BL/6小鼠30只，6周齡，體質(zhì)量（18±1）g，購于山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于該動物中心屏障動物房，溫度（25±2）℃，濕度（55±2）%，光暗循環(huán)12 h，自由進(jìn)食飲水。本研究經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2019LL197）。

1.2 主要試劑與儀器

淫羊藿苷（貨號I8760，北京索萊寶），環(huán)磷酰胺（貨號C0768，德國Sigma），小鼠雌二醇（E2）ELISA試劑盒（貨號E-EL-0150c，武漢Elabscience），F(xiàn)SH ELISA試劑盒（貨號E-EL-M0511c，武漢Elabscience），多聚甲醛（貨號P1110，北京索萊寶），HE染色試劑盒（貨號G1120，北京索萊寶），Trizol（貨號DP424，北京天根），Rnase-free water（貨號R1600，北京索萊寶），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號AG11728，湖南艾科瑞生物），PCR檢測試劑盒（貨號Q711-03，南京諾唯贊）。臺式高速冷凍離心機(jī)（型號H1650R，湖南賽特湘儀），酶標(biāo)儀（型號Elx800，美國Bio-Tek），電泳儀（型號DYY-6C，北京六一儀器），凝膠成像儀（型號ChemiDocXRS+，美國Bio-Rad），核酸蛋白檢測儀（型號BioPhotometer D30，德國Eppendorf），熒光定量PCR儀（型號QuantStudio 7 Flex，美國ABI）。

1.3 分組、造模及給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后行陰道涂片，將30只動情周期正常的小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和淫羊藿苷組，每組10只。模型組和淫羊藿苷組腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg制備POF小鼠模型，1次/d，連續(xù)14 d，對照組注射等量生理鹽水。造模結(jié)束后次日，淫羊藿苷組予淫羊藿苷溶液（用生理鹽水制備成濃度為1 g/L溶液）25 mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)28 d。對照組和模型組灌胃等量生理鹽水。

1.4 一般狀況觀察

造模和給藥過程中，觀察小鼠活動情況、精神狀態(tài)、皮毛光澤度、對外界反應(yīng)的靈敏度、進(jìn)食量等情況，每周稱量并記錄小鼠體質(zhì)量變化。

1.5 ELISA檢測

分別于造模及干預(yù)結(jié)束后，摘眼球取血，血液室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，收集上層血清，ELISA檢測血清E2和FSH含量。

1.6 卵巢組織病理觀察

干預(yù)結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，取雙側(cè)卵巢，剝離周圍脂肪組織，稱量卵巢質(zhì)量。將一側(cè)卵巢用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，并進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢組織形態(tài)，并對各級卵泡數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。

1.7 卵巢組織mRNA轉(zhuǎn)錄組分析

取另一側(cè)卵巢，分別放入標(biāo)記好的凍存管中，迅速置于液氮中凍存。采用Trizol法提取總RNA，檢測RNA完整性、濃度及純度，質(zhì)控合格后送至北京諾禾致源科技股份有限公司，利用Illumina測序平臺進(jìn)行高通量測序及生物信息學(xué)分析。

1.8 RT-qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)mRNA

質(zhì)檢合格的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±SE表示，組間比較用方差分析，方差齊用Duncan檢驗(yàn)，方差不齊用多重比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷對模型小鼠一般狀況的影響

對照組小鼠精神狀態(tài)良好，活動敏捷，皮毛光滑，反應(yīng)靈敏；模型組小鼠隨造模時間延長，進(jìn)食量逐漸減少，形體消瘦，反應(yīng)遲鈍，皮毛黯淡，體質(zhì)量較對照組減輕；淫羊藿苷組小鼠進(jìn)食量增加，反應(yīng)較敏捷，皮毛稍有光澤，體質(zhì)量較模型組增加。

2.2 淫羊藿苷對模型小鼠血清雌二醇、促卵泡激素含量的影響

與對照組同一時點(diǎn)比較，模型組和淫羊藿苷組小鼠14 d血清E2含量顯著減少，F(xiàn)SH含量顯著增加（P<0.05），模型組小鼠42 d血清E2含量顯著減少，F(xiàn)SH含量顯著增加（P<0.05）；與模型組同一時點(diǎn)比較，淫羊藿苷組小鼠42 d血清E2含量顯著增加，F(xiàn)SH含量顯著減少（P<0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血清E2和FSH含量比較（±SE）

表2 各組小鼠血清E2和FSH含量比較（±SE）

注：與同一時點(diǎn)對照組比較，*P<0.05；與同一時點(diǎn)模型組比較，#P<0.05

組別對照組模型組淫羊藿苷組只數(shù)10 10 10 E2/（pg/mL）14 d 52.57±1.76 30.89±2.14*32.67±1.07*42 d 54.25±1.65 29.21±1.78*48.11±1.56*#FSH/（ng/mL）14 d 3.08±0.11 4.68±0.58*4.73±0.52*42 d 3.17±0.12 4.70±0.57*3.31±0.60#

2.3 淫羊藿苷對模型小鼠卵巢質(zhì)量及病理形態(tài)的影響

與對照組比較，模型組小鼠卵巢質(zhì)量顯著減少（P<0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組小鼠卵巢質(zhì)量顯著增加（P<0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠卵巢質(zhì)量比較（±SE，mg）

表3 各組小鼠卵巢質(zhì)量比較（±SE，mg）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別對照組模型組淫羊藿苷組只數(shù)10 10 10卵巢質(zhì)量12.2±2.1 7.3±1.7*11.6±1.9#

HE染色顯示，對照組小鼠卵泡發(fā)育正常、生長活躍，可見各級卵泡，卵泡液豐富，顆粒細(xì)胞層次多；模型組小鼠各級卵泡數(shù)目減少，顆粒細(xì)胞層次少，卵巢明顯萎縮；淫羊藿苷組小鼠顆粒細(xì)胞層次增加，各級卵泡數(shù)量較模型組明顯增多。見圖1。

圖1 各組小鼠卵巢組織形態(tài)（HE染色，×40）

與對照組比較，模型組小鼠原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡數(shù)量均顯著減少（P<0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組小鼠原始卵泡、初級卵泡和成熟卵泡數(shù)量均顯著增加（P<0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠各級卵泡數(shù)比較（±SE，個）

表4 各組小鼠各級卵泡數(shù)比較（±SE，個）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別對照組模型組淫羊藿苷組只數(shù)10 10 10原始卵泡280.0±19.9 183.7±10.5*213.3± 9.8#初級卵泡147.0±12.1 67.0±12.3*110.0± 9.6#次級卵泡72.0±7.6 35.3±6.3*50.7±4.3成熟卵泡65.3±7.2 31.3±1.9*46.7±8.4#

2.4 淫羊藿苷對模型小鼠基因轉(zhuǎn)錄組的影響及差異基因RT-qPCR驗(yàn)證

對模型組/對照組、淫羊藿苷組/模型組卵巢組織基因表達(dá)進(jìn)行分析，以|log2模型組/對照組|≥1為篩選條件，結(jié)合P<0.05，共篩選出8個與卵巢組織功能相關(guān)的基因。與對照組比較，模型組小鼠卵巢組織Mafg、Gcnt3基因表達(dá)上調(diào)，Oas1h、Smc1b、Mov10l1、Oosp2、Tbpl2和DynAP基因表達(dá)下調(diào)（P<0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組小鼠卵巢組織上述基因表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05）。結(jié)果見表5。

表5 各組小鼠卵巢組織差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

基于轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，選擇5個基因（Gcnt3、Mov10l1、Oosp2、Tbpl2和DynAP）通過RT-qPCR進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與高通量測序結(jié)果一致。結(jié)果見表6。

表6 各組小鼠卵巢組織Gcnt3、Mov10l1、Oosp2、Tbpl2和DynAP基因表達(dá)比較（±SE）

表6 各組小鼠卵巢組織Gcnt3、Mov10l1、Oosp2、Tbpl2和DynAP基因表達(dá)比較（±SE）

注：與模型組/對照組比較，*P<0.05

基因名稱Gcnt3 Mov10l1 Oosp2 Tbpl2 DynAP模型組/對照組10.82±0.85 0.05±0.00 0.24±0.01 0.19±0.03 0.12±0.00淫羊藿苷組/模型組0.42±0.01*4.31±0.04*2.28±0.07*2.51±0.39*3.38±0.24*

3 討論

根據(jù)POF發(fā)病特點(diǎn)，可將其歸中醫(yī)學(xué)“血枯”“不孕”“經(jīng)水早斷”等范疇，相似證治散見于“閉經(jīng)”“經(jīng)水不通”“月經(jīng)后期”等[8]。腎藏精，主生長、發(fā)育與生殖。腎中精氣充盛，天癸成熟，月經(jīng)來潮，標(biāo)志著女性卵巢生殖周期活動開始；腎中精氣衰退，天癸耗竭，月經(jīng)閉絕，提示女性卵巢生殖功能結(jié)束。POF病機(jī)多為腎中精血不足，陰陽失調(diào)，命門火衰所致。中醫(yī)采用補(bǔ)腎法治療POF，可有效改善和恢復(fù)卵巢功能[5]。藥理研究表明，淫羊藿中的黃酮類化合物作為其最主要的有效成分，具有多種生物活性[9]，其中，淫羊藿苷占比較大。多項研究表明，淫羊藿苷可增加堿性磷酸酶活性，降低抗酒石酸酸性磷酸酶活性，刺激E2產(chǎn)生；淫羊藿苷可調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸功能，已被廣泛應(yīng)用于月經(jīng)不調(diào)、POF等疾病的治療中[10]。

環(huán)磷酰胺對卵巢具有較強(qiáng)的毒副作用。本實(shí)驗(yàn)利用環(huán)磷酰胺建立POF小鼠模型，與對照組比較，模型組小鼠卵巢質(zhì)量顯著下降，血清E2含量顯著減少，F(xiàn)SH含量顯著增加，同時卵巢組織各級卵泡數(shù)量顯著減少，表明環(huán)磷酰胺能夠破壞小鼠卵巢結(jié)構(gòu)，降低卵巢儲備功能。而使用淫羊藿苷治療后，小鼠卵巢質(zhì)量顯著增加，E2含量顯著增加，F(xiàn)SH含量顯著減少，原始卵泡、初級卵泡和成熟卵泡數(shù)量均顯著增加。表明淫羊藿苷通過降低模型小鼠血清FSH水平、提高E2水平，增加大鼠卵巢質(zhì)量和卵泡數(shù)量，從而增強(qiáng)卵巢儲備功能，對環(huán)磷酰胺所致小鼠POF有明顯緩解作用。

對各組小鼠卵巢組織基因表達(dá)譜進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)水平顯著改變的均是參與編碼生殖細(xì)胞發(fā)生和生長關(guān)鍵蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子的基因。Mafg是編碼含亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子，該基因在致癌因子等刺激下高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞惡化并縮短存活時間[11]。Gcnt3編碼黏連蛋白合酶，在受到病毒等外界刺激后能夠通過ERK信號通路促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖和遷移[12]。本實(shí)驗(yàn)中，Mafg和Gcnt3基因在模型組小鼠卵巢組織表達(dá)顯著上調(diào)，推測卵巢組織受到環(huán)磷酰胺刺激后細(xì)胞的惡化進(jìn)程加快，與文獻(xiàn)結(jié)果[11-12]一致。而淫羊藿苷干預(yù)后，Mafg和Gcnt3基因表達(dá)均有所下降。Oas1h基因編碼寡聚核苷酸合成酶，參與細(xì)胞因子TNF/NF-κB信號通路，調(diào)控生殖細(xì)胞對病毒感染的免疫反應(yīng)[13]。Smc1b基因編碼減數(shù)分裂相關(guān)的黏連蛋白，調(diào)控姐妹染色單體配對及阻止端?？s短，從而維持基因組的穩(wěn)定性[14]。Mov10l1基因編碼RNA解旋酶，屬于卵巢細(xì)胞的特定表達(dá)酶，參與調(diào)控卵巢發(fā)育和配子形成過程[15]。Oosp2基因編碼與透明帶相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白，在女性生育力進(jìn)程中起關(guān)鍵作用，該基因缺失表現(xiàn)為生育力降低[16]。Tbpl2基因編碼與TATA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，該蛋白與TFⅡA形成復(fù)合體調(diào)控與卵母細(xì)胞生長相關(guān)基因的表達(dá)[17]。DynAP基因編碼一種定位于高爾基體脂膜的跨膜蛋白，能夠激活A(yù)KT信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，當(dāng)細(xì)胞中缺失DynAP基因時則會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。上述6個基因在模型組小鼠卵巢組織表達(dá)顯著下調(diào)，表明卵巢細(xì)胞受到環(huán)磷酰胺刺激后對外部刺激的免疫反應(yīng)、基因組的穩(wěn)定性、生殖細(xì)胞分裂與增殖能力均受到嚴(yán)重?fù)p傷。淫羊藿苷干預(yù)后，以上基因表達(dá)水平明顯恢復(fù)，表明淫羊藿苷對環(huán)磷酰胺造成的卵巢損傷有明顯的治療作用。

綜上所述，淫羊藿苷可通過調(diào)控編碼卵巢細(xì)胞發(fā)生和生長相關(guān)蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子的基因表達(dá)，升高血清E2并降低FSH激素水平，增加卵巢質(zhì)量，增加原始卵泡、初級卵泡和成熟卵泡數(shù)量，進(jìn)而對POF起到治療作用。