蟲草素的抗腫瘤作用機制研究進展

方唯煒，應漢杰，蔣敬庭

腫瘤的發(fā)病率和死亡率不斷升高，其中肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌和乳腺癌是最常見的腫瘤，已成為主要死因[1]。腫瘤的主要特征是不受控制、侵襲性的細胞生長，這是由腫瘤抑制基因的下調和（或）腫瘤促進基因的上調驅動的[2]。目前常見的腫瘤治療方法包括手術、化療、放療、靶向療法和免疫療法等，然而這些療法主要適用于患有局部病灶或對特定治療敏感的腫瘤患者，因此單一種類的療法具有很大的局限性[3]。

蟲草屬（Cordyceps）是一類寄生于節(jié)肢動物的真菌，蟲草通過調節(jié)寄主的生命周期來逃逸寄主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，從而達到生存和繁殖的目的[4]。目前針對冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）和蛹蟲草（Cordyceps militaris）的研究最為廣泛。冬蟲夏草因其特殊的生命周期而得名，其常被用作傳統(tǒng)中藥并發(fā)揮多種藥理活性[5]。蛹蟲草由子實體和菌核兩部分組成，其子實體中含有各種活性成分，包括蟲草素、腺苷、蟲草多糖等[6]。蟲草素又稱 3'-脫氧腺苷，是一種由腺嘌呤和脫氧戊糖組成的腺苷衍生物。蟲草素由Cunningham 等[7]首次從蛹蟲草中分離得到，是第一個從真菌中分離的核苷類抗生素。在傳統(tǒng)工藝中，蟲草素主要從天然的蛹蟲草中提取，產量、純度較低。隨著提取技術的提升，目前蟲草素的主要合成方法包括化學合成、微生物發(fā)酵、體外合成和生物合成。由于合成生物學的廣泛應用，蟲草素的生物合成途徑得到闡明，促進了蟲草素的大規(guī)模生產和商業(yè)化[8]。雖然蟲草素最早被用作腫瘤化療藥物，但是蟲草素的抗腫瘤機制尚未完全清楚，其誘導的信號通路機制有待進一步研究[9]。

腺苷是一種信號分子，由能量消耗過程中 ATP 降解產生，其濃度的改變會對脈管系統(tǒng)、免疫逃逸和腫瘤生長產生深遠的影響[10]。腺苷通過其受體抑制 NK 細胞、DC 細胞等發(fā)揮功能，同時增強免疫抑制細胞的活性，參與腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）免疫耐受的形成。同時，腺苷作用于血管內皮細胞及基質細胞，促進 TME 新生血管的形成，為腫瘤轉移提供必要條件[11]。腺苷通路的組成主要包括參與 TME 中腺苷生成和信號傳導的胞外核苷酸酶（CD39 和 CD73）和腺苷受體（A1R、A2AR、A2BR和 A3R）[12]。目前，針對該通路的抗腫瘤藥物正在作為單一藥物進行研究，并且以與抗 PD-1 或抗 PD-L1 療法聯(lián)合的治療策略進行臨床試驗（NCT02503774、NCT02740985）。腺苷類似物包括修飾的腺嘌呤和腺苷的核糖環(huán)，與腺苷相比，腺苷類似物有時具有更高的生物活性和受體親和選擇性[13]。就目前的研究來看，蟲草素作為一種腺苷類似物，在腫瘤治療中并未產生和腺苷一樣的免疫抑制效果。相反，其抑制腫瘤細胞生長、侵襲和轉移，其中具體機制有待進一步研究。

1 蟲草素抑制腫瘤生長的潛在機制

1.1 抑制核酸生物合成，終止蛋白質翻譯

研究表明，蟲草素進入細胞并轉化為結構與 AMP、ADP、ATP 相似的磷酸鹽形式（一磷酸蟲草素、二磷酸蟲草素和三磷酸蟲草素），并且抑制細胞內 RNA 聚合酶 I、II、III 的活性，導致 RNA 鏈合成的終止[14-15]。在哺乳動物成纖維細胞中，蟲草素進入細胞后可減少部分 mRNA 的poly(A) 尾巴長度，抑制 3' 端mRNA 的加工，從而阻滯RNA 的合成；在 HeLa 細胞中，通過測量經蟲草素處理后的放射性氨基酸摻入，表明蟲草素是蛋白翻譯的強抑制劑[16]。有研究證實經過腺苷激酶磷酸化后的蟲草素存在較高的生物活性，在多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）中，由于蟲草素的化學結構缺少 RNA 鏈延伸所需的 3'-羥基，導致 MM 細胞的 RNA 合成水平下降，造成 MM 細胞死亡[17]。目前已有多項研究對蟲草素的作用機制進行探討。

有研究發(fā)現(xiàn)，蟲草素的作用機制是劑量相關的：在低劑量下抑制多聚腺苷磷酸化；在高劑量下激活5'-腺苷一磷酸活化蛋白激酶（5'-adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）[16]。AMPK 是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細胞內能量代謝穩(wěn)態(tài)的主要調節(jié)因子[18]。研究表明，蟲草素以一磷酸蟲草素的形式激活細胞中的AMPK 信號通路[15-16]，抑制哺乳動物雷帕霉素靶點復合物 1（mammalian target-of-rapamycin complex-1，mTORC1），終止蛋白質的翻譯，從而抑制肺癌細胞的生存、遷移和侵襲[19]。

1.2 誘導腫瘤細胞凋亡、促進自噬

細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種形式，通常由內源性或外源性刺激造成；內源性刺激主要包括活性氧和內質網應激，而外源性細胞凋亡主要由死亡受體（death receptor，DR）介導[20]。一項研究證實蟲草素可能通過 PLC/PKC 通路誘導小鼠間質瘤細胞凋亡，但同時該研究結果顯示 PKC 抑制劑只能抑制少數細胞死亡，提示其他途徑可能也參與蟲草素誘導細胞凋亡的過程[21]。據報道，蟲草素參與由 DR 介導的外源性細胞凋亡，主要是通過其誘導 DR 下游活化的caspase-8 直接切割并激活 caspase-3，啟動 caspase 級聯(lián)反應[22-23]。Lee 等[22]的研究中，經過蟲草素治療的人結腸癌細胞 HT-29 中 DR3、caspase-8 和裂解的 caspase-1 蛋白表達增加，揭示了蟲草素可通過 DR3 途徑誘導細胞凋亡。在多項研究中，蟲草素誘導由 Bax 易位觸發(fā)的內在凋亡途徑，導致細胞色素 c 由線粒體向細胞質釋放，激活caspase-9[24-25]。

腺苷受體（adenosine receptors，ARs）在細胞存活和死亡的調控中起著重要作用，腺苷 A3 受體的活化能夠抑制腫瘤的生長，故可作為一種治療腫瘤的靶標[26]。有研究證實[27]蟲草素對小鼠黑色素瘤和肺癌細胞系的生長顯示出顯著的抑制作用；針對機制的反向驗證證實在使用選擇性腺苷A3 受體拮抗劑后，蟲草素對腫瘤生長的抑制作用被減弱：表明蟲草素通過刺激腫瘤細胞上的腺苷 A3 受體對小鼠黑色素瘤和肺癌細胞的生長具有抑制作用。在卵巢癌的研究中，Cui 等[28]發(fā)現(xiàn)蟲草素通過下調 C-C 趨化因子配體 5（C-C motif chemokine ligand 5，CCL5）來抑制 AKT 介導的 NF-κB 轉錄因子的激活，進而激活 JNK 信號通路引發(fā)細胞凋亡。MAPK 通路涉及多種蛋白，如細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERKs）、c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNKs）、p38 MAP 激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）[29]。有研究證實，抑制 p38 MAPKs 可有效下調蟲草素治療后的小鼠睪丸間質瘤細胞凋亡，提示 p38 通路可能在蟲草素誘導的MA-10 細胞凋亡中起關鍵作用[30]。Baik 等[31]的研究證實，使用 ERK 抑制劑、JNK 抑制劑和 p38 MAPK 抑制劑可以削弱蟲草素對人膠質母細胞瘤 U87MG 細胞系的抑制作用，表明 MAPK 通路可能參與由蟲草素誘導的對 U87MG細胞增殖的抑制和凋亡的促進。

自噬是一種從酵母到哺乳動物共存的保守進化的分解代謝機制，主要通過溶酶體途徑降解細胞質成分和細胞器[32]。當腫瘤細胞遇到 DNA 損傷、缺氧、饑餓或化療藥物時，AMPK 通路被激活，從而驅動自噬。自噬被證實具有促進、抑制的雙重作用：在腫瘤發(fā)生的早期抑制腫瘤生長，但在腫瘤發(fā)生和治療的后期促進腫瘤進展[33-34]。因此，自噬可以作為各個階段腫瘤預防和治療有效干預策略，限制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。蟲草素通過自噬機制可能在腫瘤治療過程中發(fā)揮重要作用。在卵巢癌細胞中，蟲草素通過抑制 β-連環(huán)蛋白信號通路來激活 Dickkopf 相關蛋白 1（dickkopf-related protein 1，Dkk1）相關的自噬；并且蟲草素通過誘導卵巢癌細胞自噬來促進 caspase-3 的裂解，促進凋亡[35]。另一項研究表明，蟲草素通過平衡核苷轉運蛋白（equilibrative nucleoside transporters，ENT1）穿過卵巢癌細胞膜并激活 AMPK，活化的 AMPK 向下游靶蛋白發(fā)出信號以誘導自噬，引起細胞死亡[36]。由于微管相關蛋白輕鏈 3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）信號的積累可能是加速自噬流或阻斷自噬降解所致，一項研究證實經蟲草素治療后人妊娠絨毛膜癌 JAR 細胞中的 LC3 信號顯著增加，說明蟲草素加速 JAR 細胞自噬。并且該研究用蟲草素和自噬抑制劑氯喹共同處理 JAR 細胞，在此情況下細胞存活增加，證實了蟲草素誘導 JAR 細胞自噬激活、抑制細胞生長[37]。盡管一些詳細的機制已經得到闡述，但仍然需要進行相關體外和體內的研究揭示蟲草素激活自噬對腫瘤治療的作用。

1.3 誘導腫瘤細胞周期阻滯

細胞周期由細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKIs）共同調節(jié)。調節(jié)細胞周期的復雜機制已在酵母和哺乳動物細胞中得到廣泛研究，并已鑒定出 20 多個 CDK。其中，CDK1、2、4 和 6 在細胞周期進展中起主要作用，這一過程在癌細胞中受到高度干擾[38]。目前，針對細胞周期的靶向治療是一項具有潛力的腫瘤治療策略。

蟲草素誘導腫瘤細胞周期阻滯，然而蟲草素對于不同腫瘤細胞的細胞周期阻滯作用不同[39-47]。在一些研究中，蟲草素使腫瘤細胞阻滯在 S 期。在白血病細胞和胰腺癌細胞中，蟲草素可以下調 CDK2 的表達，同時顯著降低周期蛋白 E 和周期蛋白 A2 的水平，由于 CDK2 是 G1/S 期過渡和 S 期的進展過程中必需的激酶，因此腫瘤細胞阻滯在S 期[25,43]。Wang 等[48]發(fā)現(xiàn)蟲草素對膽管癌細胞 NOZ 和GBD-SD 進行治療后切割 caspase-3、切割 caspase-9、切割PARP 和 Bax 表達顯著上調，而 Bcl-2、cyclin A 和 CDK2表達顯著降低；蟲草素治療降低了 G0/G1 期細胞的數量，而 S 期細胞比例明顯升高，表明蟲草素以劑量依賴性的方式將膽管癌細胞阻滯在 S 期。

而在其他一些研究中，蟲草素使腫瘤細胞阻滯在 G2/M期。在人膀胱癌細胞和人結腸癌細胞中，蟲草素通過上調P21WAF1 基因，抑制細胞周期蛋白 B1/CDC2 表達，使腫瘤細胞阻滯于 G2/M 期[29,49]。在HeLa 細胞中，蟲草素通過檢查點激酶 1（checkpoint kinase 1，CHK1）/周期蛋白B1-CDC2 復合途徑促進 G2/M 期阻滯[50]。蟲草素在食管癌細胞中顯著抑制 p-ERK 的表達，使得 MAPK 通路失活導致 cyclinB 和CDK1 水平升高，從而導致 G2/M 期阻滯[51]。

2 蟲草素抑制腫瘤細胞侵襲和轉移

腫瘤轉移是腫瘤細胞從原發(fā)部位分散并逐漸在遠處器官定植的過程。在超過 90% 的病例中，腫瘤細胞的轉移擴散是腫瘤病人死亡的最大原因[52]。而上皮間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤轉移中起著至關重要的作用。已知包括 TWIST1、SLUG、SNAIL1和 ZEB1 在內的一組轉錄因子（transcription factors，TF）參與調節(jié) EMT[53-54]。在三陰性乳腺癌中，一項研究發(fā)現(xiàn)TWIST1、SLUG、SNAIL1 和 ZEB1 在小鼠乳腺癌細胞4T1 中很容易檢測到，并且經過蟲草素治療后它們在轉錄水平顯著下調，因此該研究提出蟲草素通過調節(jié) SLUG、TWIST1、SNAIL1 和 ZEB1 轉錄因子的表達，抑制三陰性乳腺癌細胞遷移和侵襲[55]。

一項研究表明[56]，蟲草素在侵襲實驗和傷口愈合實驗中顯著抑制人類膠質母細胞瘤細胞系 U87MG 和 LN229的遷移，同時可以降低整合素 α1、黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）、磷酸化 FAK 蛋白表達，推測蟲草素通過影響溶酶體的降解和蛋白磷酸酶的激活抑制人膠質母細胞瘤細胞的侵襲和轉移。先前的研究表明，CXC 趨化因子受體 4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）在肝癌組織中高表達，并且肝癌細胞優(yōu)先轉移到具有大量表達CXCR4 配體基質細胞衍生因子 1（stromal cell-derived factor 1，SDF1）的器官和組織[57]。在 Guo 等[58]的研究中，蟲草素通過下調 NF-κB 抑制劑 α（NF-κB inhibitor α，IκBα）的磷酸化來抑制 p65 的活化和核轉位，從而下調 CXCR4，抑制肝癌細胞的體外遷移和侵襲。

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）作為一種結構和功能相關的內源性蛋白酶家族，參與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的降解。研究表明，MMPs參與腫瘤發(fā)生、侵襲和轉移；抑制 MMPs 可能在預防腫瘤和阻斷腫瘤轉移方面具有價值[59]。在人肺癌細胞[60]和人口腔鱗癌[61]中，觀察到蟲草素使 MMP-9 活性降低并對腫瘤細胞侵襲產生抑制。Jeong 等[62]的研究表明蟲草素通過下調細胞緊密連接（tight junctions，TJs）和 MMPs 的活性來抑制人前列腺癌細胞 LNCaP 的侵襲和轉移，并且這可能與抑制 AKT 活化有關，同時經過蟲草素治療后組織金屬蛋白酶抑制劑 1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 1，TIMP-1）和 TIMP-2 的表達水平增加，從而調控腫瘤轉移。由于蟲草素具有抑制腫瘤細胞侵襲和轉移的功能，使其在腫瘤治療中更有潛力。

3 蟲草素在腫瘤治療中的應用前景

目前，多項研究將蟲草素與多種治療策略聯(lián)合，以期改善對腫瘤的治療效果。腫瘤細胞對化療藥物產生的耐藥性是有效化療的主要障礙，腫瘤細胞的耐藥性是由多種機制引起的，包括藥物流入減少、藥物流出增加和 DNA 修復機制的激活[63]。多藥耐藥蛋白 1（multidrug resistance protein 1，MDR1）是一種跨膜活性轉運蛋白，不僅在識別化療藥物方面發(fā)揮重要作用，而且還會將藥物泵出，對細胞內部進行解毒。靶向 MDR1 等活性藥物轉運蛋白可以使腫瘤細胞對化療藥物再敏化[64]。有團隊探究了蟲草素誘導的人膀胱癌T24R2 細胞中對化療藥物順鉑的再敏化機制：MDR1 啟動子活性依賴于轉錄因子 Ets-1，蟲草素可能通過對 PI3K 信號的影響，降低 Ets-1 水平從而減少 MDR1 轉錄，顯著降低 MDR1 的表達，誘導膀胱癌細胞對順鉑重新敏感[65]。在食管癌、骨肉瘤、非小細胞肺癌的多項研究中[66-68]，證明了蟲草素和順鉑對腫瘤細胞的協(xié)同治療作用主要是通過上調腫瘤細胞中的 AMPK 信號和下調 AKT 信號來實現(xiàn)的，并且提出了蟲草素與順鉑聯(lián)合應用可能成為提高順鉑耐藥腫瘤患者治療效果的新療法。在一項表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變型非小細胞肺癌的研究中，發(fā)現(xiàn) EGFR 突變型的腫瘤細胞對蟲草素更敏感，并且證明蟲草素通過激活 AMPK 及下游通路，在體內外促進非小細胞肺癌細胞的凋亡，提出蟲草素單藥或與目前可用的靶向療法結合可能是 EGFR 突變型肺癌的額外選擇治療方法[19]。

此外，多項研究證實了蟲草素與放療聯(lián)用的可能性。蟲草素可通過延長 G2/M 期阻滯和延長雙鏈DNA 斷裂時間來增強口腔癌細胞的放射敏感性[69-70]，潛在的分子機制可能與 DNA 損傷修復相關的蛋白表達下調有關，包括磷酸化的共濟失調毛細血管擴張突變（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）和磷酸化的 CHK2。有研究證明蟲草素通過激活外源性和內源性 caspase 途徑、細胞周期停滯和內質網應激來增強 MA-10 小鼠睪丸間質瘤細胞凋亡的放射敏感性，并且提出使用蟲草素聯(lián)合放療治療睪丸癌，可以通過減少治療劑量達到相同的治療效果，避免長期毒性，減少對睪丸功能的影響[39]。

由于蟲草素進入體內后，會被廣泛存在于組織中的腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）快速水解，因此被輸送到腫瘤部位的藥物極少。對蟲草素的結構進行修飾，選擇高活性、高穩(wěn)定性和高生物利用度的新化合物對提高蟲草素的療效具有重要意義。在一項研究中成功地開發(fā)了三種形式（CS、CMP 和 CMA）的蟲草素負載木薯淀粉納米顆粒（cordycepin-loaded cassava starch nanoparticles，CCSNPs），有助于防止蟲草素在小腸吸收前喪失功能，并且這些納米顆粒可以通過刺激活性氧產生和減少蛋白分泌來抑制口腔癌細胞的生長，還可以阻止某些與腫瘤相關的細胞酶被破壞[71]。最新一項研究使用 ProTide 技術，開發(fā)了一種基于蟲草素的新型抗癌藥物，這種藥物在腫瘤細胞內產生高水平的活性代謝物，其效力是蟲草素的 40 倍[72]。此外，在該藥的 I 期臨床試驗（NCT03829254）中，目前還沒有觀察到核苷類似物常見的副作用（包括貧血、白細胞減少和血小板減少），并且該藥展現(xiàn)了很好的抗腫瘤效果，該研究團隊將開展 II 期臨床試驗。這表明通過將 ProTide 技術應用于蟲草素，其生物利用度得到增強，保留了固有的作用，且毒副作用小，但是其具體機制仍需進一步研究[72]。

4 問題與展望

蟲草素作為一種腺苷類似物，具有多種藥理活性。在抗腫瘤治療中，蟲草素誘導腫瘤細胞凋亡、自噬，同時又阻滯腫瘤細胞周期，并且抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。蟲草素的抗腫瘤效果是多方面多路徑協(xié)同作用的，但是目前由蟲草素誘導的各個信號通路之間的交互作用尚未完全闡明，有待深入研究。

蟲草素有望成為一種有前景的抗腫瘤聯(lián)合治療藥物，目前的研究熱點主要集中于將蟲草素與化療藥物聯(lián)合使用或與放療聯(lián)合。然而，發(fā)現(xiàn)蟲草素在腫瘤治療中存在的其他未知分子機制并了解其治療潛力將對聯(lián)合療法的施行非常重要。同時，探索利用納米生物技術介導蟲草素的靶向給藥以及如何提高蟲草素的生物利用度也同樣重要。目前仍然需要進一步的實驗和臨床研究來確定蟲草素在單獨和聯(lián)合使用過程中的療效和安全性。