靶向顆粒酶B分子影像探針的作用機制及應用研究進展

付加煜，朱詩宇，奚鴻杰，華迪，邱玲，林建國

1 南京醫(yī)科大學藥學院，南京 211166；2 江蘇省原子醫(yī)學研究所 國家衛(wèi)生健康委員會核醫(yī)學重點實驗室 江蘇省分子核醫(yī)學重點實驗室

免疫治療是惡性腫瘤治療的重要手段。使用抗體阻斷免疫檢查點的免疫治療已被證實在晚期惡性腫瘤中有效，被批準用于多種惡性腫瘤的治療［1-5］。然而目前僅有少部分腫瘤患者可以從免疫治療中受益，不當治療還可誘發(fā)免疫相關不良反應（如肝炎、結腸炎等），甚至會引起患者死亡。因此，在免疫治療早期評估患者的治療反應，不僅可以最大限度地發(fā)揮免疫治療的作用，還能為治療不響應的患者及時尋找替代策略［6-9］。免疫治療的療效可以通過檢測體內免疫相關生物標志物來進行評估［10-11］。顆粒酶B 是一種由細胞毒性T 細胞（CTLs）的細胞質顆粒釋放的絲氨酸蛋白酶，在靶細胞中可誘導程序性死亡或凋亡［12-14］。當CTLs 識別目標細胞時，顆粒酶B被釋放，進入目標細胞的細胞質后，觸發(fā)Caspase 級聯(lián)反應，并通過直接和間接的層壓處理及激活、線粒體滲透等方式，最終導致腫瘤細胞死亡［15-17］。因此，顆粒酶B 不僅反映CTLs 在腫瘤區(qū)域的定位和表達水平，還直接反映CTLs 對腫瘤細胞的潛在殺傷能力，是一種可靠的免疫相關生物標志物［18］。準確檢測體內顆粒酶B表達水平是免疫治療療效評估的關鍵。影像學技術能無創(chuàng)、實時、定量地進行全身動態(tài)成像［19-22］。靶向分子影像探針能夠準確檢測免疫治療前后體內顆粒酶B的表達水平。目前關于顆粒酶B的分子探針主要分為近紅外熒光（NIRF）探針和正電子發(fā)射斷層掃描（PET）探針兩類。NIRF 成像操作簡便，受背景的自發(fā)熒光影響較小，可提供較為準確的顯像結果，但是其組織穿透能力較弱［23］。PET顯像具有組織穿透力強、靈敏度高、分辨率高等優(yōu)點，與電子計算機斷層掃描（CT）和核磁共振成像（MRI）聯(lián)合成像時可提供更為準確的顯像結果，不過PET 需要借助放射性核素標記分子探針，便捷性較差［24-26］?，F(xiàn)就靶向顆粒酶B 的分子影像探針的作用機制及應用研究進展綜述如下。

1 靶向顆粒酶B的NIRF探針的作用機制及應用

根據作用機制，靶向顆粒酶B 的NIRF 探針主要分為可激活類和自組裝類?？杉せ铑怤IRF 探針是將熒光基團與靶向肽序列相連接，在探針結構末端引入熒光淬滅基團，或在靶向肽兩端連接一對熒光共振對基團，使得探針起初處于熒光信號關閉的狀態(tài)，隨后在體內被顆粒酶B識別剪切靶向肽后，熒光信號開啟。自組裝類NIRF 探針是將靶向肽序列與熒光基團連接，通過點擊縮合反應后自組裝形成納米顆粒淬滅熒光，酶剪切后解組裝開啟熒光，或在體內經酶切后自組裝聚集增強熒光進行顯像。

1.1 可激活類NIRF 探針CyGbPF和CyGbPP有學者通過在顆粒酶B 特異識別的多肽序列IEFD 和IEPD 上連接花菁染料（CyOH），構建了NIRF 探針CyGbPF和CyGbPP［27-30］。該類探針的作用機制是Cy-OH 在連接上IEFD 或IEPD 及對氨基苯甲醇（PABA）后，其氧原子供電子能力減弱，分子探針最初處于熒光淬滅狀態(tài)，將底物序列剪切后，自毀基團PABA 離去使得淬滅的熒光重新被開啟。CyGbPF和CyGbPP被注射進入體內后可被動靶向腫瘤，被腫瘤微環(huán)境中的顆粒酶B識別剪切，導致NIRF信號增強。

體外實驗證實，兩個熒光探針均具有較好的生物安全性和靶向特異性。研究者分別用NLG919、R848、BMS-1、Pexidartinib 和BEC五種免疫治療藥物對乳腺癌（4T1）小鼠進行治療，在治療過程中注射CyGbPF和CyGbPP進行顯像以監(jiān)測療效，結果顯示，免疫治療后，腫瘤部位熒光信號明顯增強，而其余組織部位熒光信號較弱。體外免疫熒光染色和流式細胞術分析也證實，探針在體內成像中的熒光信號強度也與其他免疫相關生物標志物如CD8+、CD4+受體存在相關性。此外，CyGbPF和CyGbPP還具有高腎臟清除效率，使得無創(chuàng)的光學尿液分析較免疫熒光染色更方便。CyGbPF和CyGbPP作為第一種能夠實時成像和進行活體動物體內顆粒酶B 尿液分析的NIRF探針，在推進熒光成像在免疫治療中的應用具有深遠意義。

1.2 可激活類NIRF 探針GNR NGUYEN 等［31］在IEPD 兩端連接一對熒光共振對，隨后與納米聚合主鏈PIMA 相連使其形成納米聚集物，最終獲得探針GNR。在顆粒酶B 存在的條件下，GNR 結構上的IEPD 會被剪切，造成分子結構斷裂，從而使供體基團的熒光重新被開啟，并通過熒光信號強度來反映顆粒酶B表達水平。由于實體瘤的高通透性和滯留效應，GNR 進入體內后會聚集在腫瘤部位，而在其他組織中則會被快速清除。該研究還在GNR 的結構上偶聯(lián)PD-L1抗體，納米顆粒聚集在腫瘤部位后，將阻斷PD-L1/PD-1通路，可以同時實現(xiàn)對腫瘤的免疫治療和療效監(jiān)測。

GNR在體內外均具有良好的顆粒酶B靶向特異性和生物相容性。有學者對荷瘤小鼠進行免疫治療，發(fā)現(xiàn)對治療響應的小鼠結直腸癌（MC-38）組織有明顯的熒光信號開啟和增強，而在對治療不響應的小鼠黑色素瘤（B16/F10）組織中則沒有檢測到熒光信號，說明該探針能夠有效區(qū)分治療響應者和非響應者。此外，離體組織分析結果表明，探針在體內成像的熒光信號強度與顆粒酶B 表達水平高度一致。與腫瘤體積及形態(tài)監(jiān)測相比，GNR 的影像結果可以提供更早、更全面的腫瘤整體免疫反應信息。該納米探針也可在未來臨床試驗中偶聯(lián)其他免疫藥物，在進行免疫治療的同時監(jiān)測療效。

1.3 自組裝類NIRF 探針G-SNAT-Cy5 XIE 等［32］在一個多功能骨架TESLA上連接IEFD，設計了分子探針G-SNAT-Cy5，通過分子內點擊縮合自組裝策略來增強熒光信號進行成像。在被顆粒酶B識別剪切后，TESLA 骨架上的半胱氨酸基團與芳香腈發(fā)生點擊縮合，形成分子內環(huán)化產物。由于疏水性和π-π相互作用，環(huán)化產物形成聚集體，從而延長探針在靶點部位的保留時間，以達到增強顯像效果的目的。

有學者對結直腸癌（CT-26）小鼠進行抗PD-1 和抗CTLA4 聯(lián)合治療，采用G-SNAT-Cy5 監(jiān)測療效，結果顯示，聯(lián)合療法引發(fā)了異質性反應，治療小鼠出現(xiàn)了響應和非響應者。響應者僅在治療的最初腫瘤體積有所增加，隨后持續(xù)縮小，而未經治療的小鼠和經治療無響應的小鼠腫瘤則保持持續(xù)增長。該研究中，三組小鼠體內的CTLs 均被激活，但只有治療響應小鼠的腫瘤中有明顯的CTLs 浸潤和顆粒酶B 活性。在無響應和未治療組中，只在腫瘤最外側一圈有明顯的熒光信號，可能代表腫瘤微環(huán)境在逐漸排斥免疫細胞；而在對治療響應的小鼠腫瘤中則沒有觀察到該現(xiàn)象。與另外兩個自組裝熒光探針Dluciferin 和GBLI2 相比，G-SNAT-Cy5 雖然在總體上顯示出了相似的分布，但其在腫瘤內熒光信號更強且對比度得到改善，這表明該探針在監(jiān)測惡性腫瘤免疫治療療效及協(xié)調免疫治療方面具有一定價值。

1.4 自組裝類NIRF 探針Cy5.5-CBT-NPs XU等［33］設計合成的Cy5.5-CBT-NPs同樣是基于半胱氨酸和氰基點擊縮合自組裝策略。與G-SNAT-Cy5 不同的是，該研究首先合成了一個小分子熒光探針Cy5.5-CBT，裸露出其結構上的1，2-氨基硫醇基團，與另一個Cy5.5-CBT 的CBT 部分點擊縮合，形成環(huán)狀二聚體產物Cy5.5-2CBT，隨后通過分子間疏水相互作用和π-π 堆積形成納米探針Cy5.5-CBT-NPs。納米顆粒的熒光最初由于聚集作用是淬滅的，被顆粒酶B 識別剪切后會導致二聚體產物的斷裂，造成納米顆粒解組裝，使熒光信號重新開啟。

體外研究中，有學者通過透射電鏡圖像、熒光光譜、熒光壽命譜和HPLC 分析，證實了Cy5.5-CBTNPs 的還原誘導自組裝和顆粒酶B 引發(fā)的解組裝，并伴有熒光淬滅和開啟。細胞成像結果表明，使用CD8+T 淋巴細胞對B16-OVA 腫瘤細胞進行治療后，Cy5.5-CBT-NPs 能夠實時、靈敏地檢測CD8+T 淋巴細胞的反應。體內顯像結果表明，Cy5.5-CBT-NPs能夠對免疫治療響應的腫瘤進行顯示。體外免疫熒光染色進一步證實，開啟的NIFR 熒光與CTLs 的腫瘤內浸潤和顆粒酶B表達水平有相關性。由于顆粒酶B 的活性與CTLs 對腫瘤細胞的殺傷強度直接相關，因此，Cy5.5-CBT-NPs 可直接用來監(jiān)測免疫治療期間腫瘤微環(huán)境中CTLs的活性。

2 靶向顆粒酶B的PET探針的作用機制及應用

靶向顆粒酶B 的PET 探針設計思路是在靶向肽上連接標記基團以引入放射性核素，主要分為兩類，分別是酶結合類PET探針和酶剪切類PET探針。酶結合類探針作用機制為：探針進入體內被酶識別后，結構上的靶向肽與顆粒酶B 結合，從而使放射性信號保留在該部位進行PET顯像。酶剪切類探針作用機制為：探針在被顆粒酶B識別后，靶向肽序列會被其剪切，造成其結構斷裂，隨后通過與細胞膜結合或自組裝等方式保留在靶部位進行成像。

2.1 酶 結 合類PET 探 針68Ga-NOTA-GZP 和［18F］AlF-mNOTA-GZP 研究者在IEFD 后連接小型靈活接頭Gly-Gly-Gly，隨后連接金屬螯合劑1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-1，4，7-三乙酸，以此合成NOTA-GZP。NOTA-GZP通過68Ga和18F標記引入放射性核素獲得探 針68Ga-NOTA-GZP 和［18F］AlF-mNOTA-GZP［34-37］。68Ga 半衰期為68 min，18F 半衰期為109 min，二者均與短肽的快速藥代動力學相匹配。體外酶抑制實驗驗證了NOTA-GZP 對顆粒酶B 具有高親和力和高特異性，68Ga-NOTA-GZP 和［18F］AlF-mNOTA-GZP 均具有較高的放射性化學產率和放射化學純度。在抗PD-1 單一療法、抗PD-1 與抗CLTA-4 聯(lián)合治療的CT-26 荷瘤小鼠體內PET 顯像研究中，68Ga-NOTAGZP 在兩組小鼠腫瘤部位均有較高的攝取，且在聯(lián)合免疫治療組中攝取最高，而在未接受治療組的腫瘤部位沒有明顯攝取。68Ga-NOTA-GZP 在腎臟和膀胱中的同樣也存在高攝取，可能是由于其主要通過腎臟代謝。

有學者對結直腸癌CT-26、MC-38小鼠進行化療聯(lián)合免疫治療后，注射［18F］AlF-mNOTA-GZP進行顯像，PET-CT/MRI 圖像的腫瘤定量分析顯示，不同治療組小鼠探針的攝取有明顯差異，根據成像結果能夠區(qū)分治療應答者與無應答者。研究者在未治療組、無應答者及未抑制腫瘤生長的治療組中觀察到［18F］AlF-mNOTA-GZP低攝取，而在成功抑制腫瘤生長的治療組中觀察到更高的攝取。此外，與CT-26小鼠腫瘤相比，在MC-38 小鼠腫瘤中觀察到更高的［18F］AlF-mNOTA-GZP攝取，且未治療組和無應答者的背景攝取量也更高。

上述研究結果表明，68Ga-NOTA-GZP 和［18F］AlF-mNOTA-GZP 均有很好的靶向顆粒酶B 的能力，可有效預測免疫治療的療效。然而，上述兩種探針在腫瘤中的攝取較低，同時可能受腫瘤表型異常的影響，需要進一步闡明相關原因。

2.2 酶結合類PET 探針68Ga-grazytracer ZHOU等［38］根據IEPD設計并合成了PET探針68Ga-grazytracer，與NOTA-GZP 不同的是，68Ga-grazytracer 結構上含有一個有助于提高體內穩(wěn)定性的剛性三環(huán)肽模擬支架和可以抑制與其他蛋白酶反應的非醛藥效團。荷瘤小鼠模型研究結果顯示，與68Ga-NOTA-GZP 相比，68Ga-grazytracer在荷瘤小鼠中顯示出顯著的腫瘤攝取并增強了成像對比度。這可能是由于剛性三環(huán)肽模擬支架和1，2，3-三唑藥效團更耐水解和酶裂解，提高了68Ga-grazytracer在體內的代謝穩(wěn)定性。學者們還進行了初步臨床研究，在5 例腫瘤患者中，68Ga-Grazytracter的PET顯像能夠較好地監(jiān)測免疫治療效果。然而，由于招募患者數(shù)量有限，后續(xù)還需要進行更多的臨床研究以提供更為全面和可靠的數(shù)據。

68Ga-grazytracer 在監(jiān)測多種免疫療法在不同腫瘤中的療效方面有一定優(yōu)勢，在評價腫瘤對免疫治療的響應方面效果優(yōu)于18F-FDG。初步臨床研究證實了68Ga-grazytracer PET 顯像在腫瘤免疫治療療效監(jiān)測中的應用價值，為未來進行更大規(guī)模的臨床研究提供了基礎。

2.3 酶剪切類PET 探針64Cu-GRIP B ZHAO 等［21］根據一種名為相互作用肽（RIP）的長鏈肽設計了一個靶向顆粒酶B 的PET 探針64Cu-GRIP B。GRIP B的具體結構是在IEPD 上連接一個與放射性同位素偶聯(lián)的無毒抗菌肽（AMP），以及一段阻止AMP 轉變?yōu)槁菪龢嬒蟮碾逆?，這使得其能夠保持直鏈。在被細胞外的顆粒酶B 剪切后，放射性標記的AMP 被釋放，發(fā)生構象變化形成螺旋結構，并沉積在附近的細胞膜內，緊密結合到磷脂雙分子層上。與上述兩類短肽探針有所不同，GRIP B 使用放射性核素64Cu 進行標記以獲得64Cu-GRIP B，64Cu 的半衰期為12.7 h，這與長鏈肽的藥代動力學較為匹配。并且，該探針可在胞外被識別并剪切后結合在細胞膜上，不會進入細胞內。

64Cu-GRIP B 具有較高的放射性標記產率和純度，與重組人顆粒酶B 孵育30 min 后會完全轉變?yōu)榧羟挟a物，同時在小鼠血清中也有較高的穩(wěn)定性。探針在小鼠體內的血漿清除半衰期約為8 min，主要通過腎臟代謝。學者們對CT26 小鼠進行抗PD1 和抗CTLA4 聯(lián)合治療，治療后注射64Cu-GRIP B，靜態(tài)圖像的感興趣區(qū)分析顯示，治療組64Cu-GRIP B 的腫瘤攝取在注射后2 h已明顯高于未治療組，且24 h后依舊有明顯的放射性積聚。通過動態(tài)PET采集圖像得到的時間—活性曲線顯示，治療組小鼠腫瘤中64Cu-GRIP B 積累迅速，注射后10 min 內達到5% ID/g。然而，未治療組小鼠腫瘤中的放射性示蹤劑攝取量明顯較低，且不會隨時間變化。注射后2 h的生物分布研究結果顯示，治療組小鼠脾臟攝取也顯著增加，這與全身免疫對T 細胞的刺激有關。放射自顯影和免疫熒光結果顯示，組織中探針的結合區(qū)域與顆粒酶B 和T 細胞標志物CD3 的表達一致。此外，由于該探針在淋巴組織中也可以顯示免疫細胞激活，研究者還將該探針應用到了肺部炎癥模型的相關研究中。以上結果表明，64Cu-GRIP B 可以通過PET 成像對體內顆粒酶B 的活性進行評估，有望在未來應用于臨床試驗。

總之，顆粒酶B 檢測為惡性腫瘤免疫治療早期療效評估提供了可靠的依據，利用分子影像學技術可實現(xiàn)實時、無創(chuàng)監(jiān)測，有助于及時調整治療方案。上述靶向顆粒酶B 的NIRF 探針和PET 探針均具有較好的靶向特異性，而PET 探針由于成像方式的優(yōu)勢，其組織穿透力強，成像結果更為準確，更適用于臨床轉化。但是這些分子探針也存在一定不足，如在靶部位的攝取較低、體內不穩(wěn)定、易受體內其他環(huán)境干擾等，對檢測結果的準確性有一定影響?？偟膩碚f，這些相關研究為免疫治療療效評估提供了寶貴經驗。未來還會有更多靶向顆粒酶B的分子探針出現(xiàn)，為腫瘤免疫治療療效的精準評估提供思路。