核酸質(zhì)譜儀檢測單核苷酸多態(tài)性的臨床應(yīng)用

張陽東，宋秀軍，高 崢，牛冬梅，呂 進(jìn)，楚瑞雪

（1.火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心研究部，北京 100088；2.火箭軍96606 部隊(duì)醫(yī)院，河南洛陽 471003；3.解放軍總醫(yī)院京中醫(yī)療區(qū)禮士路門診部，北京 100820）

0 引言

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指在基因組水平上由單個核苷酸變異引起的高密度、高保守的DNA 序列多態(tài)性，是導(dǎo)致人群個體間遺傳差異的主要原因。特定基因SNP 的檢測分析在疾病的診斷特別是出生缺陷疾病的防控、藥物種類和劑量的指導(dǎo)等方面有著非常重要的作用。SNP的常見檢測方法包括直接測序法、基因芯片法、PCR-限制性片段長度多態(tài)性法、熒光標(biāo)記的單堿基延伸法和核酸質(zhì)譜法等。其中核酸質(zhì)譜法是基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)，根據(jù)解吸的核酸分子的質(zhì)量和在真空腔中的飛行時間差異，通過計(jì)算分子量進(jìn)而獲得分析物的基因型信息。在pmol 水平可鑒別僅1 個堿基差別的不同DNA 片段是核酸質(zhì)譜儀進(jìn)行SNP 分型的基礎(chǔ)。核酸質(zhì)譜技術(shù)具有高靈敏度、高通量和高精確度等優(yōu)勢，是國際業(yè)界公認(rèn)的SNP 分型的黃金標(biāo)準(zhǔn)[1]。為了闡述核酸質(zhì)譜儀的SNP 基因分型技術(shù)在疾病的分子診斷和機(jī)制研究中的優(yōu)勢，使該技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中逐漸普及，本文對核酸質(zhì)譜儀的構(gòu)造、技術(shù)原理和檢測程序進(jìn)行介紹，并對核酸質(zhì)譜儀檢測SNP 在出生缺陷疾病篩查診斷和個性化醫(yī)療等領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行闡述。

1 核酸質(zhì)譜儀的組成、工作原理和檢測流程

1.1 核酸質(zhì)譜儀的組成

核酸質(zhì)譜儀主要由進(jìn)樣系統(tǒng)、基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）、飛行時間質(zhì)量分析器（time of flight mass analyzer，TOF）、檢測接收器和配套分析軟件5個部分組成。設(shè)備進(jìn)樣系統(tǒng)提供標(biāo)準(zhǔn)的96 和384 制式芯片，可滿足不同檢測量的需求。一張芯片可同時分析多個檢測項(xiàng)目并可分多次使用，方便檢測內(nèi)容的靈活定制或修改，減少拼湊樣本的限制，大大提高了檢測效率。該設(shè)備的全封閉設(shè)計(jì)可避免人為操作誤差及潛在的交叉污染風(fēng)險。

1.2 核酸質(zhì)譜儀的工作原理

MALDI 應(yīng)用激光照射核酸分子與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)吸收激光能量并傳遞給核酸分子，從而使基質(zhì)和核酸分子間發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生完整的電離化核酸分子。TOF 使離子化的核酸分子在電場作用下加速飛過真空管腔，根據(jù)樣品分子的電荷及分子量不同以及到達(dá)檢測接收器的時間差異，智能分析SNP 的基因型。

1.3 核酸質(zhì)譜儀檢測SNP 的流程

1.3.1 樣品的準(zhǔn)備

準(zhǔn)備核酸質(zhì)譜儀可直接檢測的稀有樣本和降解樣品，以及可兼容全血、唾液、口腔黏膜、干血斑、活檢組織、石蠟包埋組織、血漿等各類樣本。

1.3.2 擴(kuò)增和延伸反應(yīng)的引物設(shè)計(jì)

由于核酸質(zhì)譜儀的SNP 分型是一種在PCR 基礎(chǔ)上進(jìn)行單堿基延伸的技術(shù)，因此相關(guān)的引物設(shè)計(jì)必須遵循PCR 引物設(shè)計(jì)原則。引物應(yīng)盡量避免自身形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)及5 個以上嘌呤或嘧啶核苷酸的連續(xù)序列。由于同一體系可進(jìn)行多達(dá)幾十重反應(yīng)，引物間需避免互補(bǔ)，防止出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增延伸而干擾檢測結(jié)果。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增、純化及單堿基延伸反應(yīng)

在核酸擴(kuò)增階段，通過多重PCR 擴(kuò)增多達(dá)含40個待檢SNP 的目標(biāo)片段。PCR 結(jié)束后加入蝦堿性磷酸酶進(jìn)行純化，去除反應(yīng)液中的脫氧核苷酸。隨后在反應(yīng)液中加入針對SNP 位點(diǎn)的特異性單堿基延伸引物及經(jīng)修飾的雙脫氧核苷酸進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，使等位基因的延伸產(chǎn)物僅表現(xiàn)為末端一個堿基的差異。

1.3.4 核酸質(zhì)譜儀的分型檢測

將完成延伸的反應(yīng)液與樹脂混合進(jìn)行離子交換，去除吸附于DNA 片段上的離子，再經(jīng)脫鹽后將反應(yīng)液點(diǎn)在靶板基質(zhì)上形成共結(jié)晶?；|(zhì)可增強(qiáng)核酸分子對激光的吸收，保護(hù)核酸分子的穩(wěn)定性。核酸質(zhì)譜儀根據(jù)不同質(zhì)量的單堿基的飛行時間差異自動分析確定對應(yīng)的堿基類型。整個檢測流程和數(shù)據(jù)分析簡單，檢測周期短。另外，由于核酸質(zhì)譜技術(shù)采用物理方法學(xué)，檢測過程只需簡單的PCR 及延伸試劑，無需熒光探針和熒光類試劑，因此試劑成本低。

2 核酸質(zhì)譜儀在出生缺陷防控中的臨床應(yīng)用

出生缺陷是指由遺傳等因素導(dǎo)致的嬰兒出生前發(fā)生的身體結(jié)構(gòu)、功能或代謝異常。出生缺陷嚴(yán)重影響兒童的健康和出生人口素質(zhì)，因此對遺傳缺陷疾病開展篩查工作具有重要意義。我國已通過孕前、孕期及出生后的篩查建立了出生缺陷三級預(yù)防體系，做到早診斷、早干預(yù)、多層面預(yù)防出生缺陷的發(fā)生[2]。通過對母體循環(huán)中胎兒DNA 的SNP 進(jìn)行分型，即可獲得胎兒的遺傳信息，除了可測定胎兒染色體畸變、循環(huán)核酸[3]及DNA 半合子22q11.2 缺失外[4]，核酸質(zhì)譜儀更多應(yīng)用于需進(jìn)行多基因多位點(diǎn)檢測的遺傳性耳聾、地中海貧血和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥等疾病的產(chǎn)前無創(chuàng)診斷[3]。

2.1 核酸質(zhì)譜儀在遺傳性耳聾篩查診斷中的臨床應(yīng)用

耳聾是最常見的遺傳性疾病之一。我國每年出生的約90 萬例遺傳缺陷的新生兒中約三分之一為聽力障礙[5]。國內(nèi)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示[6-7]，我國的遺傳性耳聾大多數(shù)為單基因遺傳病，主要與GJB2、GJB3、12SrRNA 及SLC26A4 基因有關(guān)。其中GJB2 基因突變是通過影響縫隙連接蛋白的合成而導(dǎo)致內(nèi)耳鉀離子循環(huán)和轉(zhuǎn)運(yùn)異常使聽力損失。GJB3 基因突變可影響縫隙連接蛋白的合成導(dǎo)致高頻聽力下降。12SrRNA 基因是一個與氨基糖甙類抗生素致聾相關(guān)的基因。氨基糖苷類抗生素進(jìn)入攜帶有該突變基因的人體后，通過損傷內(nèi)耳毛細(xì)胞導(dǎo)致永久性聽力損失[8]，患者需終身禁用氨基糖苷類抗生素。SLC26A4 基因位點(diǎn)突變主要引起內(nèi)耳淋巴液的流動異常，使內(nèi)耳毛細(xì)胞受損和聽神經(jīng)萎縮而導(dǎo)致聽力下降[9]。由于大部分遺傳性耳聾為常染色體隱性遺傳，隱性耳聾基因攜帶者的聽力正常，因此為聽力正常的育齡夫婦進(jìn)行常見耳聾基因檢測十分必要。

2013 年深圳華大基因科技有限公司的曾云等[10]依據(jù)我國大規(guī)模耳聾分子流行病學(xué)研究結(jié)果，應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀構(gòu)建了GJB2、GJB3、12SrRNA 和SLC26A44個遺傳性耳聾基因共20 個SNP 的分型檢測方法，該檢測方法具有位點(diǎn)多、覆蓋率高、快速、準(zhǔn)確、高通量、低成本等特點(diǎn)，適于大規(guī)模篩查，為先天性耳聾和藥物性耳聾的及早干預(yù)和用藥警示提供了分子生物學(xué)依據(jù)。核酸質(zhì)譜儀的應(yīng)用使得檢測費(fèi)用的大幅度降低也為2014 年我國政府開展新生兒耳聾基因的免費(fèi)篩查提供了經(jīng)濟(jì)支撐，具有重要的社會價值。

2.2 核酸質(zhì)譜儀在遺傳性代謝疾病診斷中的臨床應(yīng)用

地中海貧血是珠蛋白基因突變或缺失導(dǎo)致珠蛋白鏈合成障礙、比例失衡引起紅細(xì)胞損傷、溶血從而導(dǎo)致紅細(xì)胞新陳代謝異常的常染色體隱性遺傳疾病。目前已知β 珠蛋白基因致病的點(diǎn)突變就超過200個[11]。地中海貧血在臨床表現(xiàn)上具有非常顯著的異質(zhì)性，建立快速高通量的珠蛋白常見基因突變位點(diǎn)的檢測方法對溶血性貧血的診斷及防止出現(xiàn)重型地中海貧血患兒顯得尤為重要。應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀對β 珠蛋白基因的10 個常見SNP 位點(diǎn)進(jìn)行檢測，既可克服β地中海貧血診斷實(shí)驗(yàn)中傳統(tǒng)的血紅蛋白A（HbA）定量的靈敏度不高、特異性不強(qiáng)的缺點(diǎn)，也可克服PCR結(jié)合反向點(diǎn)雜交法操作煩瑣、通量低、費(fèi)用昂貴的不足[12]。臨床實(shí)踐證明，應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀對SNP 位點(diǎn)進(jìn)行分型是新生兒β 地中海貧血大樣本篩查和診斷的有效方法。

G6PD 缺乏癥因G6PD 基因突變使紅細(xì)胞磷酸戊糖途徑中還原型輔酶Ⅱ和還原型谷胱甘肽生成減少，導(dǎo)致紅細(xì)胞膜穩(wěn)定性和抵抗氧化損傷能力下降而引起溶血性貧血。該病重在早期診斷預(yù)防，患者應(yīng)避免攝入可能誘發(fā)該病的食物及藥物[13]。在已報道的G6PD 的近200 個基因突變型中，約85%表現(xiàn)為單個堿基的多態(tài)性[14]。我國人群中G6PD 最常見的基因點(diǎn)突變有10 多種，其中以1376G>T、1388G>A和95A>G 突變頻率最高[15]。根據(jù)我國的流行病學(xué)研究，包括專家共識及診治指南等，陶子馨[16]選取了我國人群常見的16 種G6PD 缺乏癥致病突變位點(diǎn)，應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀對SNP 進(jìn)行了基因分型，檢測出的位點(diǎn)情況符合我國的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果與測序檢測一致，且可用于排除G6PD 酶活性檢測的假陽性。

應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀開展遺傳缺陷相關(guān)基因SNP的高通量檢測可彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測方法的局限性，通過基因攜帶者經(jīng)遺傳咨詢可尋找潛在的患者。目前我國通過對地中海貧血[12，17]、G6PD 缺乏癥[18]的多基因多位點(diǎn)SNP 檢測，使嚴(yán)重出生缺陷得到了有效控制。

3 核酸質(zhì)譜儀在個性化醫(yī)療中的臨床應(yīng)用

近年來，臨床用藥已由經(jīng)驗(yàn)用藥和循證用藥階段逐漸發(fā)展為個性化用藥階段。藥物基因組信息是當(dāng)前個性化精準(zhǔn)醫(yī)療的一個重要部分。藥物基因組學(xué)是通過對藥物代謝酶、受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等基因的研究，闡明不同基因型個體的藥物藥效和毒性，確定藥物作用靶點(diǎn)，指導(dǎo)不同基因型個體的臨床用藥。不同個體的藥物遺傳多態(tài)性是藥物基因組學(xué)的基礎(chǔ)。藥物基因組學(xué)的臨床實(shí)施可以規(guī)避有毒副作用的藥物，實(shí)現(xiàn)個性化醫(yī)療，提高治療的功效、安全性和成本效益。藥物經(jīng)血液循環(huán)主要在肝臟代謝，細(xì)胞色素酶P450（CYP450）是人體肝臟中最主要的藥物代謝酶系統(tǒng)，其多態(tài)性與藥物的代謝速率和清除率直接相關(guān)[19]。CYP450 含多個亞族，其中CYP2C9 和CYP2C19是遺傳多態(tài)性中與我國人群藥物代謝最緊密相關(guān)的2 種酶[20]。核酸質(zhì)譜儀的臨床應(yīng)用很好地解決了藥物基因組學(xué)同時檢測多個變異位點(diǎn)的需求[21-23]，特別是在心血管疾病、腫瘤靶向治療、病原體分型及耐藥檢測等精準(zhǔn)用藥的開展中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

3.1 核酸質(zhì)譜儀在心血管疾病精準(zhǔn)用藥中的臨床應(yīng)用

心血管疾病主要包括高血壓、心絞痛、心律失常、心肌梗死等，是死亡率最高的疾病。心血管疾病大多為慢性病，藥物治療一般較為復(fù)雜。研究結(jié)果[24-26]顯示，臨床上治療心血管疾病常規(guī)使用的藥物因體內(nèi)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)及作用靶點(diǎn)相關(guān)基因的遺傳變異和表達(dá)水平變化，通過影響藥物的體內(nèi)濃度和敏感性而導(dǎo)致藥物反應(yīng)個體差異。華法林是預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病最常用的口服抗凝藥，其安全治療窗狹窄，抗凝不適度時易引起出血、栓塞甚至死亡等嚴(yán)重并發(fā)癥。華法林代謝酶基因如肝臟中細(xì)胞色素P450 2C9的SNP 對華法林的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生重要影響。應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀同時對華法林代謝酶的多個SNP 進(jìn)行基因分型對指導(dǎo)華法林初始劑量的選擇、降低抗凝出血的風(fēng)險具有重要的指導(dǎo)意義[27]。

國內(nèi)劉朝暉等[28]應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀對心血管相關(guān)藥物氯吡格雷、華法林、硝酸甘油和他汀類等相關(guān)的11 個基因17 個SNP 進(jìn)行了檢測，同時對該方法的準(zhǔn)確度、特異性、測定下限、精密度和抗干擾水平進(jìn)行了評價。研究結(jié)果顯示，核酸質(zhì)譜儀檢測SNP 性能穩(wěn)定，檢測下限可達(dá)0.4 ng DNA。該設(shè)備對基因組和PCR 各中間產(chǎn)物（擴(kuò)增產(chǎn)物、消化產(chǎn)物和延伸產(chǎn)物）氣溶膠有很強(qiáng)的抗干擾能力，且芯片不同基質(zhì)間無交叉污染，可以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

目前，國內(nèi)核酸質(zhì)譜儀廠家已研制開發(fā)涵蓋20多個心血管相關(guān)藥物基因共數(shù)十個SNP 位點(diǎn)的檢測試劑盒，通過藥物相關(guān)基因多態(tài)性分析指導(dǎo)臨床個體化用藥，大大地提高了心血管藥物使用的安全性、有效性和經(jīng)濟(jì)性。

3.2 核酸質(zhì)譜儀在腫瘤靶向治療中的臨床應(yīng)用

腫瘤是目前嚴(yán)重威脅人類健康的一類疾病。通過SNP 的基因分型，不僅可以對健康、亞健康人群進(jìn)行腫瘤風(fēng)險評估[29-30]，開展腫瘤的早期篩查[31-32]，還可以為腫瘤治療方案的選擇以及預(yù)后預(yù)測提供重要依據(jù)[33]。基于遺傳信息對腫瘤患者進(jìn)行個體化治療已得到臨床的廣泛關(guān)注[34]。肺癌在我國惡性腫瘤的發(fā)病率中居首位，防治任務(wù)艱巨[35]。研究結(jié)果顯示，肺癌的發(fā)病、靶向治療以及轉(zhuǎn)移等都與基因的變異相關(guān)[36]。在非小細(xì)胞肺癌的臨床治療中，常通過對EGFR和ALK 基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測來選擇靶向治療的酪氨酸激酶抑制劑[37-38]。目前針對結(jié)直腸癌的靶向治療藥物主要為抗表皮生長因子受體單抗（西妥昔單抗和帕尼單抗），其療效與KRAS、NRAS 和BRAF 基因型密切相關(guān)。通過對這3 個基因16 個突變位點(diǎn)的檢測，可為結(jié)直腸癌患者的個體化治療選擇合適的靶向治療方案[39]。目前，基于核酸質(zhì)譜技術(shù)已研發(fā)上市針對不同腫瘤的風(fēng)險評估、用藥指導(dǎo)、耐藥監(jiān)控、良惡性鑒別、療效評估的試劑盒。

田紅霞等[40]根據(jù)中國人群肺癌的發(fā)病機(jī)理、放化療、靶向耐藥以及轉(zhuǎn)移等相關(guān)的靶基因或傳導(dǎo)通路基因，應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀構(gòu)建了可同時檢測EGFR、ALK 和KRAS 等13 個肺癌相關(guān)基因共99 個SNP位點(diǎn)的方法。該方法以96 或384 孔板多重反應(yīng)分析為基礎(chǔ)，在12 孔同步檢測13 個基因的99 個SNP位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了“單個小樣本多基因的檢測”，使小樣本最大化使用、獲得最大信息量。通過對肺癌細(xì)胞系和肺癌組織樣本的檢測并與進(jìn)口試劑盒及直接測序法的對比驗(yàn)證，顯示該方法靈敏度高、特異性好，適合中國肺癌人群。由于自主研發(fā)的高通量檢測試劑盒大大降低了患者的臨床檢測費(fèi)用，因此核酸質(zhì)譜儀具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

3.3 核酸質(zhì)譜儀在病原體分型及耐藥檢測中的臨床應(yīng)用

核酸質(zhì)譜儀的另一重要應(yīng)用領(lǐng)域是通過檢測病原體管家基因的SNP 進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型，根據(jù)基因分型結(jié)果對病原體進(jìn)行鑒定并提供病原體的用藥信息。我國是全球結(jié)核第三高發(fā)國家，每年有超過10 萬例的新發(fā)耐多藥患者。結(jié)核桿菌鏡檢陽性率低，培養(yǎng)困難[41]。雖然眾多學(xué)者應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀的篩選結(jié)果顯示中國漢族人群的sp110 基因、MMP9 基因及IL 基因等的多個SNP 與結(jié)核的易感性相關(guān)[42-44]，但核酸質(zhì)譜儀在結(jié)核病個性化治療中的主要應(yīng)用還是通過構(gòu)建對感染的結(jié)核分枝桿菌的rpoB、katG、gyrA 和rrs 等基因的50 余個耐藥相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行檢測，高通量快速完成結(jié)核分枝桿菌的鑒定與利福平、異煙肼、氟喹諾酮類及二線注射類抗結(jié)核藥物的多重耐藥分析，將其作為臨床鑒定結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果的有效補(bǔ)充，為結(jié)核病的診斷和用藥提供準(zhǔn)確信息[45-47]。

乙肝患者經(jīng)長期口服核苷（酸）類抗病毒藥物治療后體內(nèi)的乙肝病毒可發(fā)生基因變異而導(dǎo)致耐藥。開展針對不同核苷（酸）類藥物病毒耐藥檢測對于調(diào)整治療方案、指導(dǎo)遠(yuǎn)期治療具有重要意義。目前，我國核苷（酸）類抗病毒藥物主要有阿德福韋酯、替比夫定、拉米夫定和恩替卡韋4 種，每一種藥物的耐藥菌株的突變位點(diǎn)不同。利用核酸質(zhì)譜儀建立的乙肝病毒耐藥基因突變檢測體系，可同時檢測多達(dá)37 個耐藥突變SNP 位點(diǎn)，其檢測靈敏度和檢出率均高于線性探針分析法和多溫度單鏈構(gòu)象多態(tài)性法，可為乙肝患者個性化臨床治療方案的制訂及調(diào)整提供重要依據(jù)[48-49]。

4 結(jié)語

核酸質(zhì)譜儀在出生缺陷防控和個性化精準(zhǔn)醫(yī)療中發(fā)揮了重要作用?；诟咄俊⒖焖?、準(zhǔn)確的優(yōu)勢，核酸質(zhì)譜儀也被廣泛應(yīng)用于疾病的機(jī)制研究，篩選與糖尿病[50-51]、冠心病[52-53]等常見疾病相關(guān)的危險因素。在病原學(xué)診斷領(lǐng)域，核酸質(zhì)譜儀克服了傳統(tǒng)的病原體分離培養(yǎng)周期長和生化鑒別困難等缺點(diǎn)，為感染性疾病的數(shù)十種病原體的高效鑒別診斷[54-55]提供了新方法。

為了在臨床檢測中普及核酸質(zhì)譜技術(shù)，醫(yī)療管理部門需加大投入和政策支持，指導(dǎo)研發(fā)機(jī)構(gòu)提高設(shè)備的國產(chǎn)化水平，特別是核心部件的國產(chǎn)化，降低實(shí)驗(yàn)室購買設(shè)備的成本；加大多種疾病診斷試劑盒的研發(fā)力度，國內(nèi)通用型核酸質(zhì)譜儀在臨床應(yīng)用的獲批和試劑盒的不斷研發(fā)生產(chǎn)，將使該設(shè)備在精準(zhǔn)醫(yī)療、遺傳疾病篩查、疾病預(yù)后判斷、公共健康等臨床分子診斷領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景，開啟核酸質(zhì)譜儀在臨床應(yīng)用的新紀(jì)元。