褪黑素的生物合成及對(duì)繁殖性能的影響

張 鈺，鄧學(xué)梅，廖晨星，劉國(guó)世*

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)三亞研究院，海南三亞 572025 3 北京首農(nóng)食品集團(tuán)有限公司，北京 100028

0 引言

褪黑素（Melatonin，MLT）又稱(chēng)N-乙酰-5-甲氧基色胺，是一種廣泛分布在微生物及動(dòng)植物體內(nèi)的吲哚類(lèi)激素。褪黑素是由Lerner等人于1958年從松果體組織中分離發(fā)現(xiàn)，在人們最初的認(rèn)知中，動(dòng)物體內(nèi)僅有松果體能夠分泌褪黑素，且功能上僅限于調(diào)節(jié)個(gè)體的晝夜節(jié)律以及季節(jié)信號(hào)。但是在隨后的幾十年間發(fā)表的研究結(jié)果表明，大部分的器官組織都能夠合成褪黑素，例如視網(wǎng)膜、胃腸道、性腺等[1]。而且褪黑素還具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和廣譜抗氧化功能，能夠減少生殖系統(tǒng)及其他組織器官受到的氧化應(yīng)激、炎癥損傷以及細(xì)胞凋亡的發(fā)生[2]，并根據(jù)機(jī)體不同的發(fā)育階段和外界環(huán)境的季節(jié)變化表現(xiàn)出相應(yīng)的促進(jìn)或抑制發(fā)情的功能，調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)活動(dòng)，改善動(dòng)物的繁殖能力。本文綜述了褪黑素在生物機(jī)體內(nèi)合成途徑及分泌調(diào)控機(jī)制、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制以及對(duì)動(dòng)物生殖系統(tǒng)、胚胎發(fā)育和繁殖能力的影響，以期為后續(xù)動(dòng)物輔助生殖技術(shù)的發(fā)展提供新的思路與見(jiàn)解。

1 褪黑素的生物合成及功能

雖然多種組織器官都能夠分泌褪黑素，但只有松果體和眼部的視網(wǎng)膜組織能夠呈現(xiàn)周期性的分泌活動(dòng)，其生物合成受到外界光照條件呈現(xiàn)出晝夜節(jié)律性以及季節(jié)特征。功能上，褪黑素能夠鏈接外界光照信號(hào)變化和機(jī)體內(nèi)多種生理活動(dòng)節(jié)律[3]，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有良好的保護(hù)作用，能夠調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律變化并對(duì)精神疾病具有良好的治療效果[4]。此外褪黑素還具有廣譜抗菌作用[5]以及免疫調(diào)節(jié)功能[6]。

1.1 褪黑素的生物合成

褪黑素最初是從動(dòng)物體內(nèi)的松果體分離并鑒定[7]，但隨著研究的深入，有研究者發(fā)現(xiàn)腸道和卵泡等多種組織器官也能夠合成褪黑素[1]，并作為自分泌和旁分泌信號(hào)調(diào)節(jié)生理活動(dòng)。脊椎動(dòng)物的胃腸道色氨酸作為褪黑素生物合成的前體被小腸吸收進(jìn)入血液循環(huán)，松果體細(xì)胞主動(dòng)攝取，經(jīng)過(guò)色氨酸羥化酶作用形成5-羥基色氨酸，再經(jīng)過(guò)芳基烷基胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（AANAT）轉(zhuǎn)化為N-乙酰血清素，最后在乙酰血清素O-甲基轉(zhuǎn)移酶（ASMT）的作用下成褪黑素[8]。在這個(gè)過(guò)程中，AANAT是主要的限速酶，其生物活性能夠調(diào)控褪黑素的合成速度。AANAT基因中的調(diào)節(jié)/結(jié)合序列能夠編碼cAMP操作的結(jié)合開(kāi)關(guān)，cAMP調(diào)節(jié)的蛋白激酶催化的磷酸化促進(jìn)與14-3-3蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。這種AANAT/14-3-3復(fù)合物的形成通過(guò)屏蔽AANAT的去磷酸化或蛋白水解，并降低血清素的K（m）來(lái)增強(qiáng)褪黑激素的產(chǎn)生[9]。Yalikun S等[10]的研究進(jìn)一步確定褪黑素是在線(xiàn)粒體基質(zhì)中合成的。松果體合成褪黑素后迅速釋放至血液及脊髓液中[11]，與血漿蛋白結(jié)合并分布到大多數(shù)身體組織中[12]發(fā)揮作用。

另一方面，有許多研究指出，部分細(xì)菌和真菌[13]也具有合成褪黑素的能力。Tilden等[14]通過(guò)控制光照條件，發(fā)現(xiàn)一株需氧光合細(xì)菌-長(zhǎng)紅桿菌在光照較弱的條件下能夠合成并分泌褪黑素，但是自然狀態(tài)下的微生物合成褪黑素的效率及濃度較低，不能滿(mǎn)足將其分離提純及應(yīng)用的需求。隨著微生物基因組、基因工程技術(shù)和發(fā)酵工程的發(fā)展，越來(lái)越多的研究利用經(jīng)過(guò)基因工程技術(shù)培養(yǎng)的工程菌合成一些具有較高價(jià)值或者難以人工合成的物質(zhì)[15]。利用工程菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化物質(zhì)，具有方便快捷、安全高效，降低成本等特點(diǎn)。其中大腸桿菌是研究人員常用的宿主菌，部分大腸桿菌的質(zhì)粒能夠編碼T7溶菌酶，能夠大量表達(dá)目的蛋白，而且能夠抑制宿主自身蛋白的正常表達(dá)[16]。有研究人員利用基因工程技術(shù)，將油菜黃單胞桿菌攜帶的苯丙氨酸4-羥化酶（P4H）、水稻攜帶的咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）基因以及白鏈霉菌的藻毒素合成基因構(gòu)建載體后導(dǎo)入到大腸桿菌中，并利用蛋白質(zhì)工程和代謝工程技術(shù)，成功地讓大腸桿菌大量表達(dá)褪黑素[17]。

1.2 褪黑素的生物學(xué)功能

1.2.1 褪黑素調(diào)節(jié)生物節(jié)律

褪黑素具有調(diào)節(jié)動(dòng)物晝夜節(jié)律的功能[18]，在夜晚，光照條件較弱的條件下，內(nèi)源性褪黑素大量合成，促進(jìn)并改善睡眠質(zhì)量。而在白天，受光照刺激，松果體分泌褪黑素會(huì)受到抑制[4]。有研究指出，外界光照條件變化能夠通過(guò)局部視覺(jué)器官（IOP）影響松果體合成并分泌褪黑素的水平，進(jìn)而調(diào)機(jī)體的睡眠狀態(tài)[19]。這提示，機(jī)體通過(guò)視覺(jué)器官感受外界光照變化，并將信號(hào)傳遞至松果體，由松果體將視覺(jué)器官傳遞來(lái)的光照變化信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)橥屎谒匦盘?hào)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的晝夜節(jié)律。Zhang等[20]通過(guò)基因編輯技術(shù)構(gòu)建褪黑素上調(diào)的下調(diào)的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)褪黑素上調(diào)的小鼠睡眠時(shí)間要明顯高于褪黑素下調(diào)的小鼠，試驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明了褪黑素對(duì)機(jī)體晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)作用。

1.2.2 褪黑素調(diào)節(jié)機(jī)體免疫

褪黑素具有免疫調(diào)節(jié)功能，在不同的炎癥情況下能夠表現(xiàn)出促炎作用和抑炎作用，能夠提高機(jī)體對(duì)外源或內(nèi)源抗原的抵抗力以及恢復(fù)力[21]。在血液中，褪黑素能夠刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（ROS），而適度產(chǎn)生的ROS能夠激活其他免疫細(xì)胞[22]，促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮防衛(wèi)功能。有研究指出，褪黑素能夠作用于人單核細(xì)胞U937的細(xì)胞膜表面的褪黑素受體1和褪黑素受體2（MT1、MT2），刺激胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧，并且產(chǎn)生的活性氧濃度不會(huì)造成細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[23，24]。激活后的單核細(xì)胞能夠分化為巨噬細(xì)胞并合成趨化因子以及相關(guān)炎癥因子從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。在其他研究中，褪黑素能夠作用于免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜表面的MT1，從而上調(diào)白細(xì)胞介素2（IL-2）受體的表達(dá)，并緩解前列腺素對(duì)IL-2的抑制作用[25]。另一方面，褪黑素在機(jī)體處于嚴(yán)重炎癥的情況下能夠表現(xiàn)出抑制炎癥的作用。由研究人員利用右旋糖酐硫酸鈉（DSS-）誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)炎癥和肝損傷，通過(guò)給予外源性褪黑素后，能夠增加短鏈脂肪酸的合成，緩解小鼠的神經(jīng)炎癥[26]。同時(shí)，褪黑素還能抑制小鼠腸道中法尼素X受體成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子15（FXR-FGF 15）和肝臟中凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）的過(guò)度激活，緩解腸道炎癥以及肝臟代謝紊亂。

1.2.3 褪黑素的抗氧化作用

褪黑素具有廣譜抗氧化活性[6]，能夠通過(guò)清除多余自由基、刺激內(nèi)源性抗氧化酶和提高其他抗氧化劑的效率等多種機(jī)制[27]限制氧化損傷。進(jìn)一步說(shuō)，褪黑素能夠通過(guò)氫原子轉(zhuǎn)移（Hydrogen Atom Transfer，HAT）、質(zhì)子耦合電子轉(zhuǎn)移（Proton Coupled Electron Transfer，PCET）、自由基加和物（Radical Adduct Formation，RAF）、單電子轉(zhuǎn)移（Single Electron Transfer，SET）、序貫電子質(zhì)子轉(zhuǎn)移（Sequential Electron Proton Transfer，SEPT）等機(jī)制直接清除機(jī)體內(nèi)過(guò)氧基（Peroxyl Radical，ROO）、羥基自由基（Hydroxyl Radical，OH）、氨氧基（Nitric Oxide，NO）等自由基[28]。Mekhloufi等[29]在體外構(gòu)建脂質(zhì)模型，并檢測(cè)褪黑素與氫過(guò)氧化物的清除作用，試驗(yàn)結(jié)果表明，褪黑素能夠直接與羥基自由基發(fā)生反應(yīng)并進(jìn)行清除。褪黑素還能夠螯合Cu2+、Fe2+、Zn2+、Al3+和Mn2+等有毒金屬離子[30]，降低金屬離子催化的分子損傷并抑制其與β-淀粉樣肽相互作用產(chǎn)生自由基[31]，間接發(fā)揮對(duì)機(jī)體的抗氧化及保護(hù)作用。有研究指出，褪黑素對(duì)Cu2+介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化[32]以及Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的金屬催化氧化（Metal-Catalyzed Oxidation，MCO）和蛋白質(zhì)損傷[33]具有保護(hù)作用。此外，褪黑素還能通過(guò)電子轉(zhuǎn)移的過(guò)程增加谷脫甘肽、抗壞血酸和水溶性維生素E的抗氧化作用[34]。

2 褪黑素對(duì)動(dòng)物繁殖的影響

褪黑素能夠作用于“下丘腦-垂體-性腺軸”調(diào)控動(dòng)物的繁殖活動(dòng)[35]，對(duì)動(dòng)物的生殖具有多方面的影響。在未成熟動(dòng)物體內(nèi)，褪黑素能通過(guò)抑制內(nèi)源性GnRH的分泌[36]來(lái)抑制其性成熟、自發(fā)性排卵和發(fā)情反應(yīng)[37]，在成熟動(dòng)物體內(nèi)，褪黑素又能起到一定的促進(jìn)作用[38]。這種現(xiàn)象在一定程度上說(shuō)明褪黑素對(duì)于未成熟動(dòng)物具有一定的保護(hù)作用，防止其由于過(guò)早參與繁殖活動(dòng)，造成生殖系統(tǒng)及其他組織器官的損傷。另一方面，在哺乳動(dòng)物中，下丘腦視交叉上核能夠通過(guò)視網(wǎng)膜下丘腦束接收光刺激，從而調(diào)節(jié)松果體合成并分泌褪黑素的節(jié)律性。褪黑素主要在在夜間分泌，分泌量與白天日照時(shí)間長(zhǎng)短成反比。通過(guò)這種方式將光周期信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)閯?dòng)物體內(nèi)褪黑素含量的變化，從而調(diào)節(jié)季節(jié)性發(fā)情的動(dòng)物的繁殖周期[39，40]。

2.1 褪黑素對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的影響

褪黑素能夠顯著改善雄性生殖系統(tǒng)的狀態(tài)，并且MT1和MT2能夠介導(dǎo)除褪黑素之外的其他激素信號(hào)，并上調(diào)睪丸激素水平[41]。在胚胎和幼年階段，褪黑素能夠通過(guò)與睪丸組織中的MT1和MT2結(jié)合，促進(jìn)雄性激素的分泌以及生殖系統(tǒng)的發(fā)育和成熟[42]。在成年后，褪黑素能夠促進(jìn)雄性激素的分泌以及精子的形成，并促進(jìn)季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物進(jìn)行繁殖活動(dòng)[43]。此外，褪黑素固有的抗炎作用以及抗氧化作用對(duì)雄性生殖系統(tǒng)也有幫助。有研究報(bào)道，褪黑素能夠提高冷凍保存的精原干細(xì)胞（SSCs）的存活率，減少由于凍融過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS[44]。另一方面，褪黑素對(duì)雄性動(dòng)物生殖疾病有良好的預(yù)防及治療作用。由革蘭氏陰性細(xì)菌引發(fā)的睪丸炎會(huì)抑制雄性激素的合成以及精子的發(fā)生，其細(xì)胞壁中的脂多糖（LPS）能夠與toll樣受體4結(jié)合并引起機(jī)體免疫系統(tǒng)做出反應(yīng)。而褪黑素能夠增強(qiáng)睪丸中巨噬細(xì)胞的吞噬能力，并抑制p38 MAPK通路和促進(jìn)Leydig細(xì)胞睪酮分泌來(lái)抑制TM促炎因子的分泌，從而抑制炎癥反應(yīng)[45]。

2.2 褪黑素對(duì)雌性生殖系統(tǒng)的影響

微觀(guān)上，褪黑素通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控畜禽的生殖激素的分泌，主要是GnRH和LH。有研究表明，外源褪黑素能夠上調(diào)腦部GnRH-1、GnRH-3和幾種GnRH受體的轉(zhuǎn)錄水平，且相同劑量下這種影響的程度受到外界光照條件的影響。這表明外源性褪黑素加強(qiáng)了已經(jīng)建立的GnRH系統(tǒng)的生理機(jī)制。另有研究表明，在雌性小鼠切除卵巢后能增加松果體分泌的褪黑激素的含量。但是在雄性小鼠體內(nèi)沒(méi)有觀(guān)察到這種現(xiàn)象。這表明GnRH可能參與調(diào)節(jié)成年雌性大鼠松果體褪黑激素的分泌[46]。

雌性動(dòng)物在排卵的過(guò)程中，線(xiàn)粒體能夠合成大量的褪黑素，不僅能夠清除因各種途徑產(chǎn)生的活性氧（ROS），還能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，在一定程度上提高畜禽的繁殖性能。Tian等[47]采用放射免疫法測(cè)定牛卵泡液中褪黑素的濃度約為10-11M，隨后的試驗(yàn)指出補(bǔ)充外源褪黑素能夠上調(diào)GDF9、MARF1、DNMT1a等卵母細(xì)胞成熟基因和PTX3、HAS1/2等卵囊擴(kuò)張相關(guān)基因，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。Tao[48]等通過(guò)構(gòu)建豬顆粒細(xì)胞（GCs）缺氧模型，并用褪黑素進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)褪黑素能夠降低ROS水平并提高超氧化物歧化酶1（SOD1）等抗氧化酶的表達(dá)、抑制GCs中caspase-3的激活、提高GCs的活力并減少凋亡。

畜禽在妊娠過(guò)程中容易產(chǎn)生妊娠并發(fā)癥導(dǎo)致子宮內(nèi)炎癥及自噬，褪黑素能夠抑制炎癥狀態(tài)下的IL-10、TNF和IL-6水平的升高[49]，改善妊娠過(guò)程。Lee等[50]對(duì)妊娠小鼠給予外源褪黑素，也得到了相似的結(jié)果。在畜禽的輔助繁殖技術(shù)方面，褪黑素能夠上調(diào)減數(shù)分裂后期標(biāo)記基因Dnmt3a和Bcl-2的表達(dá)并下調(diào)Bax表達(dá)，從而促進(jìn)精原干細(xì)胞向功能精子的分化[51]。劉佳慧等[52]在體外條件下用1 nmol/L褪黑素處理未成熟的豬卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可顯著改善卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量，抑制多精受精的發(fā)生。

2.3 褪黑素對(duì)早期胚胎發(fā)育的影響

褪黑素不僅能夠影響雌雄配子的形成，還能進(jìn)一步影響早期胚胎的發(fā)育。褪黑素能夠增加囊胚期細(xì)胞內(nèi)mt RNA 拷貝數(shù)、線(xiàn)粒體膜電位和線(xiàn)粒體的分布，抑制p53、Bax等凋亡基因表達(dá)并促進(jìn)SOD1、GPx4等抗氧化基因的表達(dá)，從而改善囊胚期胚胎線(xiàn)粒體功能，促進(jìn)早期胚胎發(fā)育并提高囊胚質(zhì)量[53]。MT1在胚胎發(fā)育早期就已經(jīng)開(kāi)始表達(dá)[54]，MT1在未卵裂的激活卵母細(xì)胞中主要分布于細(xì)胞膜上，隨著孤雌胚胎卵裂的進(jìn)行，受體表達(dá)量逐漸增加，主要表達(dá)定位于細(xì)胞膜上，隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行，MT1在卵裂球內(nèi)部開(kāi)始表達(dá)和分布，退化胚胎中MT1表達(dá)水平較低。王凱娟等[55]研究發(fā)現(xiàn)用10-9mol/L的褪黑素處理IVF受精后的卵泡，能顯著提高囊胚形成率以及優(yōu)質(zhì)囊胚率，提高胚胎質(zhì)量。佟桂芝等[56]在牛體外胚胎生產(chǎn)全程添加不同濃度梯度的褪黑素，發(fā)現(xiàn)10-9mol/L的褪黑素能夠顯著提高牛卵母細(xì)胞卵裂率、囊胚率及囊胚細(xì)胞數(shù)。此外，在胚胎附植過(guò)程中，褪黑素能夠結(jié)合MT2受體，促進(jìn)子宮內(nèi)膜接受態(tài)的建立。研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)褪黑素合成限速酶AANAT的表達(dá)量增加，且妊娠第二天的子宮腔上皮細(xì)胞和子宮腺中MT2受體特異表達(dá)[57]。注射補(bǔ)充15 mg/kg劑量褪黑素后，小鼠子宮內(nèi)膜厚度以及子宮腺密度上升，且著床部位的數(shù)量和窩仔數(shù)顯著上升。

2.4 褪黑素對(duì)乳腺泌乳的影響

動(dòng)物幼崽在剛出生的一段時(shí)間內(nèi)，機(jī)體無(wú)法合成內(nèi)源性褪黑素[58]，需要通過(guò)攝入母乳中的褪黑素來(lái)調(diào)節(jié)自身生物節(jié)律并促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育。因此，哺乳期母乳中的褪黑素含量對(duì)于幼崽的早期發(fā)育至關(guān)重要。馬騰等[59]構(gòu)建綿羊羊褪黑素合成限速酶基因AANAT和HIOMT的線(xiàn)性化表達(dá)載體，結(jié)合輸卵管移植術(shù)，成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)褪黑素合成酶的轉(zhuǎn)基因羊模型，且母乳中褪黑素含量顯著升高。楊?lèi)?ài)玲等[60]對(duì)該轉(zhuǎn)基因羊模型的生長(zhǎng)性能、多項(xiàng)生理指標(biāo)以及乳成分進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組綿羊無(wú)明顯差別，僅褪黑素和乳糖含量升高、體細(xì)胞數(shù)含量降低，推測(cè)原因可能是乳腺中的褪黑素含量上升，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能降低了乳中體細(xì)胞數(shù)。

3 總結(jié)與展望

褪黑素是連接外界光照條件變化與體內(nèi)生理活動(dòng)變化的關(guān)鍵信號(hào)分子，動(dòng)物眼睛的視網(wǎng)膜接收光照信號(hào)變化后將信號(hào)傳遞給松果體，隨后松果體將光照信號(hào)轉(zhuǎn)化為褪黑素，從而參與機(jī)體內(nèi)各項(xiàng)生理反應(yīng)。褪黑素能夠從多角度調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化和免疫反應(yīng)，并以此改善動(dòng)物的繁殖性能。隨著動(dòng)物輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)于動(dòng)物繁殖過(guò)程中的各種生理變化更加熟悉，也發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多限制動(dòng)物繁殖性能的問(wèn)題，前人的研究已經(jīng)充分顯示褪黑素對(duì)于提高動(dòng)物繁殖性能的作用，或許可以作為未來(lái)解決動(dòng)物輔助生殖的關(guān)鍵因素。但是對(duì)于不同物種或品種動(dòng)物，褪黑素及其異構(gòu)體的給藥方式仍需進(jìn)一步研究。