小麥硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因 TaNRT1.1的鑒定及其等位變異分析

王沙沙,黃紹敏,張珂珂,宋 曉,3

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院小麥研究所/河南省小麥生物學重點實驗室,河南鄭州 450002;2.河南省農(nóng)業(yè)科學院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所,河南鄭州 450002;3.河南省農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室,河南鄭州 450002)

相比于擬南芥和水稻,小麥硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白方面的研究主要集中在小麥NRT1基因家族成員的鑒定方面[6,24-26],而對于每個家族成員潛在的分子機制尚不清楚。因此,本研究擬克隆小麥硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因TaNRT1.1,并通過生物信息學分析、不同組織qRT-PCR分析及多態(tài)性篩選等方法對其進行研究,為解析小麥硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的生物學功能提供參考,并為進一步開發(fā)其功能標記及小麥分子標記輔助育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥品種許科168、鄭麥113、中育1211、周麥27、漯麥18和鄭品麥8號來自黃淮麥區(qū),具有不同的遺傳背景且氮利用效率差異明顯。取普通小麥中國春露地栽培自然生長的幼苗根、莖、葉,用于分析TaNRT1.1三個同源基因在小麥不同組織材料中的表達模式。取小麥品種周麥27、許科168、鄭麥113苗期的根,用于分析TaNRT1.1基因不同等位變異在小麥根中的表達模式。所有小麥品種均由河南省農(nóng)業(yè)科學院小麥研究所小麥營養(yǎng)與品質(zhì)研究室提供。

1.2 DNA、總RNA的提取及cDNA合成

參照Chen等[27]的SLS(十二烷基肌氨酸鈉)方法提取小麥種子DNA,并略有改進。利用Trizol法提取中國春幼苗的根、莖、葉總RNA。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa,大連)說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-20 ℃保存。

1.3 小麥 TaNRT1.1基因的克隆

根據(jù)水稻OsNRT1.1B基因(LOC_Os08g12780)序列,通過中國春參考基因組2.0以及Ensemble Plants進行同源Blast,獲得小麥硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因TaNRT1.1(TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B、TaNRT1-1D)及其cDNA序列。通過矮抗58數(shù)據(jù)庫(未公布)和已克隆的TaNRT1.1三個同源基因,獲得這三個同源基因的啟動子序列。

分別設計TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B、TaNRT1.1-1D基因的特異性引物TaNRT1.1-P1、TaNRT1.1-P2、TaNRT1.1-P3(表1),以中國春cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系25 μL,包括cDNA 100 ng,上、下引物(10 pmol·μL-2)各0.5 μL,10×Taqbuffer (Mg2+plus)2.5 μL,dNTP (2.5 mmol·L-1)0.5 μL、TaqDNA聚合酶1.25 U,滅菌ddH2O補足至25 μL(以上所有試劑均購自于北京天根生化科技有限公司)。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,55～60 ℃(各引物的具體溫度見表1)退火30 s,72 ℃延伸2 min,共35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。用含溴化乙錠(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行分離和檢測。之后利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工,上海)進行片段回收,回收的目的片段連接至pMD18-T克隆載體上,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。用單克隆菌落PCR檢測篩選陽性克隆,然后送至上海生工工程有限公司進行測序。用Chromos 2.4.3 (http：//technelysium.com.au/?page_id=13)和FinchTV 1.5.0(http：//www.geospiza.com/ Products/finchtv.shtml)軟件對測序結果進行可靠性檢驗和分析。最終選擇測序正確的單克隆(TaNRT1.1-1A-pMD18-T、TaNRT1.1-1B-pMD18-T和TaNRT1.1-1D-pMD18-T)進行搖菌,并提取質(zhì)粒,-20 ℃保存。

表1 本研究所有的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 小麥 TaNRT1.1基因的順式作用元件及其編碼蛋白的生物信息學分析

用SMART軟件(http：//smart.embl-heidelberg.de/)及NCBI-CDD (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測TaNRT1.1編碼蛋白的信號肽及結構域;用ProParam (http：//web.expasy.org/protparam/) 分析TaNRT1.1編碼蛋白的氨基酸數(shù)目、相對分子量、等電點等理化性質(zhì);用TMHMM 2.0在線軟件 (http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測TaNRT1.1編碼蛋白的跨膜區(qū);用SPOMA (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_opma.html)和SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org/workspace/)在線分析軟件預測TaNRT1.1編碼蛋白的二級結構和三級結構;用PSORT II Prediction(http：//psort.hgc.jp/form2.html)在線軟件進行亞細胞定位;用Plantcare在線軟件(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測TaNRT1.1基因啟動子的順式作用元件。

1.5 小麥 TaNRT1.1基因的表達模式及其等位變異分析

設計3個TaNRT1.1基因的熒光定量PCR特異性引物TaNRT1.1-P4、TaNRT1.1-P5、TaNRT1.1-P6以及小麥內(nèi)參基因β-actin的特異性引物。分別以合成的中國春幼苗根、莖、葉cDNA為模板,應用iQ5熒光定量擴增儀(伯樂,美國)進行擴增。PCR反應體系為20 μL,包括上、下游引物(10 pmol·μL-1)各0.4 μL、2×SYBR Premix Ex Taq II(TakaRa,大連)10 μL、cDNA模板2 μL、滅菌ddH2O補足至20 μL。PCR反應程序：95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 15 s,40個循環(huán);72 ℃ 10 min。每個樣品3次重復。采用2-△△CT方法分析TaNRT1.1基因在各組織中的表達情況。

另外,根據(jù)已克隆的TaNRT1.1基因序列,設計13對特異性引物(TaNRT1.1-P7～TaNRT1.1-P19)用于擴增其同源基因DNA序列及啟動子序列,具體引物見表1。其中,特異性引物TaNRT1.1-P10用于小麥TaNRT1.1基因的多態(tài)性篩選,所用小麥材料為1.1節(jié)提到的6個不同氮利用效率小麥品種。以合成的周麥27、許科168、鄭麥113苗期根cDNA為模板,用TaNRT1.1-1A基因的特異性引物TaNRT1.1-P4及小麥內(nèi)參基因β-actin引物(表1)用于分析TaNRT1.1-A不同等位變異在小麥根中的表達情況。

2 結果與分析

2.1 小麥 TaNRT1.1基因的克隆結果

按照1.3節(jié)中的方法,獲得水稻OsNRT1.1B基因在小麥中的三個同源基因,分別命名為TaNRT1.1-1A(TraesCS1A02G210900.1)、TaNRT1.1-1B(TraesCS1B02G224900.1)和TaNRT1.1-1D(TraesCS1D02G214200.1),其DNA序列全長分別為2 170、2 498和2 272 bp。序列分析發(fā)現(xiàn),這三個基因均由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成(圖1),其編碼序列長度均為 1 791 bp,可編碼596個氨基酸。以中國春cDNA為模板進行PCR擴增,將目的片段回收后,將其連接到pMD18-T克隆載體上,經(jīng)測序驗證,最終獲得小麥TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D的cDNA序列。

黑色方框代表 TaNRT1.1基因的外顯子序列;黑色方框之間的連線為內(nèi)含子序列。Black rectangular boxes represent the exons of TaNRT1.1gene;Lines between two black rectangular boxes represent the introns of TaNRT1.1gene.圖1 小麥 TaNRT1.1基因結構示意圖Fig.1 Schematic graph of the structures of TaNRT1.1gene in wheat

隨后,根據(jù)矮抗58數(shù)據(jù)庫(未公布)和已克隆的TaNRT1.1三個同源基因,并結合中國春的測序結果,成功獲得長度均為3 000 bp的三個同源基因的啟動子序列,分別是lcl|chr1A：373 762 258～373 765 258、lcl|chr1B：403 537 134～403 540 134和lcl|chr1D：299 571 952～299 574 952。

2.2 小麥 TaNRT1.1基因編碼蛋白的生物信 息學

用SMART在線軟件預測表明,小麥TaNRT1.1基因編碼的蛋白包含PTR2(peptide transport family 2)家族的兩個結構域,分別位于33～301 aa 和345～548 aa之間 (圖2A)。生物信息學分析表明,TaNRT1.1基因編碼的蛋白分子量為63.9 kD,理論等電點(pI)為7.55,為疏水性蛋白。用SOPMA軟件預測表明,蛋白二級結構由4種形式構成(圖2B),其中α-螺旋占比49.66%、延伸鏈占比12.58%、β轉(zhuǎn)角占比3.69%、無規(guī)則卷曲占比34.06%。用SMART和TMHMM 2.0軟件預測表明,該蛋白有跨膜結構區(qū),為膜蛋白,無信號肽(圖2C)。利用SWISS-MODEL進一步進行三級結構預測,結果表明,TaNRT1.1基因編碼的蛋白含有豐富的α螺旋和無規(guī)則卷曲,與二級結構預測結果一致(圖2D)。PSORT II Prediction軟件預測結果顯示,該蛋白主要定位在質(zhì)膜上。

A：結構域預測;B：二級結構預測;C：跨膜結構預測;D：空間結構預測。A：Domain prediction;B：Secondary structure prediction;C：Transmembrane structure prediction;D：Spatial structure prediction.圖2 小麥TaNRT1.1蛋白的生物信息學分析Fig.2 Bioinformatics analysis of TaNRT1.1 protein in wheat

2.3 小麥 TaNRT1.1基因啟動子的順式作用元件

為進一步研究小麥TaNRT1.1基因的調(diào)控機制,分別截取其起始密碼子上游2 000 bp的基因組序列,利用Plantcare在線軟件預測小麥TaNRT1.1基因啟動子區(qū)域的順式作用元件。結果(表2)發(fā)現(xiàn),小麥TaNRT1.1基因啟動子除含有一些基本元件(如TATA-box、CAAT-box)外,還富含光響應元件(如Box 4、GA-motif、GT1- motif等)、逆境響應元件(如CGTCA-motif、ARE、TCA-element、ABRE、MBS等)以及與生長發(fā)育有關的順式作用元件(如HD-Zip 1、RY-element、CAT-box、Circadian等)。

表2 小麥 TaNRT1.1基因啟動子區(qū)域具有特殊功能的順式作用元件Table 2 Cis-acting elements with special function of the promoter sequence of TaNRT1.1gene in wheat

2.4 小麥 TaNRT1.1基因的表達模式

對中國春小麥不同組織材料進行qRT-PCR檢測,結果(圖3)表明,TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D三個同源基因在根、莖、葉等組織中均有表達。其中,TaNRT1.1-1A和TaNRT1.1-1B基因均在根中表達量最高,葉中表達量次之,莖中表達量最低;而TaNRT1.1-1D基因在小麥莖中表達量最高,葉中表達量次之,根中表達量最低。

2.5 小麥 TaNRT1.1基因等位變異的檢測結果

根據(jù)宋 曉等[28]的研究結果,挑選6個氮利用效率差異明顯的小麥品種,利用13對特異性引物TaNRT1.1-P7～TaNRT1.1-P19對TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D三個基因DNA序列及啟動子序列進行PCR擴增并測序,發(fā)現(xiàn)在TaNRT1.1-1A基因啟動子上游1 120 bp的位置有一個8 bp(TGCATGCA)的插入位點(圖4),測序結果證實了該位點的可靠性。而TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D基因DNA序列及啟動子序列中均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。結合前期對TaNRT1.1基因啟動子順式作用元件預測的結果,發(fā)現(xiàn)該位點位于光響應元件Box 4和GT1-motif附近。因此,按照Mcintosh等[29]對基因的命名方法,將TaNRT1.1-1A基因啟動子上游 1 120 bp處按有無8 bp堿基插入分別命名為TaNRT1.1-1A-a和TaNRT1.1-1A-b。進一步研究發(fā)現(xiàn),TaNRT1.1-1A-a基因型主要存在于氮低效型小麥品種中,而TaNRT1.1-1A-b基因型主要存在于氮高效型小麥品種中(表3)。因此,推測TaNRT1.1基因可能與小麥氮利用效率相關。

圖柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5同。Different letters above columns mean significant difference(P<0.05)。The same in Fig.5圖3 小麥 TaNRT1.1三個同源基因在不同組織中的相對表達量Fig.3 Relative expression levels of TaNRT1.1homoeologs in different tissues of wheat

圖4 TaNRT1.1基因的多態(tài)性分析Fig.4 Polymorphism analysis of TaNRT1.1gene

表3 TaNRT1.1基因等位變異對6個小麥品種氮利用效率的影響Table 3 Effect of TaNRT1.1allelic variations on nitrogen use efficiency of the six wheat varieties

2.6 TaNRT1.1-1A基因兩種等位變異的表達模式

分別以1個氮低效型代表性小麥品種周麥27(基因型為TaNRT1.1-1A-a)和2個氮高效型代表性小麥品種許科168、鄭麥113(基因型為TaNRT1.1-1A-b)苗期的根cDNA為模板,對TaNRT1.1基因進行表達模式分析。實時熒光定量PCR結果(圖5)顯示,TaNRT1.1-1A基因在氮高效小麥品種苗期根中的相對表達量顯著高于在氮低效小麥品種中的相對表達量。推測TaNRT1.1基因可能正調(diào)控小麥氮利用效率。

圖5 許科168、鄭麥113和周麥27苗期根中TaNRT1.1基因等位變異的相對表達量Fig.5 Relative expression levels of TaNRT1.1 alleles in the seedling root of Xuke 168,Zhengmai 113 and Zhoumai 27

3 討 論

在此基礎之上,本研究首先同源克隆了水稻OsNRT1.1B基因在小麥中的三個同源基因TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D,并通過生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)這三個同源基因所編碼的蛋白均為疏水蛋白,含有豐富的α-螺旋和無規(guī)則卷曲,其亞細胞定位于質(zhì)膜上。此研究結果與郭志強等[26]的研究結果一致。另外,通過對小麥不同組織中三個同源基因TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D進行qRT-PCR分析,結果顯示,TaNRT1.1-1A和TaNRT1.1-1B基因在不同組織中表現(xiàn)出相似的表達模式,即根中表達量最高,葉、莖中次之。TaNRT1.1-1D基因的表達模式則不同,莖中表達量最高,葉、根中較低。因此,推測TaNRT1.1-1A和TaNRT1.1-1B基因在植物根從土壤中吸收硝酸鹽過程中發(fā)揮了重要作用,而TaNRT1.1-1D基因在硝酸鹽轉(zhuǎn)運方面發(fā)揮了重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn),TaNRT1.1-1A基因啟動子上游1 120 bp處存在新的8 bp插入位點。該8 bp的插入與TaNRT1.1基因的高表達、氮利用效率密切相關,且其位于光響應元件Box 4和GT1-motif附近,因此,可為研究TaNRT1.1基因啟動子區(qū)域光反應元件所發(fā)揮的作用提供參考。此外,由于本研究中用于篩選TaNRT1.1基因多態(tài)性的材料較少,未來仍需進一步探究TaNRT1.1-1A基因啟動子上游1 120 bp處8 bp的插入對小麥氮利用效率的影響。