病原微生物檢測技術方法研究進展

摘" 要" 病原微生物作為自然界中對人畜都能引起致病性的一類微小生物體，對人類健康造成了巨大威脅，極容易引起在全球范圍內的大流行，能夠快速、精準、高效的檢測出病原微生物，是擺在廣大醫(yī)學工作者面前亟待解決的課題. 本文從免疫學檢測技術、分子生物學檢測技術及病原微生物代謝學檢測技術三大方面綜述了病原微生物的檢測方法，旨在為能夠快速、有效的檢測出病原微生物提供參考.

關鍵詞" 病原微生物；免疫學；分子生物學；檢測技術；研究進展

中圖分類號" R914.5" " 文獻標識碼" A

微生物在自然界中廣泛分布，屬于形體微小、種類及數(shù)量繁多的一類低等生物體，其中，對人和動物能夠產(chǎn)生致病性的一類微生物，稱為病原微生物. 近年來，由病原微生物引起的疾病，如禽流感（H7N9）、非典型肺炎（SARS）以及目前仍在全球肆虐的新型冠狀病毒（2019-nCoV）等所感染的疾病，傳染性都極強，通常能夠造成世界性的大流行[1-4]，因此在對病原微生物的檢測方面，務必要做到精準、快速、高效和簡便. 有效的病原微生物檢測方法，能夠在很大程度上提高檢測的時效性、精準性，在醫(yī)學、食品等領域發(fā)揮重要作用.

本文對病原微生物的不同檢測技術進行了概括總結，同時對不同檢測技術進行了分析對比，以期為進一步開發(fā)新的病原微生物檢測技術奠定基礎.

1" 病原微生物免疫學檢測技術

病原微生物的免疫學的檢測技術，主要是通過抗原與抗體的相關反應，將食品、藥品以及傳染病中涉及到的病原微生物檢測出來.

1.1" 酶聯(lián)免疫吸附檢測技術（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA），是通過將抗原或者抗體吸附在相關載體上，同時用一些酶對其標記，與吸附在載體上的抗原或者抗體進行結合，形成一些免疫復合物，與此同時，分析被酶分解的相關底物顏色信號的改變，對其實現(xiàn)定量或定性分析[5-7]. ELISA檢測具有時間短、特異性高以及靈敏度非常強等優(yōu)點，當然，亦伴隨一些重復性較差、檢測過程較為繁雜等弊端[8-11].

近年來，通過特殊的光電磁等新型材料的問世，對新型ELISA檢測技術的開發(fā)帶來了機遇. 基于新型材料的改良的ELISA中，Jiang等人通過構建辣根過氧化物酶介導的反應，從而調節(jié)聚合物AuNPs的聚集狀態(tài)[12]. 通過圖1可以看出，通過過氧化物的調節(jié)，對碘化物進行氧化，生成相應的碘單質，誘導金納米粒子的聚集，顏色由紅色轉變?yōu)樗{色.

基于新型熒光納米材料的改變，有研究提出了熒光免疫的設計，進而開發(fā)了改進型ELISA及熒光免疫測定法（FELISA）. XU等[13]研究開發(fā)了通過CAT調節(jié)的熒光轉換方法，用于測定伏馬毒素B1（FB1），如圖2所示，通過H2O2對巰基丙酸介導CdTe的熒光點進行淬滅，在檢測中，通過調節(jié)H2O2的濃度，進行對被測物進行檢測[14].

此外，基于電化學免疫分析、光熱效應、表面增強拉曼散射、化學發(fā)光免疫分析等設計的ELISA測定方法，在病原微生物檢測上得到了非常廣泛的應用，同時由于這些方法的簡便、靈活，且能夠用于痕量檢測等優(yōu)點，展現(xiàn)出了非常大的應用前景.

1.2" 免疫磁珠分離技術（IMBS）

免疫磁珠分離技術，是通過以免疫學為基礎，結合活性蛋白質，且被磁鐵吸引，從而將抗體與磁鐵結合，使得磁鐵成為相應載體，進而形成抗原-抗體-磁珠復合物，形成的復合物在外在磁力的作用下，產(chǎn)生力學變化，達到與其它物質分離，能夠特異性的分離抗原的方法[15]. 此方法現(xiàn)已經(jīng)涉及到微生物、生化、藥理以及病例等各個領域，在免疫學檢測及生物學檢測等方面應用廣泛[16-17].

有研究顯示[18]，通過使用IMBS分離技術能夠有效檢測出豬肉中的志賀氏菌等病原微生物. 亦有報道利用IMBS分離技術，從污染菌的試樣中，富集了李斯特菌[19]. 現(xiàn)在關于免疫磁珠分離技術能夠與多種微生物檢測技術結合，能夠有效實現(xiàn)對食源性病原微生物的快捷、高靈敏度的檢測[20]. IMSB結合PCR技術、電化學技術以及培養(yǎng)基分離技術等，實現(xiàn)了高效、精準等特點的高通量篩選，且能夠實現(xiàn)在4 h以內，快速確定病原微生物的檢測[21-23]，特別是在布氏桿菌、大腸桿菌的檢測上效果較好. 免疫磁珠分離技術在微生物等領域得到有效應用的同時，亦有一定的不足之處，在操作過程中涉及到陽性分選法及陰性分選法，在陽性分選法中，需要對特異性的靶細胞進行標記，可能引起細胞活化，在陰性分選法時，會需要多種抗體來標記不需要的細胞.

2" 病原微生物分子生物學檢測技術

近年來，分子生物相關檢測技術在病原微生物檢測上的應用突飛猛進，在很大程度上解決了病原微生物檢測時限長、精準性不高等問題，為病原微生物檢測技術的發(fā)展指引了研究方向.

2.1" 聚合酶鏈式反應檢測技術（PCR）

聚合酶鏈式反應是一種擴增DNA片段的特殊技術，可以看成是一種特殊的分子生物技術中的DNA復制技術，能夠將微量的DNA片段大幅度增加. PCR反應的特點主要表現(xiàn)在特異性強、靈敏度高以及簡便快速等方面. 同時，PCR技術在病原微生物的檢測領域應用也非常廣泛. 有研究顯示[24]，利用多重PCR擴增技術，對在低溫儲存的肉類食品進行了病原微生物的檢測. 亦有實驗表明[25]，在檢測蝦米中沙門氏菌的實驗中，PCR檢測技術，比傳統(tǒng)的檢測技術所用的時間大大降低. Agarwal A等[26-27]通過PCR方法檢測出了食品中的致病微生物沙門氏菌. 同樣，Kim J等[28-29]通過多重PCR方法，檢測小麥中的病原微生物的污染情況，發(fā)現(xiàn)了鼠傷寒沙門氏菌以及大腸桿菌等，此方法具有很高的特異性，且對難以辨別的病原微生物具有較好的識別，當然PCR檢測方法亦有一定的局限性，如只能檢測微生物的存在，在微生物產(chǎn)生的毒素檢測方面效果較差，同時會出現(xiàn)假陽性或者假陰性結果.

2.2" 核酸探針檢測技術

核酸探針技術主要是通過核苷酸堿基對互補的原理，用特異的基因探針對不同堿基對，進行特異性的識別，從而檢測被測序列. 核酸檢測探針，一般主要分為傳統(tǒng)及功能化的核酸探針，傳統(tǒng)核酸檢測探針主要包括克隆探針等[30]，而功能化的探針包括核酶及核酸適配體等. 核酸檢測技術在病原體檢測的應用上起到了非常重要的作用.

構建雙標熒光團適配體核酸探針，能夠更好的提高定量檢測限. 有研究提出了一種基于核酸適配子的赭曲霉毒素A熒光生物傳感器的檢測方法. 它由核糖核酸酶H輔助的循環(huán)反應導致信號的顯著放大，這使得檢測下限為0.08 ng/mL. 利用該技術發(fā)現(xiàn)赭曲霉毒素A對赭曲霉毒素B和黃曲霉毒素B1具有較高的選擇性. 在實際樣品中使用不同濃度的赭曲霉毒素A對紅酒樣品進行了定量驗證，回收率范圍為96.1%～107.5%. 該核酸適配子在食品工業(yè)中具有重要的實際應用價值，并且可以通過替代識別核酸適配子的序列，將其擴展到其他毒素的檢測中[31]. Zhu等人構建了基于單壁碳納米管（SWCNTs）的適配體檢測探針，利用單壁碳納米管的過氧化物酶樣活性和非特異性DNA序列對這種活性的影響，通過將3種DNA序列（mDNA）進行修飾，構建了一種比色探針，最終，我們實現(xiàn)了12例臨床腫瘤患者溶解血液中循環(huán)腫瘤細胞的精確定量，具有良好的臨床應用前景[32].

2.3" 基因芯片檢測技術

生物芯片又稱基因芯片，是通過微加工技術，將數(shù)以萬計一定序列的DNA片段固定在硅片的表面，形成規(guī)律性的DNA探針序列，基因芯片能夠對不同序列的微生物樣品進行檢測，在病原微生物領域有著非常廣泛的應用.

有研究顯示[33]，通過基因芯片技術對金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等進行檢測，在短時間（＜8 h）內，就能夠得到精準的檢測結果. 亦有研究報道[34]，將奇異變形桿菌及大腸埃希菌等，同時進行基因芯片檢測，在極低的檢測濃度下，亦能進行有效的檢測.

生物基因芯片檢測技術是一種微量分析技術，具有重復性好、精準、快速等特點，在臨床研究中亦有很好的應用[35].

3" 病原微生物代謝學檢測技術

3.1" 三磷酸腺苷（ATP）生物發(fā)光技術

ATP生物發(fā)光檢測法，主要是通過ATP與熒光素酶復合物結合，用來測定食品、醫(yī)藥等中的微生物的總數(shù). 由于每種微生物細胞中的ATP的具體含量值是一定的，所以供試樣品中的ATP含量與微生物的數(shù)量呈正比，這種測定技術能夠在15 s內測定出結果，靈敏度極高.

有研究報道[36]，將果蔬切成片狀，制作成供試品的菌液體，檢測試樣中的ATP的含量，進而換算出細菌數(shù)量，間接性的測定果蔬中有無病原微生物. 若供試樣品中含有很多非細胞性的ATP時，此檢測方法的應用范圍可能受到較大程度的限制[37]. 一般來說，ATP發(fā)光技術檢測微生物，可實現(xiàn)精準、穩(wěn)定、快速檢測微生物總數(shù)的需求，但設備比較昂貴，對儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高. 檢測時需要預處理，去除胞外游離的ATP.

3.2" 電阻抗技術

電阻抗技術病原微生物檢測的應用中，主要是對應蛋白質、脂肪以及碳水化合物的含量進行測量，通過將大分子物質代謝轉變成小分子，提高檢測培養(yǎng)基的導電性變化，改變電阻大小，進而測定其中有無微生物存在，通過此技術能夠有效測定樣品中的病原微生物的數(shù)量，在測定酵母菌、霉菌以及沙門氏菌方面得到了很好的應用[38-40]. 此方法與傳統(tǒng)的測定方法相比，具有時間短、特異性強以及重現(xiàn)性好等特點[41-42]. 有研究通過對電阻抗方法與傳統(tǒng)的檢測方法進行比較，實驗結果發(fā)現(xiàn)，電阻抗方法共檢測出119種病原微生物，而傳統(tǒng)的方法僅僅檢測出92種病原微生物. 當然，電阻抗技術的應用還有一些缺陷. 主要是其不能在污染的標本中，把可能存在的病原菌同污染菌加以區(qū)別，同時不能用于較少菌數(shù)的檢測，而且樣品中不能使用防腐劑，且其在制作標準曲線的過程中工作量較大[43].

3.3" 放射測量技術

放射測量技術的病原微生物檢測原理，主要是通過微生物在生長繁殖的過程中，代謝產(chǎn)生二氧化碳. 通過碳水化合物，把放射性的14 C標記原子引入其中，在病原微生物代謝時，產(chǎn)生放射性的二氧化碳，接著通過測量14 C標記的二氧化碳的量，間接的判定病原微生物的數(shù)量，放射量與菌數(shù)成正比，此測定方法具有時效性高、精準度高等優(yōu)點[44]. 有研究報道[45]，通過放射量技術對食品中的微生物進行檢測. 一般來說，放射量檢測技術，對操作人員的要求較高，因在其應用過程中，使用了放射性的物質，使用上受到了較大限制，目前在大腸桿菌、酵母菌的檢測項目中應用較多.

4" 展望

良好的病原微生物檢測方法，能夠在很大程度上提高檢測的高效性，在流行病學等領域發(fā)揮重要作用. 目前針對仍在全球范圍內大流行的新型冠狀病毒的有效檢測，就顯得尤為重要，其檢測方法主要包括核酸檢測（全基因測序技術、聚合酶鏈式反應、等溫擴增技術等）、免疫檢測（血清學檢測、ELISA、膠體金免疫層析技術、化學發(fā)光免疫分析法等）、醫(yī)學影像生物學檢測等[46-47].

本文通過闡述病原微生物不同檢測方法，分析了各種檢測方法的特點及優(yōu)勢，同時分析對比了不同的檢測方法之間的差異，詳見表1，旨在為進一步開發(fā)新的病原微生物檢測技術奠定基礎. 隨著人們對病原微生物的深入了解，依據(jù)微生物特點研發(fā)的各種檢測設備儀器，將會在醫(yī)藥學、食品行業(yè)等病原微生物檢測領域廣泛運用，為人類健康發(fā)展保駕護航.

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Research Progress of Pathogenic Microorganism Detection Technology

YIN Wei1， 2， 3， HU Qi2， LI Xinzhang2， ZHANG Shuang3， FAN Gaofu1

（1. School of Bioengineering， Hefei Vocational and Technical College， Hefei 238000， Anhui， China;

2. Chemical Composition Extraction， Separation and Identification Center of Nantong Rui Feng

New Material Technology Co Ltd， Nantong 226000， Jiangsu， China;

3. Department of Polymer Science and Engineering， University of Science and Technology of China，

Chinese Academy of Sciences Key Laboratory of Material Chemistry， Hefei 230026， Anhui， China）

Abstract" Pathogenic microorganisms， as a kind of tiny organisms that can cause pathogenicity to both humans and animals in nature， pose a great threat to human health and are very likely to cause a global pandemic. It is an urgent issue for the majority of medical workers to detect pathogenic microorganisms quickly， accurately and efficiently. This article reviews the detection methods of pathogenic microorganisms from three aspects： immunological detection technology， molecular biological detection technology and pathogenic microbial metabolism detection technology， in order to provide reference for the rapid and effective detection of pathogenic microorganisms.

Keywords" pathogenic microorganisms; immunology; molecular biology; detection technology; research progress