溫州地區(qū)3 620例孕婦耳聾基因產(chǎn)前篩查及臨床意義分析

王智慧 吳潔麗 項延包

先天性耳聾是人類最常見的出生缺陷之一。據(jù)報道，每1 000 名新生兒中約有1.5 例存在聽力障礙，其中超過一半與遺傳因素有關[1]。大約90%的先天性耳聾患兒出生在聽力正常的家庭[2]，因此國家近10 年來廣泛開展對新生兒耳聾基因的篩查，達到對耳聾患兒早期診斷及早期治療的目的[3]。如能將遺傳性耳聾基因攜帶者篩查提早到孕期，了解孕婦群體耳聾熱點基因突變攜帶情況，有助于臨床作出準確的產(chǎn)前咨詢及產(chǎn)前診斷，達到優(yōu)生優(yōu)育的目的。本研究以溫州市中心醫(yī)院產(chǎn)前門診的3 620 例聽力正常、無耳聾家族史的孕婦為研究對象，進行常見遺傳性耳聾基因篩查，并對夫妻雙方攜帶同種基因的胎兒進行產(chǎn)前診斷，了解本地區(qū)常見遺傳性耳聾基因突變頻率和分布特征，以期為耳聾精準防控提供遺傳學依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2020 年2 月1 日至2022 年7 月31 日在本院產(chǎn)前門診，無耳聾家族史且未曾接受耳聾基因攜帶者篩查的孕婦為研究對象，共納入3 620 例聽力正常的孕期女性，年齡21～43 歲，孕周＜18 周。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批件號：K2020-00-001），受檢者知情同意并簽署知情同意書后接受耳聾基因篩查。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 （1）口腔唾液標本采集：漱口后30 min，以專用唾液采集器留取口腔唾液5 ml，參照說明書提取唾液標本DNA（愷碩生物科技廈門股份有限公司試劑盒，備案號：閩廈械備20160003）。（2）胎兒羊水DNA 提?。哼M入產(chǎn)前診斷的孕婦于孕中期（17～26 周）在超聲引導下抽取羊水10 ml，采用德國QIAGEN 公司QIAamp DNA mini Kit 抽提試劑盒參照說明書抽提羊水基因組DNA。取2 μl DNA 樣本用紫外分光光度計進行定量和純度檢測。

1.2.2 孕婦耳聾基因檢測方法及判讀 采用廣州凱普醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（備案號：粵穗械備20170043），采用PCR+導流雜交法檢測4個常見耳聾基因21個位點，具體如下。6 個GJB2 位點：c.35delG、c.167delT、c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT、c.508_511dupAACG；11 個SLC26A4 位點：c.281C＞T、c.589G＞A、c.1174A＞T、c.1226G＞A、c.1229C＞T、c.1975G＞C、c.2027T＞A、c.2162C＞T、c.2168A＞G、IVS7-2A＞G、IVS15+5G＞A；2 個GJB3 位點：c.538C＞T、c.547G＞A；2 個線粒體12S rRNA 位點：m.1494C＞T、m.1555A＞G。首先行PCR 法擴增（杭州博日PCR 儀）：采用PCR 法，對檢測范圍為4 個基因的目標位點位置用特異性引物進行目的片段的擴增，特異性引物的設計是專門針對目標位點，覆蓋該位點上下游的100～200 bp 序列。然后進行導流雜交：將擴增產(chǎn)物與標記不同突變類型遺傳性耳聾基因探針的尼龍膜在導流雜交儀上進行導流雜交。最后通過化學顯色對結果進行判讀：正常探針及對應的突變探針位點都出現(xiàn)藍紫色斑點，為該位點的雜合突變或異質突變；突變探針出現(xiàn)藍紫色斑點，而對應的正常探針位點沒有出現(xiàn)藍紫色斑點，為該位點的純合突變或均質突變。

1.2.3 GJB2、SLC26A4 基因攜帶者干預方案 GJB2、SLC26A4 基因為常染色體隱性遺傳病，當夫妻雙方均為相同基因攜帶者，后代有25%概率發(fā)生耳聾的風險。因此，對于孕婦檢測結果顯示GJB2 或SLC26A4 基因突變攜帶者時，召回其配偶進行相應基因Sanger 測序，若夫妻雙方均攜帶有相同突變耳聾基因，在知情同意情況下，建議在孕中期（孕17～26 周）抽取羊水對胎兒進行產(chǎn)前診斷及相應的突變位點檢測，進入產(chǎn)前診斷的孕婦同時行羊水胎兒染色體檢查。

1.2.4 GJB3、線粒體12S rRNA 攜帶者干預方案 對于GJB3 基因攜帶者，有文獻報道與高頻聽力損傷有關，會導致遲發(fā)性聽力受損[4]，僅予遺傳宣教，注意聽力變化，不進行配偶篩查及產(chǎn)前診斷。對于孕婦檢測結果提示為m.1494C＞T、m.1555A＞G 攜帶者，因其為線粒體的母系遺傳，為氨基糖苷類抗生素敏感個體，予告知應終生絕對禁止使用氨基糖苷類抗生素，以避免耳聾的發(fā)生。

1.3 觀察指標 （1）孕婦耳聾基因篩查結果；（2）耳聾基因攜帶者配偶基因檢測及產(chǎn)前診斷結果。

2 結果

2.1 孕婦耳聾基因篩查結果 3 620 例聽力正常孕婦接受耳聾基因篩查，共檢出攜帶常見耳聾基因突變者163 例（4.50%）；檢出5 種GJB2 基因突變共85 例，其中c.235delC 突變率最高，共65 例（1.80%）；檢出6 種SLC26A4 基因突變共44 例，其中IVS7-2A＞G 突變率最高，共33 例（0.91%），見表1。

表1 3 620 例孕婦耳聾基因篩查結果

2.2 耳聾基因攜帶者配偶基因檢測及產(chǎn)前診斷結果 在163 例孕婦耳聾基因攜帶者中，共有129 例為GJB2、SLC26A4 基因攜帶者，對其配偶進行召回，并建議其配偶進一步行相應基因測序，結果共有118 例配偶進行了耳聾相應基因的Sanger 測序，檢出8 例攜帶者，其中1 例因胎兒多發(fā)畸形引產(chǎn)未做產(chǎn)前診斷，7 例進行羊水穿刺染色體培養(yǎng)加染色體微陣列分析（CMA）及耳聾基因鑒定，結果1 例為GJB2 c.235delC純合突變，1 例為SLC26A4 c.2168A＞G 和SLC26A4 IVS7-2A＞G 復合雜合突變，患者選擇終止妊娠。1 例染色體檢查確診為21-三體綜合征引產(chǎn)，見表2。

表2 118 例耳聾基因攜帶者配偶耳聾基因攜帶情況及產(chǎn)前診斷結果

3 討論

耳聾嚴重影響人類生活質量，根據(jù)是否伴有耳外組織病變分為綜合征型和非綜合征型耳聾，其中約70%的非綜合征型耳聾與遺傳因素有關，目前沒有有效的治療手段。迄今為止，已鑒定出非綜合征型耳聾基因至少124 個（https://hereditaryhearingloss.org，其中已鑒定出78 個基因與常染色體隱性遺傳的非綜合征型耳聾相關，截至2021 年8 月30 日）。因此耳聾基因攜帶者篩查和產(chǎn)前診斷是預防遺傳性非綜合征型耳聾患兒出生或外界因素導致的聽力損失最直接有效的方法。本研究采取口腔唾液標本，對我國常見的4個耳聾基因中的21 個致病位點進行篩查。自2020 年2 月1 日 至2022 年7 月31 日 共3 620 例聽力正常且無耳聾家族史的孕婦接受耳聾基因篩查，發(fā)現(xiàn)總共有163 例攜帶者，提示溫州地區(qū)孕婦群體中常見耳聾基因的攜帶率約為4.5%，略低于沈陽地區(qū)孕期聽力正常女性遺傳性耳聾基因攜帶率[5]，與武漢地區(qū)聽力正常人群耳聾基因攜帶率相似[6]。

GJB2 基因位于13 號染色體13q12.11 區(qū)域，是最常見的致聾基因，約50%的常染色體隱性遺傳性耳聾患者存在GJB2 基因突變[7]。GJB2 基因在不同地域、不同種群中熱點突變位點不同，c.35delG、c.167delT、c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT、c.508_511dupAACG 為我國多區(qū)域常見的致聾位點，臨床上常將這些基因突變位點作為普通感音神經(jīng)性耳聾患者的檢測位點，其中c.235delC 是我國人群攜帶率最高的位點，也是溫州地區(qū)非綜合征型耳聾主要致聾基因位點[8]。在本研究中，檢出5 種GJB2 基因突變共85 例，其中65 例為c.235delC 攜帶者，攜帶率為1.80%（65/3 620），占全部耳聾基因攜帶者的39.88%（65/163），這與我國惠州地區(qū)篩查結果相近[9]。其次為c.299_300del AT 雜合突變共9 例，占5.52%（9/163）；c.176_191del16雜合突變5 例，占3.07%（5/163）；c.508_511dupAACG 雜合突變4 例，占2.45%（4/163），c.35delG 突變2 例，占1.23%（2/163），提示溫州地區(qū)GJB2 熱點基因攜帶譜較廣，且檢出率高，攜帶者篩查具有重要意義。

SLC26A4 基因突變與大前庭導水管綜合征有關，臨床表現(xiàn)為出生時聽力正?；蜉p度至重度聽力下降，但因為墜床、兒童玩耍、跌倒或輕度碰撞等情況致聾，稱為“一巴掌耳聾”，臨床影像學診斷較為困難。筆者團隊前期針對溫州地區(qū)187 例耳聾患者的研究發(fā)現(xiàn)，溫州地區(qū)非綜合征型耳聾患者SLC26A4 基因攜帶率達11.76%，其中c.919-2A＞G（IVS7-2A＞G）、c.2168A＞G 是溫州地區(qū)SLC26A4 基因突變最主要的類型[10]。本研究針對SLC26A4 基因在我國人群中常見的11 個位點進行攜帶者篩查，共檢出6 種SLC26A4 基因突變位點共44 例，攜帶率為1.2%，其中IVS7-2（A＞G）突變率最高，共33 例（0.91%），其余位點攜帶率較低，這與筆者團隊前期對溫州地區(qū)耳聾患者的檢測結果相同[10]，提示IVS7-2A＞G 為本地區(qū)SLC26A4 基因致聾最常見的突變位點。

m.1555A＞G 和m.1494C＞T 是12S rRNA 基因的主要致病突變，已被證實與氨基糖苷類抗生素誘導的聽力損失有直接關系[11]，以母系遺傳為特點，一人檢出，便提示所有母系親屬均為攜帶者，有藥物致聾風險。一項關于新生兒聽力篩查的研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有12S rRNA 攜帶者都通過了聽力測試，因此不能通過體格檢查鑒別出是否為該基因攜帶者，這類攜帶者如使用氨基糖苷類抗生素就會導致不可逆的耳聾，基因篩查可有效避免此類不良事件的發(fā)生[12]。本研究中，有13例孕婦是m.1555A＞G 攜帶者，2 例孕婦為m.1494C＞T攜帶者。如果這類孕婦的嬰兒出生后使用氨基糖苷類抗生素，會發(fā)生不可逆的聽力損失。本研究幫助這15 個家庭的孩子避免氨基糖苷類抗生素引起的藥物性耳聾等情況的發(fā)生。

GJB3 中c.538C＞T 和c.547G＞A 位點的變異為常染色體顯性遺傳，已證明主要導致高頻聽力損失[13]，被認為是遲發(fā)性耳聾的原因之一[14]。GJB3 雖為我國耳聾基因篩查常規(guī)項目之一，但目前沒有明確依據(jù)證明該基因為耳聾患者的根本致病位點[15]，本研究共篩查出14 例為c.538C＞T 攜帶者，5 例為c.547G＞A 攜帶者，針對這19 例攜帶者，筆者團隊僅建議其避免接觸高頻聲音，并注意聽力變化。

本研究通過電話隨訪并對85 例GJB2 攜帶者及44例SLC26A4 攜帶者的配偶進行召回，結果118 例配偶接受耳聾基因檢測。本研究采用Sanger 測序法對配偶攜帶的相應基因進行測序，發(fā)現(xiàn)8 例為攜帶者，其中1例因胎兒多發(fā)畸形引產(chǎn)拒絕基因檢測，7 例進行羊水穿刺產(chǎn)前診斷，結果1 例為GJB2 c.235delC 純合突變，1 例為SLC26A4 c.2168A＞G 和SLC26A4 IVS7-2A＞G復合雜合突變，患者選擇終止妊娠。1 例染色體檢查確診為21-三體綜合征引產(chǎn)，筆者建議胎兒耳聾基因檢測時同時行染色體檢查。

綜上所述，溫州地區(qū)孕婦群體4 種常見耳聾基因的攜帶率約為4.5%，GJB2 基因c.235delC 位點、SLC26A4 基因IVS7-2A＞G 位點是溫州地區(qū)孕婦群體常見的耳聾基因變異位點，通過對溫州地區(qū)聽力正常的孕婦進行遺傳性致病性耳聾基因篩查，有助于對攜帶者進行遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷，實現(xiàn)遺傳性耳聾的二級預防，提高出生人口素質，實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。