ApoD對多巴胺能神經(jīng)元Basigin表達(dá)影響

欒夢瑤 閻春玲 姜宏

［摘要］ 目的

探究載脂蛋白D（Apo D）對多巴胺能神經(jīng)元Basigin（BSG）蛋白表達(dá)的影響。

方法 小鼠側(cè)腦室埋入不銹鋼管套，并給予外源性Apo D處理。培養(yǎng)鼠多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞MES23.5細(xì)胞，并給予外源性Apo D處理。采用Western Blotting方法分別檢測小鼠黑質(zhì)區(qū)和MES23.5細(xì)胞中BSG蛋白表達(dá)變化。

結(jié)果 與對照組相比，給予外源性Apo D組黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元和MES23.5細(xì)胞的BSG蛋白表達(dá)水平均明顯上升（t=2.299、3.408，P<0.05）。

結(jié)論 外源性Apo D能夠促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元BSG蛋白表達(dá)。

［關(guān)鍵詞］ 載脂蛋白D類；Basigin；多巴胺能神經(jīng)元

［中圖分類號］ R338.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）06-0832-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.100

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230807.0914.001;2023-08-07 16：33：58

EFFECT OF APOLIPOPROTEIN D ON THE PROTEIN EXPRESSION OF BASIGIN IN DOPAMINERGIC NEURONS

LUAN Mengyao， YAN Chunling， JIANG Hong

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of apolipoprotein D （Apo D） on the protein expression of Basigin （BSG） in dopaminergic neurons.

MethodsStainless steel tubes were placed in the lateral ventricle of mice， followed by the treatment with exogenous Apo D. Mouse dopaminergic neurons MES23.5 cells were cultured and treated with exogenous Apo D. Western Blotting was used to measure the change in the protein expression of BSG in the substantia nigra and MES23.5 cells.

Results

Compared with the control group， the exogenous Apo D group had a significant increase in the protein expression level of BSG in both neurons in the substantia nigra and MES23.5 cells （t=2.299，3.408;P<0.05）.

ConclusionExogenous Apo D can promote the protein expression of BSG in dopaminergic neurons.

［KEY WORDS］apolipoproteins D; Basigin; dopaminergic neuron

載脂蛋白D（Apo D）于1963年被首次發(fā)現(xiàn)，是人類血漿脂蛋白系統(tǒng)的一個(gè)獨(dú)立成分，屬于脂肪鈣超家族［1］。在人體內(nèi)多種器官和組織中均檢測到Apo D的表達(dá)，其廣泛表達(dá)表明Apo D在體內(nèi)具有重要作用［2］。在多種神經(jīng)退行性疾病中發(fā)現(xiàn)大腦及腦脊液中Apo D的表達(dá)升高［3-4］。在帕金森病病人中，表達(dá)升高的Apo D可能是作為一種抗氧化保護(hù)劑來應(yīng)對多巴胺能神經(jīng)元損傷［4］。在體外模擬阿爾茲海默病和帕金森病的情況下Apo D也能夠保護(hù)細(xì)胞［5］。但Apo D對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用具體機(jī)制仍不明確。Basigin （BSG）是免疫球蛋白超家族的成員，在體內(nèi)介導(dǎo)多種物質(zhì)的識別和轉(zhuǎn)運(yùn)［6］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，BSG高表達(dá)于腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和大腦的各個(gè)亞區(qū)［7］。在多種神經(jīng)退行性疾病中BSG的表達(dá)升高［8-9］。2015年有研究發(fā)現(xiàn)，BSG能夠作為Apo D內(nèi)化的受體，并影響著Apo D的神經(jīng)保護(hù)作用［10］。但Apo D和BSG的相互作用仍有待進(jìn)一步研究。本研究旨在探討外源性Apo D對多巴胺能神經(jīng)元BSG蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康雄性 C57BL/6小鼠 40 只，10～12 周齡，體質(zhì)量（26±2）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。小鼠置于安靜環(huán)境下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：室溫（19±2）℃，12 h-12 h晝夜循環(huán)光照，可自由飲水、取食。MES23.5細(xì)胞系是由小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系N18TG2及大鼠胚胎中腦細(xì)胞融合而成的多巴胺能神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。DMEM-F12（1∶1）培養(yǎng)液購于美國Hyclone公司，胎牛血清（FBS）購于以色列Biological Industries公司，青鏈霉素混合液購于北京索萊寶公司，多聚賴氨酸購于德國Sigma公司，β-Tublin抗體購于美國CST公司，BSG抗體及羊抗兔IgG-HRP購于上海愛必信公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠單側(cè)腦室埋管術(shù) 術(shù)前小鼠禁食12 h，腹腔注射80 g/L水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后充分暴露顱骨，立體定位儀定位，用三棱針于顱骨表面?zhèn)饶X室代表區(qū)鉆透顱骨（立體定位坐標(biāo)：前囟后0.3 mm，矢狀縫右側(cè)1 mm，顱骨表面下2.2 mm）。將長7 mm、外徑0.7 mm、內(nèi)徑0.5 mm的不銹鋼外套管置入右側(cè)側(cè)腦室，用502膠和牙托粉固定外套管，并置入針芯防止堵塞。術(shù)后恢復(fù)3 d，分籠飼養(yǎng)，恢復(fù)期間每日腹腔注射2萬單位青霉素預(yù)防感染。術(shù)后第4天，實(shí)驗(yàn)組小鼠每天側(cè)腦室注射Apo D 80 μg/kg，對照組小鼠每天側(cè)腦室注射等量的生理鹽水，持續(xù)7 d。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 于細(xì)胞培養(yǎng)前1 d，用100 mg/L多聚賴氨酸處理細(xì)胞培養(yǎng)瓶。將MES23.5細(xì)胞從液氮中迅速轉(zhuǎn)移到37 ℃水浴鍋中，完全融化后，用培養(yǎng)液輕輕吹打懸浮，然后接種于預(yù)先鋪有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞以1×105/cm2密度接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞給予8 nmol/L Apo D處理24 h，對照組細(xì)胞給予等量PBS處理24 h。給藥劑量參考相關(guān)文獻(xiàn)［11］。

1.2.3 Western Blotting檢測BSG蛋白表達(dá) 側(cè)腦室注射Apo D 7 d后，處死小鼠，根據(jù)小鼠腦圖譜定位取出黑質(zhì)區(qū)腦組織，置于1.5 mL EP管中，加入100 μL裂解液，置于高速低溫組織研磨儀中研磨，研磨完置于冰上裂解30 min后提取蛋白，然后加入5×loading buffer，在水中煮沸10 min變性。從培養(yǎng)箱中取出MES23.5細(xì)胞，負(fù)壓吸除培養(yǎng)液，每孔加入100 μL裂解液，置于冰上裂解30 min后提取蛋白，然后加入5×loading buffer，在水中煮沸10 min變性。蛋白提取完畢后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，凝膠孔上樣量為每孔20 μg。采用90 V穩(wěn)定電壓進(jìn)行電泳，300 mA穩(wěn)定電流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間90 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后根據(jù)所需蛋白分子量對PVDF膜進(jìn)行裁剪，應(yīng)用10 g/L的脫脂奶粉封閉90 min，分別加入BSG抗體、β-Tublin抗體并置于4 ℃孵育過夜。應(yīng)用TBST溶液清洗3次，每次10 min，然后加入二抗室溫孵育60 min，再用TBST溶液清洗3次，每次10 min。用配制好的ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影并拍照，使用Image J軟件分析條

帶灰度值。BSG的表達(dá)水平以BSG/β-Tublin比值

表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 外源性Apo D對小鼠黑質(zhì)區(qū)BSG表達(dá)的影響

Western Blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組小鼠（0.606 9±0.095 2）相比，給予Apo D組小鼠（0.948 4±0.312 6）黑質(zhì)區(qū)BSG蛋白的表達(dá)水平明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，t=3.408，P<0.05）。見圖1。

2.2 外源性Apo D對MES23.5細(xì)胞BSG蛋白表達(dá)的影響

Western Blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞（0.836 9±0.059 4）相比，給予Apo D組細(xì)胞（1.051 0±0.071 5）BSG蛋白的表達(dá)水平明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，t=2.299，P<0.05）。見圖2。

3 討? 論

作為一種在體內(nèi)廣泛分布的蛋白質(zhì)，Apo D已被發(fā)現(xiàn)能與包括膽固醇、孕酮、卟啉、花生四烯酸在內(nèi)的多個(gè)疏水性分子結(jié)合，配體的多樣性表明Apo D具有廣泛的細(xì)胞功能。在阿爾茲海默病、卒中、帕金森病、精神分裂等多種疾病中均發(fā)現(xiàn)Apo D的表達(dá)增加［3-4，12］。在神經(jīng)系統(tǒng)中Apo D可能參與了膽固醇及其他類固醇的酯化作用［13］。越來越多的證據(jù)表明，Apo D具有神經(jīng)保護(hù)作用，過表達(dá)Apo D能夠防止紅藻氨酸誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)毒性［14］，在小鼠

大腦中過表達(dá)Apo D能夠提高小鼠存活率并降低氧化應(yīng)激導(dǎo)致的腦脂質(zhì)過氧化物增加［15］。多巴胺能神經(jīng)元作為黑質(zhì)中最主要的神經(jīng)元，在動物活動中起很大作用。前期研究已經(jīng)證明Apo D對多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用［16］，但其作用的具體機(jī)制仍不明確。有研究認(rèn)為，Apo D是通過內(nèi)化到神經(jīng)元中調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝來發(fā)揮保護(hù)作用的［14］。

Apo D作為神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要保護(hù)作用的物質(zhì)，其內(nèi)化的具體機(jī)制目前仍不明確。在所有脊椎動物中均檢測到BSG基因的表達(dá)，其編碼產(chǎn)物在體內(nèi)發(fā)揮著物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、分子識別等多種功能［17-18］。研究認(rèn)為，Apo D是通過BSG內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)的，而且BSG的天然配體親環(huán)素A能夠抑制Apo D的內(nèi)化［10］。離開神經(jīng)系統(tǒng)的Apo D聚集在腎臟、肝臟等器官中，而其在這些器官中的聚集也與BSG的表達(dá)密切相關(guān)［19-20］。本研究結(jié)果顯示，多巴胺能神經(jīng)母細(xì)胞瘤MES23.5細(xì)胞給予外源性Apo D處理后，其BSG蛋白表達(dá)明顯升高，在小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元中也得到了相同的結(jié)果，這表明在體內(nèi)和體外Apo D均能夠促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元BSG蛋白的表達(dá)。本研究為進(jìn)一步揭示Apo D的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制提供了新的思路。

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（本文編輯 馬偉平）