ApoE基因多態(tài)性與2型糖尿病患者頸動脈粥樣硬化斑塊的相關(guān)性分析

孟令萃 喬妙 喬利軍 楊爽 賴丹惠 葉思婷 周婷 張建興

2型糖尿病(type 2 diaberes,T2DM)是常見的一種慢性代謝性疾病,且全身動脈粥樣硬化發(fā)病率較高,隨著病程進展,常合并腦卒中等嚴重的血管疾病,從而使全身各靶器官受到相應(yīng)損傷[1]。而動脈粥樣硬化是各級血管病變的早期結(jié)構(gòu)及功能改變,是心腦血管疾病的獨立危險因素,而血脂代謝異常是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的重要原因,尤其與低密度脂蛋白(LDL-C)、三酰甘油(TC)增高關(guān)系最為密切,同時受性別、年齡及高血壓、吸煙等因素的影響[2]。載脂蛋白E(ApoE)基因具有多態(tài)性,是人體重要的載脂蛋白之一,是參與調(diào)節(jié)血脂代謝的重要因子,其基因多態(tài)性與血脂水平密切相關(guān),不同基因型轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)存在氨基酸的差異,使其對LDL受體的親和力不同,影響脂蛋白代謝和血脂水平,從而影響頸動脈粥樣硬化病變的發(fā)生、發(fā)展[3]。頸動脈是公認的動脈粥樣硬化的主要觀測部位,動脈粥樣硬化病變程度可通過檢測頸動脈內(nèi)-中膜厚度(IMT)值及斑塊情況進行評估[4]。探討ApoE基因多態(tài)性與頸動脈粥樣硬化的關(guān)系,從中發(fā)現(xiàn)不同基因型對T2DM患者頸動脈粥樣硬化的影響,找出危險因素和遺傳易感性標志,為臨床早期診斷和預(yù)防頸動脈粥樣硬化提供有價值的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019年9月至2021年2月我院內(nèi)科住院的461例患者;其中男263例,女198例;年齡30～79歲,平均年齡(60.78±7.27)歲;其中T2DM患者226例,男136例,女90例;年齡32～77歲,平均年齡(61.02±6.86)歲;非T2DM患者235例,男127例,女108例;年齡30～79歲,平均年齡(60.56±7.65)歲。本研究經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 標準

1.2.1 T2DM診斷標準:參照中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會2020年制定的《中國2型糖尿病防治指南(2020年版)》[5]:典型糖尿病癥狀伴隨機血糖≥11.1 mmol/L,或空腹血糖(FBG)≥7.0 mmol/L;或口服糖耐量試驗餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L,或糖化血紅蛋白(HbA1c)≥6.5%。

1.2.2 納入標準:①糖尿病組符合T2DM的診斷標準;②對照組符合糖尿病排除標準;③入院48 h內(nèi)接受頸動脈超聲檢查;④具有完整的臨床資料。

1.2.3 排除標準:①心、肺、肝及腎嚴重功能不全;②1型糖尿病;③繼發(fā)性糖尿病;④嚴重感染;⑤惡性腫瘤;⑥神經(jīng)、精神障礙;⑦嚴重風(fēng)濕;⑧臨床資料不完整。

1.3 方法

1.3.1 基線資料:收集461例患者的性別、年齡、身高與體重[計算體重指數(shù)(BMI)]、吸煙史、飲酒史、高血壓史、冠心病史、中風(fēng)史;實驗室檢測:TG、LDL-C、高度密脂蛋白(HDL-C)、TC、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)及ApoE基因多態(tài)性檢測。

1.3.2 ApoE基因測定:患者12 h清晨空腹采集肘靜脈血5 ml置于EDTA抗凝管,提取全血細胞基因組DNA根據(jù)血液基因組DNA提取試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司,貨號:NGB-51400)說明書進行。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)擴增ApoE特定基因片段,參照人類ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒(弗元(上海)生物科技有限公司,貨號:FYG-rs429358)進行ApoE基因多態(tài)性測定[6]。

1.3.3 血液生化指標檢測:患者空腹12 h后于清晨采集肘靜脈血,加入抗凝管并送到檢驗科檢測,測定TG、TC、HDL-C、LDL-C、FBG(采用7170A型全自動生化分析儀,試劑盒均購自中國上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)、HbA1c(采用糖化血紅蛋白檢測電泳儀,購自法國Sebia公司)。

1.3.4 頸動脈彩超檢查:患者的超聲檢查均由專業(yè)從事血管超聲檢查的醫(yī)師完成(工作時間>5年),檢查儀器為Philips Elite彩色多普勒超聲診斷儀(荷蘭),探頭頻率為7～10 MHz,患者采取仰臥位,將枕頭置于頸部,頭后仰,從頸動脈起始處,頸內(nèi)動脈、頸外動脈連續(xù)縱、橫切面檢查,觀察頸動脈至分叉處的內(nèi)-中膜及斑塊情況。頸動脈分組:根據(jù)參考文獻[7]分為2組:①無斑塊組:雙側(cè)頸動脈內(nèi)膜均無斑塊形成,且頸動脈IMT<1.5 mm;②斑塊組:一側(cè)或以上IMT≥1.5 mm或內(nèi)膜有斑塊形成,對于有斑塊形成者,依次測量雙側(cè)頸動脈每個獨立斑塊的厚度,將測得的所有獨立斑塊厚度相加后即為頸動脈斑塊Crouse積分[8]。

2 結(jié)果

2.1 2組患者一般資料比較 2組患者BMI值、高血壓病史、冠心病史、LDL-C、HDL-C、TG、HbA1c、FBG、頸動脈雙側(cè)內(nèi)-中膜(LIMT、RIMT)和斑塊Crouse積分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),2組患者間性別比、年齡、吸煙史、飲酒史比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組患者臨床基本資料比較

2.2 2組患者ApoE基因型及等位基因頻率比較 納入461例患者,共檢出6種基因型(ε2/2、ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4、ε4/4)及 3 種等位基因(ε2、ε3、ε4)。納入人群ApoE基因分布情況符合H-W遺傳平衡定律和連鎖平衡,可代表整個群體。本研究將基因型分為3個表型組,ε2/2和ε2/3合并為ε2組;基因型ε3/4和ε4/4合并為ε4組。由于ε2/4基因型由等位基因ε2和ε4共同組成,等位基因ε2 和ε4對動脈粥樣硬化的作用相反,不歸入上述各組,故比較基因型頻率時剔除基因型為ε2/4基因型的病例。T2DM組ε3/4 基因型頻率顯著高于非T2DM組,ε3/ε3基因型頻率顯著低于非T2DM組(P<0.05)。T2DM組ε4等位基因表型頻率顯著高于非T2DM組,ε3等位基因表型頻率顯著低于非T2DM組(P<0.05)。見表2、3。

表2 2組患者等位基因表型頻率比較 例(%)

表3 2組患者基因型頻率比較 例(%)

2.3 不同基因型T2DM合并頸動脈斑塊患者血脂水平及頸動脈IMT值、斑塊情況比較 3組等位基因表型間TC、TG、LDL-C水平差異具有顯著性,其中ε4組>ε3組>ε2組(P<0.01);HDL-C水平差異無顯著性(P>0.05),但ε2組>ε3組>ε4組;3組等位基因表型間雙側(cè)IMT值及斑塊Crouse積分差異有顯著性,ε4組>ε3組>ε2組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組等位基因血脂及頸動脈IMT、斑塊情況比較

2.4 T2DM合并頸動脈斑塊患者總Crouse積分與危險因素的相關(guān)性分析 以T2DM合并頸動脈斑塊患者斑塊Crouse積分為因變量,以各種危險因素為自變量,進行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)年齡、BMI值、高血壓史、冠心病史、中風(fēng)史、LDL-C、HDL-C、HbA1c、ε4等位基因表型與頸動脈斑塊Crouse積分具有明顯相關(guān)性(P<0.05),而吸煙、飲酒、膽固醇、TG、ε3等位基因表型沒有明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表5。

表5 T2DM患者合并頸動脈斑塊總Crouse積分的相關(guān)性分析

2.5 ε4等位基因表型預(yù)測T2DM合并頸動脈斑塊風(fēng)險的ROC曲線 ε4等位基因表型預(yù)測T2DM合并頸動脈斑塊形成風(fēng)險的ROC曲線下面積(AUC)為0.691,敏感度為41.7%,特異度為94.7%,表明ε4等位基因?qū)2DM合并頸動脈斑塊發(fā)生風(fēng)險有一定的預(yù)測價值。見圖1。

圖1 ε4等位基因預(yù)測T2DM合并頸動脈斑塊風(fēng)險的ROC曲線

3 討論

隨著近年人們生活水平日益提高及生活方式的改變,糖尿病的發(fā)生率日趨上升,已成為全球關(guān)注的健康問題。T2DM患者多為中老年群體,隨年齡增加患病率逐漸增高,常伴有脂質(zhì)代謝紊亂[9]。有研究表明,脂質(zhì)代謝異常往往與糖代謝紊亂相比更較前發(fā)生,其突出特點為TG水平升高,同時循環(huán)游離脂肪酸(FFA)水平伴隨增高,從而進一步加速TG水平的進一步升高,降低與胰島素抵抗相關(guān)的血漿HDL-C水平,高TG或低HDL-C水平通過炎癥介導(dǎo)或低HDL-C水平影響胰島β細胞的功能,進而影響胰島素的正常分泌,從而加快T2DM的進展[10,11]。本研究結(jié)果表明,與非T2DM患者相比,T2DM患者脂質(zhì)代謝紊亂更為突出,表現(xiàn)為血脂LDL-C、TG水平明顯增高,而HDL-C水平明顯減低。在T2DM患者中,脂質(zhì)代謝紊亂的患病率為72%～85%[12],脂蛋白脂酶(LPL)、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)、磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(PTP)、內(nèi)皮脂酶(EL)和肝脂酶(HL)的活性受胰島素抵抗影響影響,同時還會抑制ApoE的生成率和乳糜微粒的分泌[13]。盡管ApoE基因的研究還有限,但都有力地的證實了ApoE基因與糖尿病脂代謝紊亂密切相關(guān)[14]。

載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因位于人體第19號染色體上,常見的3種等位基因ε2、ε3和ε4分別表達3種ApoE異構(gòu)體ApoE2、ApoE3和ApoE4。ApoE基因多態(tài)性存在6種不同基因型,包括ε2/2、ε3/e3、ε4/4(3種純合體)和ε2/3、ε3/4、ε2/4(3種雜合體)。ApoE基因是人體日常所需的重要的功能蛋白,通過多態(tài)性的蛋白形式參與脂蛋白的轉(zhuǎn)化與代謝過程,與脂代謝紊亂和動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15]。既往研究表明3種蛋白基因亞型因結(jié)構(gòu)不同而對脂質(zhì)代謝的影響有所不同,其中ε4等位基因攜帶者伴有TC、TG、LDL-C水平的增高,其升高的趨勢為ε4>ε3>ε2[16]。本研究中,T2DM組攜帶ε4等位基因(ε3/4+ε4/4)其TC、TG和LDL-C水平較非T2DM組均升高,提示ε4等位基因與糖尿病患者的代謝密切相關(guān),這可能與糖尿病患者本身脂質(zhì)代謝紊亂,ApoE等位基因受體活性結(jié)合能力減低,從而導(dǎo)致富含TG的脂蛋白分解緩慢,進而肝臟攝取、處理乳糜微粒(CM)、VLDL-C殘粒發(fā)生障礙,使血中的TG升高,表現(xiàn)為高TG、TC和LDL-C水平[17]。

既往研究證實,糖尿病機體血糖升高誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng),導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管收縮及舒張功能障礙,同時誘發(fā)粒細胞及單核細胞對內(nèi)皮細胞的炎性損傷和粘附,從而啟動并促進早期動脈粥樣硬化的發(fā)生[18]。同時由于糖尿病患者常伴有代謝異常的危險因素,如年齡、性別、不良生活方式和心血管病家族史等相關(guān)因素,常常伴有脂質(zhì)代謝紊亂,隨著LDL-C升高,促進大量脂質(zhì)顆粒在細胞內(nèi)及血管壁上沉積,引起動脈粥樣硬化的早期病理改變,通過LDL-C氧化修飾,大量巨噬細胞吞噬的脂質(zhì)顆粒卻難以分解,在巨噬細胞內(nèi)沉積后形成泡沫細胞,泡沫細胞積聚之后形成脂質(zhì)核心并逐漸形成粥樣硬化斑塊[19]。本研究也證實,T2DM組患者頸動脈內(nèi)-中膜厚度及頸動脈斑塊Crouse積分明顯增高,同時BMI值增高,合并高血壓及冠心病等代謝紊亂高危因素明顯增多。糖尿病患者動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展存在多樣性,ApoE基因多態(tài)性與脂質(zhì)代謝紊亂和動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15]。薈萃分析顯示ApoE基因多態(tài)性與頸動脈IMT之間顯著相關(guān),但由于納入的受試者為東亞人群,無白人符合納入標準[20]。因此,關(guān)于T2DM患者動脈粥樣硬化的臨床類型需要進一步的遺傳學(xué)研究,探索其是否ApoE基因受多態(tài)性的影響[21]。

研究證明,ApoE基因ε4等位基因通過升高血漿TG、TC、LDL-C的水平從而影響機體血脂水平,并促進動脈粥樣硬化改變過程[22],本研究中T2DM合并頸動脈斑塊患者中ε4等位基因組攜帶者血清TG、TC、LDL-C較非ε4組高。提示ApoE基因多態(tài)性是人群中TG、TC和LDL-C水平存在個體差異的遺傳性決定因素,而ε4等位基因可能就是動脈粥樣硬化的遺傳性易感因子。

本研究中T2DM合并頸動脈斑塊患者與ε4等位基因及年齡、BMI值、高血壓史、冠心病史、中風(fēng)史、LDL-C、HDL-C具有明顯相關(guān)性,同時通過ROC曲線證明ε4等位基因?qū)2DM患者合并頸動脈斑塊的具有較高診斷價值,且ε4等位基因存在時血脂、頸動脈IMT、頸動脈斑塊Crouse積分明顯增高,因此在2型糖尿病人群中,ε4等位基因與動脈粥樣硬化斑塊有關(guān),提示ε4等位基因可能通過影響T2DM患者的血脂代謝,從而在一定程度上影響動脈粥樣硬化病變的進程。

綜上所述,T2DM患者人群脂代謝紊亂較明顯,而ApoE基因多態(tài)性與頸動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展具有明顯相關(guān)性,ε4等位基因?qū)2DM合并頸動脈斑塊具有較高預(yù)測價值。因此,對T2DM人群進行血脂水平動態(tài)觀察和ApoE基因多態(tài)性檢測,深入研究ApoE的基因表達和調(diào)控,有利于對動脈粥樣硬化的早期預(yù)測,對其危險因素盡早進行干預(yù),從而預(yù)防進一步心腦血管疾病的進展。