miR-671-5p調(diào)控TIPE2對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響

黨治國 王海峰 司少魁

肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae,SP)作為一種革蘭氏陽性細(xì)菌,是肺炎最常見的病原菌,可導(dǎo)致高死亡率[1]。當(dāng)感染肺炎后,肺部會(huì)出現(xiàn)較嚴(yán)重的炎性反應(yīng),作為呼吸道中對(duì)抗病原體的天然防線——肺泡上皮細(xì)胞會(huì)大量凋亡,造成肺損傷[2]。因此,探究SP誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制具有重要意義。研究表明,miRNA在肺泡上皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3]。miR-671-5p作為一種miRNA,已有研究報(bào)道,過表達(dá)miR-671-5p可加重慢性腎病中的足細(xì)胞損傷[4]。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8-2(tumor necrosis factor-α induced protein-8-like 2,TIPE2),又稱TNFAIP8L2,其為炎性反應(yīng)和免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,其可通過抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)來抑制銅綠假單胞菌角膜炎[5]。本研究首先通過生物信息學(xué)分析miR-671-5p與TIPE2的關(guān)系及miR-671-5p對(duì)SP誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響和作用機(jī)制。

EMS系統(tǒng)是進(jìn)行電力調(diào)度的能量管理系統(tǒng)。它主要運(yùn)用在電網(wǎng)模型的簡(jiǎn)化和等值上，由于只是對(duì)系統(tǒng)模型的分析，其電力調(diào)度和電網(wǎng)監(jiān)控強(qiáng)度值得商榷。實(shí)踐是檢驗(yàn)真理的唯一標(biāo)準(zhǔn)，EMS系統(tǒng)缺乏足夠的實(shí)踐監(jiān)測(cè)經(jīng)驗(yàn)，其數(shù)據(jù)的說服力不強(qiáng)。此外，EMS系統(tǒng)適用于相鄰電網(wǎng)的模型分析，對(duì)具有實(shí)際意義的互聯(lián)網(wǎng)電力系統(tǒng)中的電力調(diào)度工程分析，精確度和可靠度大為降低。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 人肺泡上皮細(xì)胞HPAEpiC購自上?；鄯f生物公司。

1.2 主要試劑 miR-671-5p抑制物(miR-671-5p inhibitor)及其陰性對(duì)照(inhibitor NC)、TIPE2小干擾RNA(si-TIPE2)及其陰性對(duì)照(si-NC)均購自廈門慧嘉生物公司;SP(貨號(hào):ATCC 49619)購自上海碩欣生物科技有限公司;CCK-8試劑盒(貨號(hào):CK04)購自深圳市紐邦生物公司;Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒(貨號(hào):KGA105)購自江蘇凱基生物公司;白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒(貨號(hào):EH004)購自上海吉泰依科賽生物公司;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒(貨號(hào):EK-H12145)購自博輝生物科技(廣州)有限公司;白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒(貨號(hào):JH-H10327)購自上海繼和生物公司;兔源一抗TIPE2(貨號(hào):ab169616)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax;貨號(hào):ab182733)、半胱氨酸蛋白酶3(Cysteine proteinase3,caspase-3;貨號(hào):ab32351)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2;貨號(hào):ab32124)、GAPDH(貨號(hào):ab9485)及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(貨號(hào):ab205718)均購自Abcam公司。

1.3 SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞模型的構(gòu)建及分組 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)HPAEpiC細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HPAEpiC細(xì)胞,分為Ctrl組、SP組、inhibitor NC組、miR-671-5p inhibitor組、miR-671-5p inhibitor+ si-NC組、miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組。inhibitor NC組、miR-671-5p inhibitor組、miR-671-5p inhibitor+ si-NC組、miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組分別利用LipofectamineTM2000試劑將inhibitor NC、miR-671-5p inhibitor、miR-671-5p inhibitor和si-NC、miR-671-5p inhibitor和si-TIPE2轉(zhuǎn)染于HPAEpiC細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后,6組分別再加入菌液1×108CFU/ml的SP處理24 h[6]。Ctrl組為未經(jīng)任何處理的HPAEpiC細(xì)胞,SP組為未轉(zhuǎn)染只用SP處理24 h的HPAEpiC細(xì)胞。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 分別構(gòu)建TIPE2野生型質(zhì)粒(WT-TIPE2)及突變型質(zhì)粒(MUT-TIPE2),將WT-TIPE2和MUT-TIPE2分別與mimic NC或miR-671-5p mimic共轉(zhuǎn)染于HPAEpiC細(xì)胞,48 h后,檢測(cè)熒光素酶活性。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種到96孔板中,培養(yǎng)48 h時(shí)加入10 μl CCK-8試劑,室溫孵育2 h后測(cè)量450 nm處吸光度。

When he was 4 years old，his father sent（送）him to school.The boys at school had lessons in Latin（拉丁語）and Greek（希臘語）.They had to work hard.If boys were naughty（調(diào)皮的），the teacher beat（打）them.Shakespeare and his friends played in the fields（田 野）.They went fishing and swimming in the river.

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用胰蛋白酶消化6組細(xì)胞后,將細(xì)胞用冷PBS洗滌2次,然后重懸于1×結(jié)合緩沖液中,在室溫下依次與5 μl FITC Annexin V和5 μl碘化丙啶避光孵育20 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

在肉牛養(yǎng)殖中，由于各種不良應(yīng)激因素，如突然改變?nèi)占Z、氣候突變、飼料營養(yǎng)價(jià)值較差、飼料發(fā)霉變質(zhì)、圈舍衛(wèi)生環(huán)境不佳等因素存在，均會(huì)導(dǎo)致肉牛胃腸道疾病發(fā)生，防控不及時(shí)，某些傳染性胃腸道疾病還會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖場(chǎng)牛死亡率提升，損害養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)效益。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 用RIPA裂解緩沖液提取各組細(xì)胞的總蛋白,將等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入一抗TIPE2(1∶2 000)、Bax(1∶2 000)、caspase-3(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)在4℃下孵育過夜,再加入HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h,通過ECL試劑檢測(cè)蛋白顯色情況,Image J軟件用于分析蛋白條帶灰度值。

1.7 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平 嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)miR-671-5p表達(dá) Trizol試劑用于提取細(xì)胞中的總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)miR-671-5p的相對(duì)表達(dá)水平。miR-671-5p的相對(duì)表達(dá)水平是以U6為內(nèi)參,通過2-ΔΔCt方法計(jì)算的。引物序列:miR-671-5p:正向引物5’-AGGAAGCCCTGGAGGG-3’,反向引物5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’;U6:正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCATACT-3’,反向引物5’-ACGCTCTCACAATTTGCGTGTC-3’。

2.4 6組HPAEpiC細(xì)胞上清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平比較 與Ctrl組比較,SP組細(xì)胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05);與SP組、inhibitor NC組比較,miR-671-5p inhibitor組細(xì)胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05);與miR-671-5p inhibitor組、miR-671-5p inhibitor+ si-NC組比較,miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組細(xì)胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)。見表4。

2 結(jié)果

2.1 6組HPAEpiC細(xì)胞中miR-671-5p、TIPE2蛋白表達(dá)比較 與Ctrl組比較,SP組細(xì)胞中miR-671-5p表達(dá)升高,TIPE2蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與SP組、inhibitor NC組比較,miR-671-5p inhibitor組細(xì)胞中miR-671-5p表達(dá)降低,TIPE2蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與miR-671-5p inhibitor組、miR-671-5p inhibitor+ si-NC組比較,miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組細(xì)胞中miR-671-5p表達(dá)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),TIPE2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖1,表1。

The Status Quo of China Provincial Tourism Image Positioning & Type Division_____________________________LU Xiaobo,CHEN Xiaoying,WANG Wanshan et al 1

圖1 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中TIPE2蛋白表達(dá);A Ctrl組;B SP組;C inhibitor NC組;D miR-671-5p inhibitor組;E miR-671-5p inhibitor+ si-NC組;F miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組

表1 6組HPAEpiC細(xì)胞中miR-671-5p、TIPE2蛋白表達(dá)比較

2.2 6組HPAEpiC細(xì)胞增殖能力比較 與Ctrl組比較,SP組細(xì)胞OD450值降低(P<0.05);與SP組、inhibitor NC組比較,miR-671-5p inhibitor組細(xì)胞OD450值升高(P<0.05);與miR-671-5p inhibitor組、miR-671-5p inhibitor+ si-NC組比較,miR-671-5pinhi bitor+ si-TIPE2組細(xì)胞OD450值降低(P<0.05)。見表2。

樹立正確的水生態(tài)觀。貫徹黨的十八大和十八屆三中全會(huì)精神，堅(jiān)持“系統(tǒng)治理”，統(tǒng)籌山水林田湖各要素，協(xié)調(diào)解決水資源、水環(huán)境、水生態(tài)、水災(zāi)害問題，牢固樹立生態(tài)文明理念，大力推進(jìn)水生態(tài)文明建設(shè)，構(gòu)建水生態(tài)文明與經(jīng)濟(jì)社會(huì)成果交相輝映的新型人水關(guān)系。實(shí)施贛撫連通工程，構(gòu)建贛江、撫河下游江河湖庫水系連通體系，提升水資源調(diào)蓄能力、水環(huán)境自凈能力和水生態(tài)修復(fù)能力。抓好南昌、新余等全國水生態(tài)文明城市建設(shè)試點(diǎn)，在蓮花、會(huì)昌等縣開展省級(jí)試點(diǎn)，并配合全省“百強(qiáng)鎮(zhèn)”建設(shè)開展水生態(tài)文明示范鎮(zhèn)、示范村建設(shè)。探索建立水生態(tài)補(bǔ)償制度，引導(dǎo)社會(huì)資本投入水生態(tài)文明建設(shè)。通過以點(diǎn)帶面，推進(jìn)全省水生態(tài)文明建設(shè)。

表2 6組細(xì)胞OD450值比較

2.5 6組HPAEpiC細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與Ctrl組比較,SP組細(xì)胞中Bax、caspase-3蛋白表達(dá)升高,Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與SP組、inhibitor NC組比較,miR-671-5p inhibitor組中Bax、caspase-3蛋白表達(dá)降低,Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與miR-671-5p inhibitor組、miR-671-5p inhibitor+ si-NC組比較,miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組中Bax、caspase-3蛋白表達(dá)升高,Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖3,表5。

表3 6組細(xì)胞凋亡率比較

Ctrl組 SP組 inhibitorNC組

表4 6組HPAEpiC細(xì)胞上清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平比較

2.3 6組HPAEpiC細(xì)胞凋亡率比較 與Ctrl組比較,SP組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與SP組、inhibitor NC組比較,miR-671-5p inhibitor組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與miR-671-5p inhibitor組、miR-671-5p inhibitor+ si-NC組比較,miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖2,表3。

圖3 western blot檢測(cè)細(xì)胞中Bax、caspase-3、Bcl-2蛋白;A Ctrl組;B SP組;C inhibitor NC組;D miR-671-5p inhibitor組;E miR-671-5p inhibitor+ si-NC組;F miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組

表5 6組細(xì)胞中Bax、caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

2.6 miR-671-5p靶向調(diào)控TIPE2 Targetscan預(yù)測(cè)miR-671-5p與TIPE2存在結(jié)合位點(diǎn),與mimic NC和WT-TIPE2共轉(zhuǎn)染組比較,miR-671-5p mimic和WT-TIPE2共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05);與mimic NC和MUT-TIPE2共轉(zhuǎn)染組比較,miR-671-5p mimics和MUT-TIPE2共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4,表6。

場(chǎng)地土層屬于同一地貌單元，場(chǎng)地中地基巖土層分布穩(wěn)定，總體上看層底面坡度<10%，除河溝地段地層有缺失外，各地基土分布相對(duì)連續(xù)，土體垂向壓縮性相差較小，結(jié)合基礎(chǔ)開挖深度及建筑物持力層情況，綜合判斷地基為均勻地基。

圖4 Targetscan預(yù)測(cè)miR-671-5p與TIPE2的結(jié)合位點(diǎn)

表6 熒光素酶活性比較

3 討論

肺炎是一種全球常見的感染性疾病,也是感染患者的主要死亡原因[7]。SP是一種革蘭氏陽性需氧雙球菌,最初定植于鼻咽,然后侵入下呼吸道,引起肺炎[8]。而肺炎可以引起肺上皮細(xì)胞凋亡以及炎性反應(yīng)[9]。IL-6、TNF-α、IL-1β作為常見的炎性細(xì)胞因子,已有研究發(fā)現(xiàn),IL-6、TNF-α、IL-1β在肺炎患者的血漿中高表達(dá)[10]。Bax、caspase-3、Bcl-2是評(píng)估細(xì)胞凋亡的常用指標(biāo),Bax、caspase-3具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,而Bcl-2在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮抑制作用[11]。本研究利用SP誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞HPAEpiC以構(gòu)建體外肺炎細(xì)胞模型,結(jié)果顯示,與Ctrl組比較,SP組細(xì)胞凋亡率、IL-6、TNF-α、IL-1β水平、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)升高,而OD450值、Bcl-2蛋白表達(dá)降低,提示SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞大量凋亡,細(xì)胞增殖能力減弱,且存在炎性反應(yīng)。

miRNA是一種非編碼RNA,在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯中起轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。它可以調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá),在生物發(fā)育、繁殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA可以調(diào)節(jié)多種生命活動(dòng),并且多種miRNA已被證明參與調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和炎癥性疾病[13]。已有研究顯示,過表達(dá)miR-671-5p可減輕缺血再灌注引起的神經(jīng)炎癥[14]和IL-1β介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡、炎癥損傷[15];芍藥苷通過上調(diào)miR-671-5p抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞炎性反應(yīng)[16]。本研究結(jié)果顯示,miR-671-5p在SP誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞HPAEpiC中高表達(dá),下調(diào)miR-671-5p可抑制SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果與先前研究的不一致可能是由于miR-671-5p存在組織特異性表達(dá)造成的。

TIPE2基因位于1號(hào)染色體(1q21.2～1q21.3)上,其是一種炎癥負(fù)調(diào)節(jié)劑,可維持免疫穩(wěn)態(tài)[17]。有研究報(bào)道,TIPE2在骨質(zhì)疏松癥患者中低表達(dá),并且與促炎細(xì)胞因子呈負(fù)相關(guān)[18];肺炎支原體肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2水平明顯降低,TIPE2可能是影響肺炎支原體肺炎發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[19];參芪固本顆粒配合GINA階梯方案治療肺脾腎虛型支氣管哮喘療效顯著,其機(jī)制與上調(diào)外周血單個(gè)核細(xì)胞中TIPE2表達(dá),抑制炎性反應(yīng)有關(guān)[20];TIPE2過表達(dá)顯著減輕了急性肺損傷小鼠肺部炎癥,并抑制肺細(xì)胞凋亡[21]。表明TIPE2具有抑制炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的作用。本研究結(jié)果與上述研究一致的,本研究結(jié)果顯示,TIPE2蛋白在SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞中低表達(dá),而下調(diào)miR-671-5p可促進(jìn)SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞中TIPE2蛋白表達(dá),推測(cè)下調(diào)miR-671-5p可能通過促進(jìn)TIPE2表達(dá)抑制SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)。為了驗(yàn)證該推測(cè),本研究在轉(zhuǎn)染miR-671-5p inhibitor的基礎(chǔ)上再加上TIPE2小干擾RNA進(jìn)行干預(yù)SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞,結(jié)果顯示,沉默TIPE2減弱了下調(diào)miR-671-5p對(duì)SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)的抑制作用。

綜上所述,下調(diào)miR-671-5p通過促進(jìn)TIPE2表達(dá)抑制SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng),揭示了miR-671-5p在SP誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)中的促進(jìn)作用,表明miR-671-5p可能成為治療SP誘導(dǎo)的肺炎的有希望的治療靶點(diǎn)。