足三里穴位注射對(duì)胃潰瘍大鼠Gsh-Px、EGF、Gas及Nrf2、GSTm1基因的影響*

張攀攀 林靜瑜 周凡 許金森 程佑民

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 3501082; 2.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建 福州 350003)

足三里是胃經(jīng)合穴，胃之下合穴，臨床上多用于治療胃黏膜損傷性疾病。前期發(fā)現(xiàn)：足三里經(jīng)預(yù)電針處理聯(lián)合穴位注射生理鹽水(NS)對(duì)吲哚美辛實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠胃黏膜具有保護(hù)作用，其機(jī)理與抗氧化有關(guān)[1]。非甾體抗炎藥(NSAIDs)相關(guān)性胃病的發(fā)病涉及多個(gè)環(huán)節(jié)[2]，而針灸效應(yīng)具有多途徑、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)[3-4]，本文擬進(jìn)一步探討足三里對(duì)吲哚美辛實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠胃泌素(Gas)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的分泌、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力及Nrf2、GSTm1基因表達(dá)的影響，以期證實(shí)針刺效應(yīng)機(jī)制的多途徑、多靶點(diǎn)特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量：200～220 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(浙江)2019-0002。

1.2主要試劑 吲哚美辛對(duì)照品(S18048-5g，純度99%，源葉生物科技有限公司)；生理鹽水(171009A44，福州海王福藥制藥有限公司)；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒(GSH-Px，A005-1-2，南京建成生物工程研究所)；大鼠胃泌素ELISA試劑盒(Gas，ml003029，mlbio)、大鼠表皮生長(zhǎng)因子ELISA試劑盒(EGF，ml068740，mlbio)；異丙醇(20161203，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氯仿(20161102，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；RNAiso Plus(9108，TaKaRa)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A，TaKaRa)；SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(RR420A，TaKaRa)；Nrf2引物(序列F:GCTGCCATTAGTCAGTCGCTCTC，R：ACCGTGCCTTCAGTGTGCTTC；大小104bp)、GSTm1引物(序列F:TTCGTGCAGACAATTGTGGAGA,R:CTTGCCCAGGAACTCAGAGTAGA;大小149bp)，均由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)；HE染色試劑盒(G1120，Solarbio)。

1.3主要儀器 全功能酶標(biāo)儀(Varioskan Flash，Therom)；石蠟切片機(jī)(RM2235，Lecia)；組織包埋機(jī)(YB-7LF，孝感亞光)；組織脫水機(jī)(ZT-14V2，孝感亞光)；脫色搖床(TS-92，其林貝爾)；恒溫箱(DYY-6C，北京六一)；顯微鏡(DM18/DFC550，Lecia)；數(shù)顯恒溫電子水浴鍋(HH-6，常州國(guó)華)；離心機(jī)(ST16R，Therom)；核酸檢測(cè)儀(Nanodrop 2000，Thermo)；96孔熱循環(huán)儀(Veriti，ABI)，Applied Biosystems Real-Time PCR System(ABI 7500 Fast，ABI)。

1.4實(shí)驗(yàn)方案

1.4.1分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后按隨機(jī)數(shù)字法分為：正常組、模型組、足三里組，每組8只。

1.4.2預(yù)處理 分組結(jié)束后，對(duì)足三里組大鼠進(jìn)行電針預(yù)處理。足三里定位、電針?lè)椒▍⒄瘴墨I(xiàn)[5-6]：取雙側(cè)足三里穴電針(參數(shù)：疏密波、刺激頻率為2 Hz/10 Hz)，20 min，1次/d，連續(xù)6 d；模型組大鼠于每日同時(shí)同等固定于鼠套20 min，1次/d，連續(xù)6 d，正常組不做任何處理。

1.4.3模型制備及干預(yù) 預(yù)處理結(jié)束，各組大鼠禁食不禁水18 h，于第7 d，模型組、足三里組大鼠腹腔注射吲哚美辛混懸液制備胃潰瘍模型[7]，吲哚美辛注射60 min后，足三里組于雙側(cè)足三里穴注射N(xiāo)S 0.5 mL·kg-1，模型組同等抓取固定。

1.5取材 參照文獻(xiàn)，于吲哚美辛注射后7 h取材[8-9]。各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1、腹主動(dòng)脈采血，離心取血清，-80 ℃存；取胃，沿胃大彎剪開(kāi)，冰生理鹽水輕洗胃腔，冰上觀察胃黏膜大體形態(tài)，按Guth[10]法計(jì)算胃黏膜損傷分?jǐn)?shù)；剪取兩黃豆大組織塊，液氮凍存；剪取典型部位胃組織塊1.0×1.0 cm2，置于4%多聚甲醛固定；剩余胃組織-80 ℃凍存。

1.6指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1胃組織病理形態(tài)學(xué) 取固定24 h的胃組織、脫水、石蠟包埋、切片，脫蠟、蘇木素染色、伊紅染色，光鏡下觀察胃組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.6.2GSH-Px、EGF、GAS檢測(cè) 根據(jù)按預(yù)試稀釋比例，取胃組織加入適當(dāng)比例冰生理鹽水勻漿，3000 r·min-1離心，取上清，按南京建成試劑說(shuō)明書(shū)檢測(cè)胃組織GSH-Px活力；采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)、計(jì)算胃組織及血清EGF、GAS的含量。

1.6.3胃組織Nrf2、GSTm1 mRNA檢測(cè) 取液氮凍存的胃組織塊，放入液氮預(yù)冷的研缽中剪碎，研磨，加入1 mL RNAiso Plus抽提總RNA，按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒20 μL體系將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒兩步法將cDNA 模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本基因及內(nèi)參基因均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，根據(jù)2-△△CT法對(duì)mRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠胃黏膜大體外觀與胃潰瘍指數(shù)比較 模型組大鼠胃黏膜損傷嚴(yán)重，黏膜表面彌散著點(diǎn)線狀出血點(diǎn)，呈黑褐色，胃黏膜表面有黃白色黏液，去之可現(xiàn)凹點(diǎn)，胃黏膜變薄，皺襞減少，損傷分?jǐn)?shù)高；足三里組大鼠胃黏膜的出血點(diǎn)、潰瘍點(diǎn)較模型組明顯減少，胃黏膜厚度、皺襞較接近正常，胃黏膜損傷分?jǐn)?shù)較模型組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠胃黏膜病理形態(tài) 正常組大鼠的胃黏膜層完整，上皮細(xì)胞以及腺體排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，胃小凹清晰，未見(jiàn)明顯充血、水腫以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠黏膜上皮細(xì)胞脫落、變性、缺損、見(jiàn)有明顯的紅細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷可達(dá)胃黏膜中、下層；足三里組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞脫落、變性、出血情況較模型組明顯減輕，腺體排列較為整齊，損傷大部分局限在胃黏膜上層。見(jiàn)圖1。

2.3各組大鼠GSH-Px活力、GAS、EGF含量比較 胃組織：與正常組比，模型組大鼠GSH-Px活力、EGF含量明顯下降(P均<0.01)、Gas含量升高(P<0.05)；與模型組比，足三里組GSH-Px活力、EGF含量升高(P<0.05、P<0.01)，GAS含量明顯下降(P<0.01)。與正常組比，足三里組EGF顯著升高(P<0.01)，表明胃黏膜處于損傷修復(fù)活躍期。見(jiàn)表2，圖2，圖3。

血清：與正常組比，模型組EGF含量明顯降低(P<0.01)、Gas含量明顯升高(P<0.01)。與模型組比，足三里組EGF含量明顯升高(P<0.01)、Gas水平顯著下降(P<0.01)。見(jiàn)表3、圖4。

2.4各組大鼠胃組織Nrf2、GSTm1基因表達(dá)情況Nrf2 mRNA：與正常組比，模型組Nrf2 mRNA表達(dá)量呈下降的趨勢(shì)(P<0.2)、GSTm1 mRNA表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。與模型組比，足三里組Nrf2mRNA表達(dá)量呈上升的趨勢(shì)(P=0.1)GSTm1mRNA表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)表4，圖5，Nrf2和GSTm1的溶解與擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖6、圖7。

3 討論

針灸治未病涵蓋了“未病先防”“既病防變”“瘥后防復(fù)”三方面，研究者認(rèn)為針灸干預(yù)“以防為先”“以調(diào)為期”“介入時(shí)機(jī)宜早”等[11]。近年來(lái)，“針灸預(yù)處理”(古時(shí)稱(chēng)為“逆針灸”)的作用規(guī)律及機(jī)理研究逐漸興起，研究表明，相較于病后針刺，“預(yù)針刺處理”不僅療效較好，且可提前防治，減少醫(yī)療成本[12-14]。

非甾體抗炎藥具有強(qiáng)大的解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛作用，是臨床上最常用的藥物之一[15]。長(zhǎng)期、大劑量地應(yīng)用非甾體抗炎藥，胃黏膜損害風(fēng)險(xiǎn)極高[16]。因此，對(duì)于NASIDs相關(guān)性胃病常采取防治結(jié)合的策略。針灸療法治療胃黏膜損傷性疾病療效確切，可在不引入外源性藥物的基礎(chǔ)上，充分調(diào)動(dòng)機(jī)體的內(nèi)源性應(yīng)激保護(hù)系統(tǒng)發(fā)揮防病治病作用。本研究采用“預(yù)電針處理”聯(lián)合“穴位注射N(xiāo)S”的聯(lián)合干預(yù)方案，旨在做到“未病先防”“既病防變”作用，提高足三里干預(yù)實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的療效。此外，預(yù)針刺處理也可避免大鼠經(jīng)抓取、針刺等外界應(yīng)激不適而產(chǎn)生的應(yīng)激性胃損傷，影響療效判定[17-18]。

胃黏膜長(zhǎng)期暴露于各種損害因素下，自身通過(guò)一整套地防御機(jī)制抵御損傷并維持黏膜結(jié)構(gòu)的完整性。GSH-Px是一種含硒抗氧化酶，GSH-Px水平的降低可加重氧自由基(ROS)和脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)胃黏膜的損傷[19-20]。Gas由G細(xì)胞分泌，是促進(jìn)胃酸分泌的主要激素，同時(shí)也是一種營(yíng)養(yǎng)激素。適量的Gas可維持胃黏膜的完整性，過(guò)量的Gas則導(dǎo)致胃酸分泌過(guò)多，損傷胃黏膜。EGF是已被證實(shí)的胃黏膜保護(hù)因子之一，可促使?jié)冎苓呎Ｉ掀ぜ?xì)胞移行覆蓋至潰瘍面以及進(jìn)一步分裂、增殖、分化，維持胃黏膜上皮細(xì)胞的更新、促進(jìn)損傷胃黏膜上皮的再生和腺體重建[21]。本研究結(jié)果顯示：足三里經(jīng)“電針預(yù)處理”聯(lián)合“穴位注射N(xiāo)S”能夠增強(qiáng)吲哚美辛胃潰瘍大鼠GSH-Px活力，降低過(guò)高的GAS含量，并大幅提升EGF含量，表明針刺效應(yīng)在抗氧化、抑酸、促進(jìn)潰瘍修復(fù)均起了積極的作用。

轉(zhuǎn)錄因子 NF-E2 相關(guān)因子(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是體內(nèi)抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵信號(hào)分子，控制著谷胱甘肽(GSH)和硫氧還蛋白(TXN)抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵成分以及Ⅰ相、Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，并調(diào)節(jié)著多種ROS解毒酶的轉(zhuǎn)錄，在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[22]。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是Nrf2通路中下游的抗氧化和Ⅱ相解毒酶，其中，GSTm1可減少谷胱甘肽與內(nèi)外源性疏水性親電試劑的結(jié)合，參與前列腺素A2(PGA2)、前列腺素J2(PGJ2)與谷胱甘肽的結(jié)合等[23-25]。前文我們觀察到，足三里保護(hù)吲哚美辛實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的作用與提高血清SOD、GSH-Px活力、降低MDA水平及胃組織Nrf2的陽(yáng)性表達(dá)有關(guān)[1]。在本文中，我們觀察到足三里促進(jìn)了吲哚美辛實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍胃組織Nrf2、GSTm1 基因的表達(dá)，進(jìn)一步證明了足三里的胃黏膜保護(hù)作用與抗氧化有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明足三里保護(hù)吲哚美辛實(shí)驗(yàn)性大鼠胃潰瘍的作用與抗氧化、促進(jìn)黏膜修復(fù)、減少胃酸分泌有關(guān)，其抗氧化作用可能與上調(diào)Nrf2、GSTm1基因的表達(dá)有關(guān)。針灸可能在“胃黏膜損傷與保護(hù)”的多個(gè)途徑及靶點(diǎn)發(fā)揮整合作用，防治胃黏膜損傷。