外泌體在股骨頭壞死診治中的應(yīng)用

董一平，袁強(qiáng)，張寧，張穎

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，河南 鄭州 450046；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院，河南 洛陽(yáng) 471002)

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是股骨頭靜脈瘀滯、動(dòng)脈血供受損或中斷，使骨細(xì)胞及骨髓成分部分死亡引起骨組織壞死及隨后發(fā)生的修復(fù)，共同導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變及塌陷，引起髖關(guān)節(jié)疼痛及功能障礙的疾病[1]。ONFH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床上采用非手術(shù)或手術(shù)方法治療ONFH，但治療效果均不令人滿意[2]。外泌體是一種微小的具有雙層膜的細(xì)胞外囊泡，在細(xì)胞間的交流中擔(dān)任重要角色[3]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在促進(jìn)骨形成和血管修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用[4]。因此，外泌體逐漸成為ONFH診治研究中的新熱點(diǎn)。本文對(duì)外泌體進(jìn)行了概述，對(duì)外泌體在ONFH診斷和治療中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了綜述。

1 外泌體概述

外泌體的直徑為30～100 nm，屬于細(xì)胞外囊泡[5]。外泌體由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、干細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，參與細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)、抗原呈遞等過(guò)程[6-7]。外泌體內(nèi)含有多種生物活性分子，如跨膜蛋白、肌動(dòng)蛋白、膜聯(lián)蛋白等多種蛋白，能夠參與細(xì)胞的組成和運(yùn)動(dòng)[8]；還包括miRNA、非編碼RNA、mRNA等多種核酸分子，其中miRNA能夠激活信號(hào)分子及靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的基因表達(dá)[9-10]。目前，制備外泌體的方法主要有超速離心法、尺寸排阻色譜法、免疫親和捕獲法和微流體技術(shù)等，制備外泌體的原料可以是體液或細(xì)胞培養(yǎng)基[11-12]。通常根據(jù)外泌體的大小、形態(tài)和標(biāo)記蛋白進(jìn)行外泌體的鑒定：①外泌體直徑30～100 nm；②電子顯微鏡下外泌體為杯形或圓形；③外泌體含有CD9、CD63、CD81和TSG101等標(biāo)志蛋白[13]。

2 外泌體在ONFH診斷中的應(yīng)用價(jià)值

早期ONFH通常無(wú)明顯癥狀，常采用MRI進(jìn)行診斷，但此類檢查價(jià)格昂貴，患者負(fù)擔(dān)較重。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體能夠被釋放到血液或體液中，而其內(nèi)容物能夠反映細(xì)胞的生理或病理情況，進(jìn)而反映疾病的發(fā)生階段[14-15]。因此，檢測(cè)血液或體液中外泌體的內(nèi)容物成分可能成為診斷疾病發(fā)生和發(fā)展的新方法[16]。目前，已有關(guān)于將外泌體作為診斷ONFH生物標(biāo)志物的可行性研究。Zhu等[17]采用納米檢測(cè)法檢測(cè)85例激素性O(shè)NFH患者和115例健康志愿者的血清外泌體含量，結(jié)果顯示，激素性O(shè)NFH患者的血清外泌體含量低于健康志愿者，外泌體血清含量診斷激素性O(shè)NFH的受試者操作特征曲線下面積為0.72，表明外泌體血清含量對(duì)激素性O(shè)NFH的診斷具有中度準(zhǔn)確性。Zhang等[18]納入5例患激素性O(shè)NFH的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者、5例無(wú)激素性O(shè)NFH的SLE患者及5例健康志愿者，抽取3組受試者的血液，并分析血清外泌體中miRNA的差異表達(dá)，結(jié)果顯示，患激素性O(shè)NFH的SLE患者血清外泌體中hsa-miR-135b-5p的表達(dá)顯著上調(diào)；提示血清外泌體中hsa-miR-135b-5p可作為診斷激素性O(shè)NFH的生物標(biāo)志物。外泌體攜帶性質(zhì)穩(wěn)定的miRNA，作為診斷早期ONFH的生物標(biāo)志物，具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確度，且相較于MRI，更加方便、經(jīng)濟(jì)。

3 外泌體在ONFH治療中的應(yīng)用價(jià)值

3.1 成骨細(xì)胞來(lái)源外泌體成骨細(xì)胞能夠促進(jìn)新骨生成、骨量增加，在骨骼生長(zhǎng)與重塑的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[19]。Ge等[20]對(duì)小鼠成熟成骨細(xì)胞MC3T3來(lái)源外泌體進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞MC3T3來(lái)源外泌體中的肝配蛋白B1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白Ⅰ型受體、Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6等在骨組織修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Ge等[21]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞MC3T3來(lái)源外泌體中包含Rho GTPases，而Rho GTPases是Ras超家族的Rho亞類的成員，包括RhoA、Rac1和Cdc42，其中RhoA在骨重塑中具有重要作用。Cui等[22]研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞MC3T3-E1來(lái)源外泌體能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cell，BMSC)ST2向成骨細(xì)胞分化，且成骨細(xì)胞MC3T3-E1來(lái)源外泌體通過(guò)miRNA轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)BMSC ST2中miRNA的表達(dá)發(fā)生改變。成骨細(xì)胞來(lái)源外泌體所攜帶特定的蛋白與miRNA可調(diào)控成骨微環(huán)境中的細(xì)胞間通訊，在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前，針對(duì)成骨細(xì)胞來(lái)源外泌體的研究正在不斷深入，其對(duì)于ONFH治療及發(fā)病機(jī)制的探索都具有重要意義。

3.2 破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體破骨細(xì)胞是骨吸收細(xì)胞，由骨髓特定的破骨細(xì)胞前體活化后產(chǎn)生，具有減少骨量的作用。在ONFH發(fā)生過(guò)程中，破骨細(xì)胞增多，其分泌的酶和酸性物質(zhì)分解骨基質(zhì)，導(dǎo)致骨溶解與壞死，最終使股骨頭發(fā)生塌陷[23-24]。Huynh等[25]研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞前體來(lái)源外泌體可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化與成熟，同時(shí)成熟破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體中富含核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)，可競(jìng)爭(zhēng)性的與核因子κB受體活化因子結(jié)合，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的形成；提示破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體是破骨細(xì)胞旁分泌的重要調(diào)節(jié)因子。Sun等[26]研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體內(nèi)的EphrinA2蛋白可與成骨細(xì)胞所含有的EphrinA2蛋白受體相結(jié)合，將破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體中的miRNA運(yùn)輸至成骨細(xì)胞，進(jìn)而降低成骨細(xì)胞活性，造成骨量減少。Li等[27]研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體中的miR-214-3p在體外可降低成骨細(xì)胞活性，而在體內(nèi)能夠抑制小鼠骨形成。Yang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在RANKL誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞(破骨細(xì)胞祖細(xì)胞)來(lái)源外泌體中，miR-23a-5p過(guò)表達(dá)；而含miR-23a-5p的破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體可抑制成骨細(xì)胞活性，抑制破骨細(xì)胞釋放外泌體可緩解對(duì)成骨細(xì)胞的抑制作用；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a-5p通過(guò)抑制Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2的表達(dá)參與抑制成骨細(xì)胞活性。破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體可通過(guò)其內(nèi)含的生物分子促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成，抑制成骨細(xì)胞形成。因此，通過(guò)靶向破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體減弱其對(duì)成骨細(xì)胞的抑制作用，從而可緩解骨量減少，改善ONFH。

3.3 間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一種非造血多能成體干細(xì)胞，能進(jìn)行自我更新和多向分化，可從骨髓、滑膜、臍帶血與胎盤(pán)等組織中獲取[29]。研究表明，MSC來(lái)源外泌體可以通過(guò)上調(diào)骨形成相關(guān)基因表達(dá)促進(jìn)MSC的成骨分化[30-31]。由于MSC具有易培養(yǎng)、來(lái)源廣、抗原性低等優(yōu)點(diǎn)，目前正被廣泛應(yīng)用于ONFH領(lǐng)域的研究中[32]。

3.3.1BMSC來(lái)源外泌體 隨著對(duì)BMSC研究的不斷深入，BMSC廣泛應(yīng)用于多種骨科疾病的治療，也是治療ONFH的新的研究方向[33-34]。BMSC是最早、最常見(jiàn)的外泌體來(lái)源之一，多項(xiàng)研究表明[35-36]，BMSC來(lái)源外泌體可以促進(jìn)骨形成，減少骨丟失，進(jìn)而治療骨組織損傷。Takeuchi等[37]在MSC細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入BMSC、BMSC來(lái)源外泌體和含有血管生成抑制劑的BMSC來(lái)源外泌體后，檢測(cè)MSC的成骨分化潛能，結(jié)果顯示BMSC來(lái)源外泌體能夠顯著增強(qiáng)MSC的細(xì)胞遷移及成骨分化、血管生成相關(guān)基因的表達(dá)。Zhang等[38]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC來(lái)源外泌體能夠顯著增強(qiáng)股骨骨不連模型大鼠的成骨、血管生成和骨愈合過(guò)程，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞MC3T3-E1可通過(guò)吸收BMSC來(lái)源外泌體，改善其增殖和遷移能力。Zhang等[39]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC來(lái)源外泌體可以通過(guò)促進(jìn)血管生成對(duì)由類固醇誘導(dǎo)的ONFH細(xì)胞模型起修復(fù)作用，同時(shí)BMSC來(lái)源外泌體可以作為siRNA的載體，提高siRNA的轉(zhuǎn)染效率。Fang等[40]研究了BMSC來(lái)源外泌體對(duì)類固醇誘導(dǎo)的ONFH模型大鼠BMSC成骨分化的影響，結(jié)果表明，BMSC來(lái)源外泌體可通過(guò)上調(diào)SOX9蛋白水平促進(jìn)BMSC的成骨分化。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的經(jīng)典通路，在ONFH的治療中具有重要作用。Zuo等[41]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC來(lái)源外泌體可以通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，恢復(fù)受損BMSC的功能，加速BMSC的DNA修復(fù)，解除BMSC的增殖抑制，恢復(fù)BMSC的分化潛能。Liao等[42]在ONFH模型家兔中經(jīng)尾靜脈滴注了轉(zhuǎn)染miR-122-5p的BMSC來(lái)源外泌體，結(jié)果顯示家兔股骨頭的骨密度、骨小梁體積和骨小梁板厚度均有所增加，壞死的股骨頭愈合速度加快。BMSC來(lái)源外泌體具有較強(qiáng)的促進(jìn)成骨分化與調(diào)控血管生成能力，同時(shí)也是重要的外泌體來(lái)源，其在ONFH治療中具有巨大的潛力。

3.3.2滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(synovial mesenchymal stem cell，SMSC)是成體干細(xì)胞之一，具有增殖及多向分化能力，可向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌腱纖維細(xì)胞分化[43]。SMSC來(lái)源外泌體能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和遷移，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)骨組織起到修復(fù)作用[44]。Tao等[45]研究發(fā)現(xiàn)，SMSC來(lái)源外泌體中含有Wnt5a與Wnt5b蛋白，可通過(guò)調(diào)控Wnt5a/Yes相關(guān)蛋白信號(hào)通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。郭尚春[46]研究發(fā)現(xiàn)，在激素性O(shè)NFH模型大鼠體內(nèi)注射SMSC來(lái)源外泌體后，能有效緩解激素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞凋亡與骨組織損傷等ONFH病理改變；而體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SMSC來(lái)源外泌體可被BMSC攝取，促進(jìn)BMSC細(xì)胞增殖，并對(duì)由血清饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起抑制作用。Guo等[47]研究發(fā)現(xiàn)，將SMSC來(lái)源外泌體注射到由糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的ONFH模型大鼠體內(nèi)，可有效減少大鼠骨小梁丟失、骨髓壞死和脂肪細(xì)胞積累，改善大鼠股骨頭的骨密度與骨小梁微觀結(jié)構(gòu)，同時(shí)還可以逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和增殖抑制，增加股骨頭中成骨細(xì)胞的數(shù)量，改善ONFH。因此，在ONFH早期采用SMSC來(lái)源外泌體治療，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞與BMSC增殖，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善ONFH。

3.3.3人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC)可以促進(jìn)血管生成，預(yù)防糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的ONFH；hUC-MSC來(lái)源外泌體作為重要的旁分泌機(jī)制之一，可以抑制BMSC凋亡，增強(qiáng)骨形成與血管生成，治療骨損傷[48-50]。Kuang等[51]研究發(fā)現(xiàn)，Wharton’s jelly組織的hUC-MSC來(lái)源外泌體對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的ONFH具有良好治療作用；進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，Wharton’s jelly組織的hUC-MSC來(lái)源外泌體可通過(guò)miR-21-PTEN/AKT信號(hào)通路抑制凋亡蛋白BAD和Caspase3，逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素引起的細(xì)胞凋亡作用，促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖。

3.3.4其他間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體 Wang等[52]研究發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎模型小鼠的關(guān)節(jié)內(nèi)注射胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體，能夠阻止小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)的軟骨破壞；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體可通過(guò)增加Ⅱ型膠原的合成和降低細(xì)胞外基質(zhì)降解酶ADAMTS5的表達(dá)緩解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡。Liang等[53]研究發(fā)現(xiàn)，人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體中富含miR-125a，而miR-125a能夠通過(guò)靶向3’非翻譯區(qū)來(lái)抑制血管生成抑制劑Delta-like4的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮尖端細(xì)胞形成，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成，提示人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體可作為一種促血管生成因子參與各類組織的修復(fù)。Liu等[54]研究發(fā)現(xiàn)，多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體能夠通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞中的PI3K/AKT信號(hào)通路，預(yù)防骨丟失，同時(shí)可以顯著增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管形成能力，增加股骨頭微血管密度；提示多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體在ONFH的預(yù)防和治療中發(fā)揮重要作用。因此，上述多種MSC來(lái)源的外泌體可通過(guò)細(xì)胞間的組織通訊，促進(jìn)骨細(xì)胞與血管細(xì)胞的增殖，達(dá)到緩解骨組織破壞、促進(jìn)骨與血管生成的目的，進(jìn)而改善ONFH。

3.4 富血小板血漿來(lái)源外泌體富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)是新鮮全血離心后獲取的血漿，富含多種生長(zhǎng)因子，可誘導(dǎo)成骨與血管生成，加速骨損傷的愈合，抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，修復(fù)壞死骨組織[55]。PRP來(lái)源外泌體在骨組織、軟骨組織與慢性創(chuàng)面修復(fù)中擔(dān)任重要角色，具有強(qiáng)大的組織修復(fù)功能，且其具備穩(wěn)定性高、生物兼容性好、易于規(guī)?；a(chǎn)等諸多優(yōu)點(diǎn)，成為開(kāi)展外泌體研究的重點(diǎn)內(nèi)容[56]。Tao等[57]在體外將PRP來(lái)源外泌體分別與人微血管內(nèi)皮細(xì)胞、BMSC和成骨細(xì)胞MC3T3-E1置于大劑量激素環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示PRP來(lái)源外泌體能夠減弱地塞米松對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞、BMSC 和成骨細(xì)胞MC3T3-E1的抑制作用與凋亡效應(yīng)；PRP來(lái)源外泌體能夠拮抗地塞米松對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A的抑制，促進(jìn)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，維持BMSC的成骨分化能力，抵抗細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)股骨頭；將PRP來(lái)源外泌體用于甲潑尼龍琥珀酸鈉誘導(dǎo)的ONFH模型大鼠，大鼠體內(nèi)骨細(xì)胞凋亡得到緩解。因此，PRP來(lái)源外泌體能夠干擾激素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和增殖抑制，進(jìn)而促進(jìn)骨與血管生成，改善股骨頭血運(yùn)，增強(qiáng)股骨頭的骨強(qiáng)度和骨密度。

不同來(lái)源的外泌體作為信號(hào)分子運(yùn)輸?shù)妮d體，在不同細(xì)胞之間發(fā)揮通訊交流的重要作用。外泌體能夠大規(guī)模生產(chǎn)，易于收集，且在低溫環(huán)境下可長(zhǎng)期儲(chǔ)存，同時(shí)還具備無(wú)細(xì)胞毒性、低免疫原性和靶向性等諸多優(yōu)勢(shì)，已成為新一代的天然納米級(jí)遞送系統(tǒng)[13,58-59]。多項(xiàng)研究表明，不同來(lái)源的外泌體應(yīng)用于ONFH模型動(dòng)物后，均能夠發(fā)揮修復(fù)骨損傷、改善骨壞死的作用[42,60-61]；不同來(lái)源外泌體在治療ONFH中參與多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路的調(diào)控[40,46-47,51,54,57]。這些研究成果對(duì)于ONFH發(fā)病機(jī)制與靶向治療的研究提供了重要的理論依據(jù)。此外，通過(guò)基因工程技術(shù)改造后的外泌體具備更強(qiáng)的靶向性和跨膜傳遞效率，將其作為藥物載體能夠提高藥物的生物利用度，進(jìn)而在ONFH的治療中發(fā)揮更好的療效[62]。

4 小 結(jié)

目前，臨床上治療ONFH的非手術(shù)或手術(shù)方法均不能令人滿意，而對(duì)外泌體的研究為ONFH的診治提供了新的研究方向。外泌體在血清中的含量以及外泌體內(nèi)miRNA的差異性均能夠反映ONFH的發(fā)生階段，其作為診斷ONFH的生物標(biāo)志物，具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確度。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠通過(guò)調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)和相關(guān)基因表達(dá)影響骨細(xì)胞、血管細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)而影響骨重塑。然而，目前關(guān)于采用外泌體治療ONFH的研究多局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，尚缺少臨床試驗(yàn)的相關(guān)報(bào)道，且對(duì)于不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體的具體適用對(duì)象，尚無(wú)確切論述。因此，利用外泌體診治ONFH，仍需開(kāi)展大樣本、多中心、前瞻性隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)進(jìn)一步深入研究，且需對(duì)外泌體的治療劑量、安全用藥等方面進(jìn)行規(guī)范，以促進(jìn)其臨床轉(zhuǎn)化。