胞外囊泡在銀屑病中的研究進展

陸子軒 吳建華

海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院皮膚科，上海，200433

銀屑病是一種多基因遺傳背景下免疫介導的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，全球患病率約為2%[1]。銀屑病的特征主要是以多種免疫細胞浸潤為基礎(chǔ)的持續(xù)炎癥引起的角質(zhì)形成細胞的過度增殖和分化異常，主要表現(xiàn)為局限或泛發(fā)的鱗屑性紅色斑塊，可伴關(guān)節(jié)炎等系統(tǒng)性損害。在遺傳背景基礎(chǔ)上多因素誘發(fā)的先天和獲得性皮膚免疫反應(yīng)紊亂導致了銀屑病炎癥的發(fā)展和持續(xù)。胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是可由幾乎所有細胞釋放的一類脂質(zhì)雙層包裹的顆粒，可作為載體向鄰近或遠處目標細胞運輸生物活性物質(zhì),通過這種細胞間通訊方式調(diào)控廣泛的生理或病理反應(yīng)[2]。近年的研究表明[3，4]，EVs穿梭在多種類型的細胞中，參與了銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、特應(yīng)性皮炎、大皰性類天皰瘡等慢性炎癥性皮膚病和自身免疫性疾病的發(fā)病過程。本文介紹了EVs的生物學特性及其在銀屑病發(fā)病機制中的研究進展，并探討EVs在銀屑病診斷與治療中的價值。

1 EVs的來源及生物學特性

根據(jù)大小和生成途徑不同，EVs大致可分為兩大類：ectosomes和exosomes(外泌體)。前者由質(zhì)膜直接向外出芽而形成，包括直徑約50 nm～1 um的微泡(microvesicles)、微粒(microparticles)和大囊泡(large vesicles)；而后者經(jīng)細胞內(nèi)吞途徑形成，由含有多個腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)的多胞體(multivesicular bodies，MVB)與質(zhì)膜融合釋放，直徑約40～160 nm(平均約100 nm)，CD63、CD81和CD9等跨膜蛋白是其重要的表面標志物[2]。EVs的內(nèi)部或表面可攜帶蛋白質(zhì)、DNA、RNA、脂類以及代謝物等多種細胞成分，通過向受體細胞傳遞特定內(nèi)容物發(fā)揮重要的物質(zhì)交換和胞間通信作用，參與多種免疫反應(yīng)和疾病的發(fā)展。其中，外泌體因其獨特的生成途徑受到更多關(guān)注。外泌體可存在于血液、尿液等諸多體液中，其含有的miRNA和蛋白質(zhì)等功能性內(nèi)容物可能作為診斷性生物標記物。同時，外泌體作為潛在的治療靶點或作為輸送藥物的有效載體，具備很有前景的治療潛力[5]。然而由于目前的技術(shù)尚不能分離出完全純化的外泌體，因此有人指出現(xiàn)階段應(yīng)將很多文獻中的“外泌體”視為包含外泌體和微泡等小胞外囊泡(small extracellular vesicles，sEVs)的混合物[6]。

2 EVs在銀屑病發(fā)病機制中的作用

現(xiàn)有研究認為[1，7]，損傷的角質(zhì)形成細胞分泌的LL37、β-防御素(β-defensins)等抗菌肽可被樹突狀細胞(DCs)識別，這在銀屑病的初始階段起著重要作用。激活的髓系樹突狀細胞(mDCs)釋放腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-12(IL-12)和IL-23，促進輔助性T淋巴細胞(Th)1和Th17亞群分化和增殖，分泌干擾素-γ(IFN-γ)、IL-17、IL-21和IL-22刺激表皮角質(zhì)形成細胞的增殖，推動了銀屑病炎癥的維持階段。其中TNF-α及IL-23/IL-17軸在銀屑病發(fā)病機制中有中心地位。

2.1 角質(zhì)形成細胞來源EVs 為研究銀屑病中角質(zhì)形成細胞外泌體對中性粒細胞的影響，Jiang團隊[8]用銀屑病細胞因子雞尾酒(IL-17A、IL-22和TNF-α)作用于角質(zhì)形成細胞，發(fā)現(xiàn)其釋放的外泌體被中性粒細胞攝取后可促進中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)形成和IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子的表達，且咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導的銀屑病小鼠的角質(zhì)形成細胞外泌體可促進小鼠皮膚中性粒細胞浸潤和角質(zhì)形成細胞增殖。這些效應(yīng)可能是通過NF-κB和p38MAPK途徑實現(xiàn)的。在此基礎(chǔ)上，該團隊進一步研究了角質(zhì)形成細胞sEVs對T細胞的作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)上述細胞因子雞尾酒處理的角質(zhì)形成細胞的sEVs促進了Th1/Th17極化[9]。這可能是由于sEVs中顯著增多的miR-381-3p通過抑制CD4+T細胞中UBR5和Foxo1兩種靶基因的表達減弱了二者對Th1和Th17的負性調(diào)控。此外，銀屑病患者外周血CD4+T細胞中miR-381-3p的表達亦顯著上調(diào)，且其含量與銀屑病面積和嚴重程度指數(shù)(PASI)評分呈正相關(guān)，提示miR-381-3p可能作為判斷銀屑病病情的生物標志物。這些工作表明通過阻斷銀屑病角質(zhì)形成細胞的EVs或其功能性內(nèi)容物對中性粒細胞、T細胞等靶細胞的作用是銀屑病潛在的治療策略。

還有研究者[10]發(fā)現(xiàn)經(jīng)重組人IL-17A處理的HaCaT細胞EVs中β-defensins 2、中性粒細胞趨化因子(CXCL1、CXCL3、CXCL5、CXCL6和CXCL8)表達增加，而使用IL-17A抗體Secukinumab預(yù)處理可完全消除這些變化。經(jīng)處理的EVs被其他HaCaT細胞攝取后可誘導受體細胞中內(nèi)源性β-defensins 2的過度表達，這主要是由于IL-17A隨EVs轉(zhuǎn)移到受體細胞所致。表明角質(zhì)形成細胞EVs可放大由IL-17A誘導的角質(zhì)形成細胞中的促炎級聯(lián)反應(yīng)，這一機制可能在銀屑病皮損周圍慢性炎癥狀態(tài)的放大中發(fā)揮作用。

2.2 免疫細胞來源EVs 來源于肥大細胞和中性粒細胞等免疫細胞的EVs在銀屑病的發(fā)病機制中同樣具有重要作用。比如有研究[11]發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者肥大細胞在IFN-α誘導下通過外泌體將一種胞漿型磷脂酶A2-PLA2G4D轉(zhuǎn)移到胞外，激活脂質(zhì)特異的CD1a反應(yīng)性T細胞，促進IL-22和IL-17A生成，抑制PLA2G4D或阻斷CD1a可能對銀屑病具有治療效果。Shao等[12]證實泛發(fā)性膿皰型銀屑病(generalized pustular psoriasis，GPP)患者中性粒細胞通過外泌體激活角質(zhì)形成細胞中GPP相關(guān)炎性基因，促進細胞因子(IL-1β、IL-18、IL-36G和TNF-α)與趨化因子(CXCL1、CXCL2、CXCL8和CCL20)的高表達，導致中性粒細胞的遷移和自身炎癥循環(huán)的加劇。這可能是由于GPP患者中性粒細胞外泌體中人類嗅素蛋白4(olfactomedin 4，OLFM4)、脂質(zhì)運載蛋白2(lipocalin 2，Lcn2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)和S100A8等功能性抗菌蛋白和酶差異性表達增多，通過激活MAPK和NF-κB通路在角質(zhì)形成細胞中發(fā)揮效應(yīng)。其中，OLFM4可上調(diào)中性粒細胞趨化因子表達且其水平與GPP的嚴重程度呈正相關(guān)，可作為判斷GPP患者病情嚴重程度和預(yù)后的標志。這一研究完善了銀屑病中角質(zhì)形成細胞和中性粒細胞之間通過外泌體相互作用并產(chǎn)生不同效應(yīng)的可能機制，同時表明EVs不僅在適應(yīng)性免疫反應(yīng)主導的尋常型銀屑病中意義重大，在先天免疫系統(tǒng)主導的GPP中同樣有重要作用。

2.3 微生物來源EVs 多種證據(jù)支持皮膚或腸道微生物的失調(diào)參與銀屑病的發(fā)病機制?；谥囟茹y屑病患者和健康對照組血清來源的EVs 16S rDNA的測序分析表明，其來源的細菌群落有明顯差異，中重度銀屑病患者中芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等菌群較多[13]。血清EVs可作為評估銀屑病患者微生物群變化的指標，這些異常的微生物群可能通過血清EVs參與了銀屑病的發(fā)病。

表皮葡萄球菌是重要的皮膚共生菌，其在銀屑病患者的受損皮膚上明顯減少。表皮葡萄球菌共生株(ATCC12228)和臨床分離株(983)來源的EVs對HaCaT細胞和IMQ誘導的銀屑病小鼠模型的影響有明顯差異[14]。相較983EVs，ATCC12228EVs對共培養(yǎng)的HaCaT細胞細胞因子的表達無明顯影響，而顯著降低小鼠皮損中中性粒細胞的浸潤和炎性細胞因子的表達，并增加IL-36受體拮抗劑(IL-36Ra)的水平。表明ATCC12228的缺失可能在銀屑病的發(fā)展中起到了作用，ATCC12228EVs在銀屑病中具有潛在抗炎作用，這一效應(yīng)可能與其含有的豐富酶類細菌產(chǎn)物有關(guān)。

3 EVs作為銀屑病的診斷性生物標志物

目前銀屑病嚴重程度判定缺乏有效的實驗室指標。EVs在各種體液中廣泛分布，其表面和內(nèi)部有多種微小RNA、功能性蛋白、mRNA以及長鏈非編碼RNA等活性物質(zhì)，且因受到脂質(zhì)雙層保護較游離狀態(tài)性質(zhì)更穩(wěn)定，可能成為評判銀屑病嚴重程度和治療效果的重要指標。

3.1 微小RNA(microRNA，miRNA) miRNAs是一種介導轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的短單鏈非編碼RNA。最近發(fā)現(xiàn)[15]，銀屑病患者血清EVs中miR-11400上調(diào)、miR-501-3p下調(diào)最為顯著。同時，miR-199a-3p在銀屑病患者中的表達水平顯著高于健康對照和玫瑰糠疹患者，且與PASI評分和受累體表面積(BSA)均呈正相關(guān)。表明血清EVs中miR-199a-3p不僅有助于鑒別銀屑病和玫瑰糠疹，還可以反映銀屑病的嚴重程度。

銀屑病性關(guān)節(jié)炎(psoriatic arthritis，PsA)在銀屑病患者中發(fā)生率較高，易漏診和誤診，目前尚無PsA診斷的特異性血清學標志物。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，外泌體參與PsA的發(fā)病，PsA患者外周血外泌體能促進破骨細胞的分化和成熟，加重關(guān)節(jié)炎癥和骨侵蝕。有19個血漿來源的EV miRNAs被證實在伴或不伴PsA的斑塊型銀屑病患者中存在顯著差異[17]，其中l(wèi)et-7b-5p和miR-30e-5p在前者中的表達水平明顯低于后者。這項研究的一個不足之處是未設(shè)置健康對照組進行更有說服力的比對。另一項類似的研究[18]使用RNA測序證實了PsA和尋常型銀屑病患者以及健康對照者血清EVs中miRNAs的含量存在明顯富集差異。如在PsA組血清EVs中miR-10b-5p、miR-10a-5p和miR-34a-5p等miRNA的水平顯著低于對照組；且相較于尋常型銀屑病患者，PsA患者血清EVs中的QXBT12、miR-671-3p和miR-342-3p顯著減少，而miR-33a-5p和miR-338-5p明顯增多。這兩項研究在結(jié)果上的差異可能由多種原因?qū)е?，如樣本量較小、群體差異以及EVs提純方法不同等。但仍然提示PsA患者血清EVs中特征性改變的miRNAs可能反映了PsA關(guān)節(jié)損傷的病理過程，是PsA早期診斷和預(yù)后判斷的潛在生物標記物。

3.2 蛋白質(zhì)類 有研究[19]發(fā)現(xiàn)，不論是否經(jīng)過甲氨蝶呤、IL-17抗體等全身治療，中、重度銀屑病患者血漿中IL-17A外泌體水平均顯著高于輕度銀屑病患者。表明血漿中IL-17A外泌體水平可能是評估銀屑病患者系統(tǒng)治療反應(yīng)的穩(wěn)定的生物標志物。但受限于樣本量，未發(fā)現(xiàn)血漿中IL-17A外泌體與銀屑病的嚴重程度之間的線性相關(guān)關(guān)系。

4 EVs在銀屑病治療中的研究進展

近年來，雖然針對TNF-α和白細胞介素的銀屑病生物靶向治療取得了一定的成就，但銀屑病的根治仍處困境，因此要不斷探索新的治療方法或藥物。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞。已有一些動物研究和臨床案例報道顯示MSCs對銀屑病有較好治療效果[20]。MSCs外泌體(MSCs-exo)被認為是MSCs與靶細胞之間相互作用的主要方式，MSCs-exo在調(diào)節(jié)Th17/調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)平衡方面與MSCs作用相似，可抑制Th17分化，促進Treg增殖[21]。此外，外泌體作為運輸各種治療劑的載體在銀屑病中的治療作用同樣值得探索。

4.1 MSCs-exo在銀屑病治療中的研究進展 MSCs-exo的應(yīng)用途徑不同可能涉及不同的作用機制，產(chǎn)生不同的效果。局部外用(無論是在水溶液中還是在水包油乳劑中)人胚胎干細胞來源的MSCs-exo可滲透進小鼠皮膚角質(zhì)層，降低IL-17、IL-23以及末端補體復(fù)合體C5b-9的水平[22]，這可能由于MSCs-exo通過抑制補體的激活減少了中性粒細胞在角質(zhì)層的聚集和IL-17的釋放。臍帶血單個核細胞富含MSCs，其來源的sEV處理的3D銀屑病皮膚模型中炎性因子(IL-6、IL-8、CXCL10和COX-2)及S100A7和β-defensins 2的表達顯著減少，局部外用sEV水凝膠制劑可減弱IMQ誘導的小鼠角質(zhì)形成細胞的過度增殖，并增加皮膚中Treg的數(shù)量[23]。這兩項局部應(yīng)用MSCs-exo的動物實驗中均未見明顯的肉眼皮損改善，僅在病理和細胞因子水平顯示出一定抗炎作用。不同的是，皮下注射人臍帶來源的MSCs-exo可明顯改善IMQ誘導的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥，且皮損中STAT3/p-STAT3、IL-17、IL-23和CCL20水平降低[24]。表明人臍帶來源的MSCs-exo可能通過抑制STAT3/p-STAT3通路，下調(diào)IL-23/IL-17軸關(guān)鍵炎癥因子的表達。

4.2 外泌體作為運輸載體在銀屑病治療中的研究進展 外泌體可被設(shè)計用來輸送短干擾RNA、反義寡核苷酸、化療藥物和免疫調(diào)節(jié)劑等不同的治療劑。細胞因子信號抑制因子(suppressor of cytokine signaling1，SOCS1)可負性調(diào)控JAK/STAT信號通路。通過重組腺病毒感染DCs可獲取含SOCS1的外泌體，將獲得的外泌體皮下注射作用于IMQ誘導的銀屑病小鼠可顯著改善其皮損，降低外周血IL-17A和IL-23的表達[25]，這可能與SOCS1外泌體抑制Th17/IL-17軸有關(guān)。程序性死亡分子1(programmed cell death 1，PD-1)及其配體程序性死亡分子配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)是重要的負性免疫調(diào)節(jié)因子。Xu等[26]利用病毒感染小鼠骨髓來源的MSCs構(gòu)建了含PD-L1的小胞外囊泡(MSC-sEVs-PD-L1)。在體外MSC-sEVs-PD-L1通過改變激活的T細胞、DCs和巨噬細胞等免疫細胞的表型使其處于免疫抑制狀態(tài)，并減少IFN-γ、TNF-α和IL-2等炎性細胞因子的產(chǎn)生，靜脈注射MSC-sEVs-PD-L1可使銀屑病小鼠表皮厚度明顯減小、皮損改善，而上述改變可被PD-L1抗體所消除，表明MSC-sEVs-PD-L1可能對銀屑病有治療潛力。

5 小結(jié)

綜上所述，在銀屑病中，外泌體等EVs可由角質(zhì)形成細胞、免疫細胞等多種細胞及微生物產(chǎn)生，作為胞間通訊的重要載體介導靶細胞產(chǎn)生多種效應(yīng)，參與銀屑病的不同發(fā)病機制。其攜帶miRNA(如miR-381-3p、miR-199a-3p)和蛋白質(zhì)(如OLFM4、IL-17A)等多種活性物質(zhì)且具備優(yōu)良的穩(wěn)定性，可作為銀屑病早期診斷、療效及預(yù)后評價的生物標志物。EVs不僅是銀屑病潛在的治療靶點，而且經(jīng)設(shè)計的EVs可作為載體運輸不同的治療劑(如SOCS1、PD-L1)。同時，MSCs-exo克服了細胞治療的局限性，是一種有前景的銀屑病無細胞治療新途徑。然而，還有許多問題亟待解決。首先，通過超速離心等常用的分離方法，尚不能完全區(qū)分外泌體和其他胞外囊泡，尤其是功能性微泡；其次，當前有關(guān)外泌體的研究局限于體外和動物，基于外泌體的臨床療法在人體中的安全性和有效性有待證實。因此，不僅要不斷開發(fā)新的分離和檢測技術(shù)，還需要開展更多的基礎(chǔ)研究揭示外泌體的生成、轉(zhuǎn)導和在銀屑病中的作用機制，以及更大規(guī)模和更長周期的動物實驗來評估其療效和長期不良反應(yīng)，以期盡快實現(xiàn)其向臨床的轉(zhuǎn)化?？傊?，目前對EVs在銀屑病領(lǐng)域的研究還只是冰山一角，還有巨大的潛能有待挖掘。