靶向微泡在超聲分子成像與治療方面的研究進展

徐雪瑩，王岳恒

微泡（microbubbles，MB）是一種直徑在2 ～8 μm的超聲造影劑[1]。 MB 能夠通過直接相連法、非共價結(jié)合法等方法連接特定的配體從而成為功能化的靶向微泡（targeted microbubbles，tMB）[2]。 tMB 可以與疾病發(fā)生、發(fā)展過程中表達的特定分子相結(jié)合，尤其是內(nèi)皮細胞表達的生物標志物[3]。 從而能夠監(jiān)測疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。近年來，國內(nèi)外學者研發(fā)出了各種各樣tMB，許多實驗結(jié)果證實tMB 在疾病的診療方面有顯著優(yōu)勢，且目前載有抗血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）的tMB 也已經(jīng)開始用于前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌等的臨床研究[4]。 目前，概括來說tMB 主要應用于超聲分子成像（ultrasound molecular imaging，UMI）和疾病靶向治療領域。 筆者將重點闡述tMB 的分類與制備和在UMI 領域及疾病治療領域的最新研究進展。

1 靶向微泡的分類與制備

傳統(tǒng)制備tMB 方式是將單一抗體或小肽連接到脂質(zhì)外殼上， 最近用新的制備工藝研發(fā)出了新的tMB，如磁化tMB、黏附多個配體tMB 及黏附新型配體的tMB。將磁性納米顆粒添加到MB 的脂質(zhì)外殼中即能產(chǎn)生磁化tMB[5]。 磁化tMB 由于含有磁性納米顆粒，在磁場具有磁感應性加熱特征，可對靶區(qū)腫瘤實現(xiàn)熱療。有研究數(shù)據(jù)表明，在胰腺癌小鼠模型中，使用磁化tMB 明顯提高了腫瘤的治療效果[6]。 黏附多個配體的tMB 相較于黏附單個配體的tMB， 具有更好的靶向性。 例如在小鼠肝細胞癌腫瘤模型中，與僅裝置VEGFR2 抗體，或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽（arginine-glycine-aspartate，RGD）的tMB 相比，同時裝置VEGFR2 抗體和RGD 肽的tMB 在超聲下所顯示的肝癌信號強度明顯更高[7]。此外，同時攜帶抗血管細胞黏 附 分 子1 （vascular cell adhesion molecule -1，VCAM-1）、 抗細胞間黏附分子1 （intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1） 和抗合成聚合物唾液酰LewisX 的三重tMB 比單tMB 能更有效地黏附于小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞3 （brain-derived endothelial cells 3，bEnd.3） 和能更好地監(jiān)測動脈粥樣硬化的演變過程，以及能夠更精準評估阿托伐他汀對小鼠動脈粥樣硬化模型的治療效果[8]。

隨著已知生物標志物和新配體的種類、數(shù)量越來越多，新研發(fā)的tMB 隨之而來。例如對于診斷性UMI，研究表明，使用胸腺細胞分化抗原1（mocyte differentiation antigen 1，thy1）結(jié)合的單鏈抗體作為tMB 的配體，可以用于荷瘤小鼠胰腺導管腺癌診斷[9]，含抗軸突導向因子1（Netrin-1）的tMB，可用于乳腺癌的診斷[10]。一種攜帶小于目前常用抗體尺寸的配體，即攜帶B7-H3（屬于B7 配體家族成員，在多數(shù)癌癥類型中都過度表達）抗體的tMB，可用于原位人乳腺癌和轉(zhuǎn)基因乳腺癌小鼠模型中UMI[11]。 此外，附著基質(zhì)金屬蛋白酶1 抗體（anti-matrix metalloppoteinase-1，anti-MMP-1）的tMB 可用于小鼠喉鱗狀細胞癌早期診斷[12]。 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican，GPC3）的功能化tMB可用于小鼠肝細胞癌靶向超聲動力學治療[13]。 一項研究發(fā)現(xiàn)，使用基于二硬脂酰基磷脂酰膽堿（disaturated phosphatidylcholine，DSPC） 的MB 先與抗CD4 偶聯(lián)，然后結(jié)合CD4 陽性淋巴細胞， 可以監(jiān)測大鼠同種異體心臟移植物是否發(fā)生急性排斥反應[14]。

此外，為了使得tMB 能夠應用于臨床，必須使用一種生物素-鏈霉親和素偶聯(lián)的方法將配體與MB 結(jié)合，以避免機體出現(xiàn)免疫反應。例如在制備攜帶P-選擇素和E-選擇素的tMB，一種策略是使用一種基于T細胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白1 （T-cell immunoglobulin mucin family member 1，TIM-1） 的重組蛋白與硫醚鍵共價偶聯(lián)，另一種策略是將配體與MB外殼中的馬來酰亞胺基團的化學偶聯(lián)[15]。而且，新開發(fā)的菌株促進的[3+2]氮炔環(huán)加成（strain-promoted[3+2]azide-alkynecycloaddition，SPAAC）可用于MB 形成后的配體無菌偶聯(lián)過程[16]。 此外，用乳酸黏附素修飾后的士卓安 （Sonazoid） 造影劑制備的αvβ3 整合素（是細胞黏附家族的重要成員， 在多種腫瘤細胞表面及新生血管內(nèi)皮中高表達）的tMB 也可避免機體出現(xiàn)免疫反應。 但是目前上述tMB 制備方法及對超聲反應的描述并不系統(tǒng)全面， 這阻礙了tMB 快速發(fā)展及向臨床轉(zhuǎn)化的進程， 未來應對tMB 的制備工藝及超聲反應進行系統(tǒng)描述。

2 靶向微泡在超聲分子成像領域的應用

UMI 主要用于研究疾病進展、診斷成像和監(jiān)測治療反應，常用于心血管疾病、腫瘤等領域。在心血管疾病方面，P-選擇素、VCAM-1、血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）和基質(zhì)細胞衍生因子1（stromal-derived-factor-1，SDF-1）等因子是監(jiān)測動脈粥樣硬化炎癥反應的常用靶點[17]。 如P-選擇素-tMB 可用于評估大鼠心房顫動模型的血栓形成的風險，并與白細胞-tMB 和CD4-淋巴細胞-tMB 一起，可以在自身免疫性心肌炎小鼠模型中預測是否會發(fā)生心室纖維化和重構(gòu)[18]。 在腫瘤方面，Netrin-1-tMB 用于小鼠乳腺癌中Netrin-1 陽性表達程度的檢測， 這為是否開始Netrin-1 干擾治療提供重要的診斷信息。B7-H3-tMB的UMI 可以在乳腺癌小鼠模型中區(qū)分轉(zhuǎn)移性和反應性前哨淋巴結(jié)[19]，并且以P-選擇素和αvβ3 整合素為靶點的雙靶向tMB 在腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的信號強度明顯高于良性淋巴結(jié)。因此也可以用于區(qū)分良性和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)[20]。 另外，UMI 還適用于監(jiān)測腫瘤抗血管生成的治療效果，如舒尼替尼和貝伐珠單抗對血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR） 表達的抑制作用可以用UMI 進行較精準的監(jiān)測。此外，目前VEGFR2-tMB 的制備工藝較成熟，可用于跟蹤結(jié)腸癌、乳腺癌和透明細胞性腎細胞癌等腫瘤模型的疾病進展和治療反應[21，22]，且VEGFR2-tMB（即BR55）已經(jīng)完成了Ⅱa 臨床試驗，BR55投入臨床，大規(guī)模造福病人指日可待。

但是在UMI 被轉(zhuǎn)化到臨床之前還必須證明每個分子靶點的臨床相關性。有學者使用體外高危和低風險的人類頸動脈斑塊進行鑒定的方法篩選出了動脈粥樣硬化中高危頸動脈斑塊的生物標志物，如VCAM-1、氧化低密度脂蛋白受體（lectin like oxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1）、P-選擇素和VWF。且研究發(fā)現(xiàn)VCAM-1-tMB 在體外血流下與人主動脈內(nèi)皮結(jié)合最好[23]。 在腫瘤方面，VEGFR1 在眼部黑色素瘤小鼠模型中被驗證為良好的血管模擬的生物標志物[24]。 未來，將對面向臨床轉(zhuǎn)化的tMB 的配體進行更嚴格的篩選。

3 靶向微泡在疾病治療領域的應用

無論是在心血管疾病治療領域還是在腫瘤治療方面，tMB 的治療效果都明顯優(yōu)于非tMB[25~27]。 在心血管疾病治療領域， 靜脈注射磁化tMB 或附著有ICAM-1 或P-選擇素抗體的tMB 治療效果都顯著優(yōu)于普通非tMB。 如體內(nèi)大鼠血栓模型中，同時使用磁化tMB 和重組人組織型纖溶酶原激活物（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）能增強凝塊附近的空化能，從而增加溶栓效果[24]。負載白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）-tMB 能穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊[28]。 在腫瘤領域，靜脈注射附著有VEGFR2、αvβ3、CD13 或DLL4（Delta-like，一種膜結(jié)合的Notch 配體）抗體的tMB 或是以CD326 為靶點的tMB 顯像和治療效果也強于非tMB。例如超聲介導的負載DLL4-tMB 增加了小鼠胃腫瘤的凋亡率[29]。 此外，Kang M 等[30]也證實攜帶環(huán)RGD 肽和趨化因子受體2[che-mokine（C-C motif）receptor 2，CCR2]抗體的雙靶向陽離子tMB 的乳腺癌信號更強且治療效果更好。 除此之外，學者們對超聲聯(lián)合tMB 治療疾病的機制進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)tMB 可以以多種方式增強局部藥物傳遞， 這些治療作用的機制尚不完全清楚，但已經(jīng)闡述了多種藥物傳遞的途徑，如聲孔效應、內(nèi)吞作用和細胞間接觸打開、細胞內(nèi)鈣離子流動等[31，32]。

另外，學者們還發(fā)現(xiàn)不同類型的配體可以通過不同的方式連接到MB 上，5-氟尿嘧啶和紫杉醇可以通過改變MB 外殼和結(jié)構(gòu)的方式整合到MB 中[33]，DNA可以結(jié)合到脂質(zhì)外殼的陽離子上[34]，抗體、脂質(zhì)體、生物素化藥物通過鏈霉親和素-生物素橋接法與脂質(zhì)外殼相連。 抗體也可充當媒介將MB 與干細胞偶聯(lián)，如CD90 抗體可以充當橋梁作用將ICAM-1 抗體和MB連接到一起，從而可以靶向動脈粥樣硬化斑塊中內(nèi)皮細胞，穩(wěn)定小鼠體內(nèi)動脈粥樣硬化斑塊[35]。 此外，配體也可以被合并到脂質(zhì)體外殼后再通過鏈霉親和素-生物素法連接到MB 上， 該策略制備tMB 的優(yōu)勢在于配體對脂質(zhì)體的親和力更好。 Zhao G 等[36]研究表明，在體內(nèi)膠質(zhì)瘤大鼠模型中， 一種含有短發(fā)夾RNA（short hairoin RNA，shRNA） 的CD13 靶向脂質(zhì)體，可以打開血腦屏障 （blood brain barrier，BBB）， 增強shRNA 的傳遞，從而抑制腫瘤生長，延長存活時間。此外，學者們還對超聲聯(lián)合tMB 的治療時間、超聲頻率等進行了深入研究。 發(fā)現(xiàn)研究采用的超聲頻率在0.25 ～4.00 MHz 不等。治療的時間在一定周期內(nèi)多次重復治療不等， 每次治療的時間也是1 ～20 min 不等。 未來， 隨著對tMB 治療作用的深入研究， 將使tMB 在腫瘤、心血管等疾病領域的治療的作用達到最大化。

4 小結(jié)與展望

筆者強調(diào)了tMB 在超聲分子成像和治療中的不同用途和潛力，以及相較于非tMB,使用tMB 進行治療的優(yōu)勢。 tMB 有時甚至可以用作治療藥物，這也是UMI 與治療的結(jié)合。 同時在未來，tMB 仍有許多需要進一步完善的地方， 例如需要進一步闡明tMB 復雜的生物學機制及腫瘤細胞-藥物相互作用的機制，以達到最大程度地發(fā)揮tMB 治療療效的目的。 隨著新的tMB 不斷開發(fā)， 推動tMB 的臨床轉(zhuǎn)化成為tMB 未來發(fā)展的核心問題。 此外，研究人員需要盡可能詳細地闡述tMB 生產(chǎn)的方法，包括脂質(zhì)材料的種類、摩爾比、使用的有機溶劑的類型等，因為以上各種方面都會對tMB 的大小、 穩(wěn)定性等產(chǎn)生巨大的影響。 而且tMB 上配體的多樣性使其進入臨床的途徑變得復雜，為了促進tMB 的廣泛使用， 還需要就生產(chǎn)規(guī)范和臨床使用標準達成共識。