克氏梭菌在人工窖泥培養(yǎng)中的應(yīng)用研究

王海英，王慧，屈慧，楊玉珍，馬飛，盧杰，王慧青

（內(nèi)蒙古河套酒業(yè)技術(shù)中心，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015400）

生產(chǎn)濃香型白酒，窖泥是基礎(chǔ)，大曲是動力，工藝是關(guān)鍵。做濃香型優(yōu)質(zhì)酒，首先要抓好窖泥質(zhì)量，窖泥的好壞直接決定著酒質(zhì)的優(yōu)劣。窖泥是己酸菌、甲烷菌、丁酸菌等各種有益物的載體和棲息場所，也是繁衍溫床，這些有益微生物的種類和數(shù)量的多少是衡量窖泥質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。同時適當(dāng)含量的理化指標(biāo)也可保證窖池中正常的微生物代謝，也是判定窖泥質(zhì)量好壞的重要標(biāo)準(zhǔn)。

本課題探究在和制窖泥時添加克氏梭菌菌液、其他菌液和不添加菌液，通過對3 種窖泥理化指標(biāo)、微量成分與微生物區(qū)系的監(jiān)控與分析，探究添加克氏梭菌的窖泥和其他的區(qū)別及差異性，系統(tǒng)掌握窖泥在發(fā)酵培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質(zhì)、代謝成分和微生物種群的變化規(guī)律，確定和總結(jié)己酸菌對提升和改善窖泥品質(zhì)的效果，從而為生產(chǎn)高質(zhì)量的窖泥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及實驗方案

1.1.1 菌種

廠內(nèi)老窖泥中分離的產(chǎn)己酸的細(xì)菌，經(jīng)過鑒定為一株克氏梭菌；31#復(fù)合菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

采用巴氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為其繁殖的對數(shù)期。

1.1.3 試驗條件及方案

1.1.3.1 設(shè)備

不銹鋼大盆；2000 mL 玻璃燒杯；上海博訊HPX-9272MBE 數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱；和制鐵鏟、封口膜、橡膠圈等。

1.1.3.2 條件

和制場地為實驗室和制，密封發(fā)酵，實驗室34 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.1.3.3 窖泥和制方法

和制方法按照我廠QJ/NHJ G.12-2020 人工窖泥生產(chǎn)工藝規(guī)程和制窖泥，在潤好的黏黃土中，加入大曲粉2.50%、豆餅粉1.50%、鮮糟5%、窖皮泥5 %、泥炭10 %等物料充分翻拌，保證所有物料混合均勻，再加入黃水5%，液體功能菌液15%，和制均勻，于分裝容器內(nèi)密封發(fā)酵，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.1.3.4 方案

按照1.1.3.3 窖泥和制方法和制窖泥，共設(shè)計3個實驗方案，除菌種外其他基礎(chǔ)配料和比例均一樣。每個方案，分裝15 個平行樣并且分裝的每個平行樣品重約1.8 kg，以備取樣檢測。在后續(xù)分析時F1 對照方案記為dz；F2 克氏方案記為ks；F3 復(fù)合方案記為fh。具體方案見表1。

表1 實驗方案

1.1.4 取樣時間

3 個方案中，在每個方案的15 個平行樣中，設(shè)計取樣時間：0 d、1 d、2 d、4 d、6 d、9 d、12 d、15 d、19 d、24 d、30 d，45 d、60 d、75 d、90 d 共15 個取樣時段。每個時段所取樣品，同一樣品留樣5 份準(zhǔn)備檢測用，每份留樣50 g左右，留樣后先放冰箱冷凍，其中4 份統(tǒng)一送往四川成都生物科學(xué)院，分析在窖泥培養(yǎng)中加入不同菌種對窖泥發(fā)酵過程中微生物區(qū)系的變化和特征。其余四分檢測其他指標(biāo)。

1.2 檢測方法

1.2.1 檢測儀器及試劑

安捷倫7890A-5975C 氣質(zhì)聯(lián)用儀；日本島津GC-2014 色譜儀；上海博弈數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱；pH 酸度計、低溫離心機、可見風(fēng)光光度計、液相色譜等；斐林試劑，氫氧化鈉，磷酸緩沖溶液等。

1.2.2 常量成分分析測方法

窖泥中水分、有機質(zhì)、有效磷、氨態(tài)氮和pH 值等常量指標(biāo)分析按照河套酒業(yè)QJ/NHJD.01.3-2011窖泥分析方法檢測。

1.2.3 微量成分分析方法

窖泥中代謝產(chǎn)物分析，如乙酸、丁酸和己酸等酸類物質(zhì)采用氣相色譜填充柱分析；正丙醇、正丁醇等醇類，己酸乙酯、乙酸乙酯等四大酯類物質(zhì)，利用氣相色譜法毛細(xì)柱分析。

樣品前處理方法：準(zhǔn)確稱取一定量窖泥樣品，加入65%vol的乙醇溶液，冰浴浸提，低溫離心后過濾膜，濾液上氣相色譜法毛細(xì)柱測定醇類和酯類物質(zhì)。酸類物質(zhì)需要用甲酸酸化后上氣相色譜填充柱測定。

氣相色譜填充柱分析條件：使用2 m 測酸定制填充柱，柱溫130 ℃保持12 min，以20 ℃/min 速率升溫到170 ℃，保持10 min，以20 ℃速率升溫到180 ℃；進樣口、檢測器溫度190 ℃；載氣高純氮氣，載氣流量30 mL/min 保持17 min，以5 mL/min 升到50 min。

采用外標(biāo)法，配制200 mg/100 mL 乙酸、丙酸、丁酸和己酸混標(biāo)，配制10 mL，用50 %乙醇溶液定容，待用。

氣相色譜毛細(xì)柱分析條件：使用50 MC×0.25 mm的CP—Wax57CB柱，高純氮氣為載氣，流速1.8 mL/min，尾吹氣約30 mL/min；毛細(xì)柱分流比33∶1；起始柱溫35 ℃，保持4 min，以5 ℃/min 升溫至120 ℃，保持15 min，再以10 ℃/min 升溫至230 ℃，保持10 min。進樣口溫度為230 ℃，檢測器溫度為240 ℃。

1.2.4 高通量測序方法

試驗通過Realtime PCR 實時熒光定量的方法對樣本16S 基因(Weimer,2012)進行定量。

1.2.4.1 引物

引物分別為CloKly1F/CloKly1R（CloKly1F，5'-GAGGAGCAAATCTCAAAAACTGC-3'；CloKly1R,5'-CCTCCTTGGTTAGACTACGGACTT-3'）。

1.2.4.2 Realtime PCR 體系

Realtime PCR體系為25μL。SsoFast TM EvaGreen ? Supermix 12.5 μL；CloKly1F 1 μL；CloKly1R 1 μL；DNA 2 μL；ddH2O to 25 μL。所有樣本進行3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.4.3 PCR擴增程序

98 ℃預(yù)變性30 s，1 個循環(huán)；95 ℃變性5 s，59 ℃退火5 s，72 ℃延伸5 s，40 個循環(huán)；1 step 溶解曲線信號采集。熒光數(shù)據(jù)采集在延伸結(jié)束時進行。實時熒光定量PCR 在Bio-Rad Opticon2 熒光定量PCR 儀上進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥培養(yǎng)過程中的理化指標(biāo)

2.1.1 常規(guī)指標(biāo)

窖泥的常規(guī)指標(biāo)包括水分、有機質(zhì)、有效磷、氨態(tài)氮、速效鉀、pH值、總酸和乳酸等8項指標(biāo)。選擇3 個方案中理化指標(biāo)存在明顯差別的指標(biāo)進行分析。有機質(zhì)、有效磷、氨態(tài)氮和乳酸共4項在3個方案中隨著培養(yǎng)發(fā)酵時間的延長存在明顯的差異，對這3項指標(biāo)進行具體分析。

2.1.1.1 有機質(zhì)隨時間的變化曲線

有機質(zhì)，一般用于生物領(lǐng)域,狹義的是指所有可以被生物(包括微生物和植物酶)分解的有機物。窖泥中有機質(zhì)含量與微生物的生長、繁殖有著密切的聯(lián)系。有機質(zhì)的主要組成部分腐殖質(zhì)及其分解產(chǎn)物是己酸菌等微生物的主要養(yǎng)分，能幫助增加讓水分進入的空隙，改善窖泥在發(fā)酵過程中的失水環(huán)境，還可以緩解乳酸鈣、乳酸鐵的形成，避免窖泥的板結(jié)退化，所以根據(jù)窖泥中有機質(zhì)的含量高低可以判斷窖泥的優(yōu)劣[1]。

對3 個方案窖泥樣品有機質(zhì)進行分析，有機質(zhì)隨培養(yǎng)老熟的時間的變化，分析時對每個方案每個樣品檢測3次的數(shù)值求取平均值后進行分析。

由圖1 可知，窖泥的有機質(zhì)隨時間的變化規(guī)律，3 個方案有機質(zhì)起始值差別不大，數(shù)值在6%～7 %范圍之內(nèi)，0～90 d 整體呈現(xiàn)出緩慢降低趨勢。在整個窖泥老熟的過程中，除個別發(fā)酵時間點，克氏方案的窖泥有機質(zhì)在發(fā)酵期任意發(fā)酵培養(yǎng)時間均略高于其他兩個方案。在培養(yǎng)結(jié)束時，克氏方案窖泥的有機質(zhì)仍然高于對照和復(fù)合方案窖泥的有機質(zhì)。在整個窖泥的培育與老熟的過程中，克氏方案窖泥有機質(zhì)整體降低幅度是最小的。說明添加克氏梭菌菌種和制窖泥并且培育老熟，對于增強窖泥疏松肥沃程度、提高窖泥的蓄水能力、減少由于失水而導(dǎo)致的窖泥老化問題以及減緩窖泥在后期發(fā)酵中老化速度等方面均有促進的作用，同時為保證微生物正常生長和代謝提供了基礎(chǔ)條件。

圖1 不同方案窖泥樣品的有機質(zhì)隨時間的變化曲線圖

2.1.1.2 有效磷隨時間的變化曲線

有效磷，是能被己酸菌等微生物及時吸收利用的磷素，進入細(xì)胞后迅速同化為含磷化合物質(zhì)。窖泥中加入含磷物質(zhì)，以及和制窖泥所用土壤中含有的微量磷元素，是保證生物及微生物吸收的磷素來源。

由圖2 可知，3 個窖泥方案的有效磷變化規(guī)律基本一致，從0～90 d呈現(xiàn)出逐漸降低的變化規(guī)律，說明在窖泥發(fā)酵老熟過程中有效磷降低；3 個方案有效磷起始值在1000 mg/kg 左右，克氏方案有效磷最低，對照和復(fù)合比較接近，有效磷在1～4 d 時克氏居于對照和復(fù)合之間，且復(fù)合高于對照，從第6天開始到培養(yǎng)發(fā)酵結(jié)束，克氏方案有效磷高于對照和復(fù)合。在窖泥發(fā)酵培養(yǎng)老熟過程有效磷趨于降低的前提下，克氏方案有效磷降低幅度相對較小。

圖2 不同方案窖泥樣品的有效磷隨時間的變化曲線圖

2.1.1.3 氨態(tài)氮隨時間的變化曲線

窖泥中氨態(tài)氮是能被己酸菌等微生物利用的含氮物質(zhì)，能為微生物生長繁殖代謝提供必須的氮源，是組成己酸菌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的重要元素，是微生物生命活動中不可或缺的物質(zhì)。

由圖3 可知，對照和復(fù)合方案窖泥的氨態(tài)氮變化規(guī)律基本一致，克氏方案窖泥的氨態(tài)氮和對照、復(fù)合略有不同?？傮w來看，3 個方案窖泥的氨態(tài)氮隨培養(yǎng)時間的延長都呈現(xiàn)出不同程度的升高趨勢。3個方案氨態(tài)氮起始值基本相同，在40 mg/100 g 干土左右，氨態(tài)氮0～4 d基本保持不變。對照和復(fù)合方案的窖泥氨態(tài)氮隨著發(fā)酵時間的延長從6 d 到15 d 迅速升高，升高到100 mg/100 g 干土以上，15 d到培養(yǎng)結(jié)束呈現(xiàn)出降低、升高、再降低、再升高的趨勢?？耸戏桨附涯喟睉B(tài)氮從第9 天到12 天略有升高但幅度不大，12 d 到45 d 屬于迅速升高階段，最高為140 mg/100 g 干土，45 d 到培養(yǎng)結(jié)束，經(jīng)歷下降再升高。培養(yǎng)結(jié)束后氨態(tài)氮克氏高于對照高于復(fù)合。

圖3 不同方案窖泥樣品的氨態(tài)氮隨時間的變化曲線圖

2.1.1.4 乳酸隨時間的變化曲線

由圖4 可知，3 組窖泥乳酸隨時間的變化規(guī)律基本一致，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢?？傮w來看，3 組方案窖泥從開始發(fā)酵到培養(yǎng)結(jié)束，乳酸值平均降低5～8 g/kg。發(fā)酵起始3 組窖泥乳酸值克氏和復(fù)合相同，低于對照。隨發(fā)酵時間的延長克氏方案窖泥乳酸值變化比較簡單，0～2 d 時乳酸迅速升高，在第2 天到達最高值，14 g/kg 左右；從第2 天到第9 天又迅速降低到1 g/kg 左右，第9 天到培養(yǎng)結(jié)束，乳酸一直保持在1.38 g/kg，后期的發(fā)酵基本穩(wěn)定。對照和復(fù)合窖泥乳酸值在發(fā)酵過程中變化比較復(fù)雜，大致為先升高后降低之后又升高再降低，呈現(xiàn)出鋸齒形的變化規(guī)律，其中復(fù)合窖泥乳酸在發(fā)酵第9 天達到最大值為18 g/kg，對照在第2 天出現(xiàn)最高值為12 g/kg，以鋸齒形變化直到發(fā)酵30 d，對照和復(fù)合均降低至最小值2 g/kg 左右，發(fā)酵結(jié)束后，對照和復(fù)合乳酸值基本相等。在發(fā)酵結(jié)束后，乳酸值克氏最低，復(fù)合中間，對照最高。

圖4 不同方案窖泥樣品的乳酸隨時間的變化曲線圖

在人工窖泥配制的過程中，在物料以及和制過程中空氣中會存在大量的產(chǎn)酸菌，也會存在利用乳酸的微生物群類，使得乳酸含量變化趨勢具有一定的規(guī)律性。本實驗中，發(fā)酵前期產(chǎn)乳酸的微生物占主導(dǎo)地位，使得乳酸大量生成，后期乳酸利用菌有占主導(dǎo)地位，將前期合成的乳酸利用或分解，兩種作用達到平衡，使得人工培育窖泥乳酸保持在穩(wěn)定的水平。河套地區(qū)的土壤呈鹽堿性，在和制窖泥使用的土壤中，存在含量較高的鐵、鈣、鎂等離子或化合物，培育好的窖泥在窖池中長期與乳酸作用會逐漸形成乳酸亞鐵以及乳酸鈣等物質(zhì)，在乳酸菌生長繁殖中存在明顯的阻礙作用。乳酸亞鐵與乳酸鈣的長期積累是窖泥老化的主要原因[2]。所以在做窖泥時應(yīng)注意土壤中的鐵、鈣含量，注意在發(fā)酵培養(yǎng)時產(chǎn)生適量的乳酸，要考慮到延緩窖泥的老化情況。

2.1.2 微量指標(biāo)

3個方案的窖泥樣品按照樣品前處理方法處理后，采用測酸定制填充柱和毛細(xì)柱同時分析窖泥樣品中的微量成分。根據(jù)分析結(jié)果統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)窖泥中正丙醇和正丁醇等醇類物質(zhì)，己酸和丁酸等酸類物質(zhì)含量較高并規(guī)律性較強，做統(tǒng)計分析；窖泥中酯類和其他一些微量成分含量較小并且規(guī)律性不強，不做具體分析總結(jié)。

2.1.2.1 醇類指標(biāo)

醇類物質(zhì)是窖泥培養(yǎng)代謝產(chǎn)物的第三大類物質(zhì)[3]。窖泥在培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生一些含量頗高的雜醇油物質(zhì)比如正丙醇和正丁醇。雜醇油是不可缺少的香氣成分之一，與有機酸結(jié)合成酯，使白酒具有獨特香氣，若含量過高與酸酯比例不協(xié)調(diào)，則成為白酒的異雜味，長期飲用雜醇油含量較高的白酒，會對人體造成嚴(yán)重?fù)p害[4]。白酒生產(chǎn)企業(yè)控制白酒中雜醇油要盡量使用產(chǎn)雜醇油含量較低的發(fā)酵釀造物料如窖泥。在窖泥發(fā)酵培養(yǎng)的過程中要保持較低含量的雜醇油。通過對3 個方案檢測數(shù)據(jù)的整理統(tǒng)計，正丙醇和正丁醇分別采用均值來分析，具體分析見圖5。

由圖5 可知，3 個方案的窖泥樣品在整個發(fā)酵過程，正丙醇的變化規(guī)律是一致的，基本是先緩慢上升再略微下降的趨勢；3 個方案正丙醇起始值相同，0～30 d 均呈現(xiàn)緩慢升高的趨勢，并且在這一過程中ks 方案的正丙醇一直處于較低水平，ds 和fh差別不大，0～30 d 正丙醇ds＞fh＞ks，30～90 d 均呈現(xiàn)出降低升高又降低的變化趨勢，一直到培養(yǎng)結(jié)束，正丙醇含量存在ds＞fh＞ks 規(guī)律。3 個方案在整個發(fā)酵過程中，克氏方案產(chǎn)生的正丙醇含量最少，說明在和制窖泥時添加克氏梭菌培養(yǎng)發(fā)酵會或多或少抑制正丙醇的產(chǎn)生。

圖5 不同方案窖泥樣品的正丙醇隨時間的變化曲線圖

由圖6 可知，3 個方案窖泥的正丁醇隨時間的變化先升高后降低。3個方案窖泥正丁醇含量初始值均為0，說明在和制新泥使用的物料中均不含正丁醇。0～9 d 3 個方案正丁醇緩慢上升，微生物代謝產(chǎn)生正丁醇能力較弱，此時正丁醇含量fh＜ks＜dz。在窖泥發(fā)酵第9 天ks 的正丁醇迅速升高，12 d達到最大值50 mg/100 g，fh 的正丁醇在發(fā)酵第24天達到峰值為46.1 mg/100 g，dz 在窖泥發(fā)酵第60天達到峰值為59.6 mg/100 g。正丁醇含量的高低受制于正丁醇產(chǎn)生菌和正丁醇代謝菌的相互協(xié)同作用。Ks 在窖泥發(fā)酵前期，fh 在發(fā)酵中期，dz 在發(fā)酵后期均產(chǎn)生較高含量的正丁醇，說明在這個區(qū)間，以代謝產(chǎn)生正丁醇為主的細(xì)菌較為活躍。之后以正丁醇為底物分解代謝的細(xì)菌占主導(dǎo)或抑制生成正丁醇的細(xì)菌較為活躍，使得正丁醇保持在一定的水平。發(fā)酵結(jié)束后，正丁醇含量ks＜fh＜dz，說明添加克氏梭菌發(fā)酵培養(yǎng)老熟窖泥和降低窖泥中正丁醇的含量，兩者關(guān)系為正相關(guān)。

圖6 不同方案窖泥樣品的正丁醇隨時間的變化曲線圖

2.1.2.2 主要酸類指標(biāo)

窖泥中大量的產(chǎn)酸菌在培養(yǎng)窖泥的過程中，代謝產(chǎn)生乳酸、己酸、乙酸和丁酸等含量較高的有機酸，可以說酸類物質(zhì)是窖泥培養(yǎng)代謝產(chǎn)物的第一大類物質(zhì)。本文微量成分中酸類物質(zhì)的分析主要是針對己酸和丁酸。3個方案窖泥樣品的酸類物質(zhì)以丁酸和己酸均值和培養(yǎng)發(fā)酵時間分析，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，3個方案窖泥的丁酸值在整個發(fā)酵過程中，變化趨勢基本一致，隨著發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)出緩慢的升高趨勢。發(fā)酵開始時3個方案均存在少量的丁酸值且略有不同，這是由于在和制窖泥的時候，所用黃水、菌液等物料中含有丁酸，物料沒有和制均勻或物料所含丁酸含量不同，會造成發(fā)酵開始時丁酸存在并且含量不同。在發(fā)酵前期3個方案丁酸含量略有差別。0～4 d時，ks 和fh 方案窖泥的丁酸含量緩慢降低，這是由于和制窖泥用到的土壤和其他物料中存在瘤胃菌科（Ruminococcaceae）等一類梭菌，它可以將乳酸氧化合成乙酰輔酶A，并釋放出能量NADH，這類微生物通過碳鏈延長過程，在丁酰輔酶轉(zhuǎn)移酶等一系列酶的催化下，將乙酰輔酶A 與乙酸進行縮合，合成丁酸，再經(jīng)己酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶等的催化作用，將乙酰輔酶A 與丁酸縮合合成己酸，在這個過程中會消耗物料引入的丁酸、乳酸等物質(zhì)，同時會伴隨著己酸含量的增加。巴克氏認(rèn)為己酸菌將乙醇及丁酸轉(zhuǎn)化為己酸時，必須先有丁酸菌將乙醇和乙酸合成丁酸，即先有丁酸的發(fā)酵，也就是說丁酸的累積有利于己酸菌將丁酸轉(zhuǎn)化為己酸[5]，通過實驗得到的結(jié)論和理論相符。在發(fā)酵4～15 d 丁酸迅速升高，15 d 之后平穩(wěn)緩慢地增加，發(fā)酵后期3 個方案的丁酸值fh 和ks 略高于dz，區(qū)別不大，整體來看是一個丁酸積累的過程。

窖泥的發(fā)酵老熟其實是微生物的發(fā)酵過程，當(dāng)發(fā)酵過程中碳源比例過高時，有機物通過糖酵解途徑生成大量丙酮酸，一部分進入三羧酸循環(huán)用于微生物自身生長，另一部分進入其他代謝途徑生成乙酸、乳酸和乙偶姻等代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)碳溢流代謝(carbon overflow metabolism，COM)現(xiàn)象。丁酸梭菌在發(fā)酵過程中也存在碳溢流代謝現(xiàn)象，COM 現(xiàn)象也會積累大量丁酸、乙酸等[6]。

由圖8 可知，在發(fā)酵開始時，3 個方案均存在不同含量的己酸，這也是由于物料因素引起的。整個發(fā)酵過程中3 個方案窖泥的己酸值，ks 和fh 己酸隨時間的變化規(guī)律基本一致，先升高后降低然后再次緩慢升高，0～4 d 己酸升高，這一現(xiàn)象和丁酸分析時結(jié)論相符，4～15 d 緩慢降低，15 d 到發(fā)酵結(jié)束，己酸處于緩慢平穩(wěn)升高的狀態(tài)。dz 在發(fā)酵前期己酸值變化規(guī)律恰好另兩個方案相反，0～6 d 己酸降低，從第6 天開始到發(fā)酵結(jié)束，一直緩慢平穩(wěn)的升高。3 個方案的己酸在發(fā)酵后期變化規(guī)律基本一致，且均處于緩慢平穩(wěn)的升高狀態(tài)，但升高的幅度不是很大。

圖8 不同方案窖泥樣品的己酸隨時間的變化曲線圖

窖泥中存在大量的葡萄糖營養(yǎng)型等產(chǎn)己酸菌群，可利用丁酸作為其合成己酸的前體物質(zhì)[7]。這一類微生物代謝產(chǎn)生己酸是從乙酸到丁酸再到己酸的碳鏈延長過程，所以在相同的酶水平狀態(tài)下，代謝產(chǎn)生己酸是一個緩慢的過程，需要長時間的積累。

2.2 微生物群落組成與多樣性分析以及不同培養(yǎng)方式微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律

提取樣品總DNA后，根據(jù)V3+V4區(qū)設(shè)計引物，合并引物接頭，進行PCR 擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，文庫質(zhì)檢合格后用IlluminaMiSeq PE300 測序。對樣品原始測序序列進行過濾、雙端拼接，得到優(yōu)化序列（Tags），使用QIIME（version 1.8.0）軟件中的UCLUST 對Tags 在97%的相似度水平下進行聚類，獲得OTU，基于細(xì)菌分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU 進行分類學(xué)注釋，得到樣品各分類水平上的物種分類信息，以下數(shù)據(jù)及分析均在屬水平上進行。

2.2.1 不添加菌液培養(yǎng)窖泥過程中的微生物群落組成與多樣性分析

圖9 列出了不加菌液培養(yǎng)窖泥過程中屬水平上排名前10的微生物類群。

由圖9 可知，剛和制好的窖泥以芽孢桿菌為主（Bacillus，31.47 %），其他類群的比例均小于1 %。培養(yǎng)第1天，芽孢桿菌數(shù)量略有上升（38.71%），乳球菌的數(shù)量迅速增加（Lactococcus，24.89），腸球菌的數(shù)量也開始增加（Enterococcus，4.44 %），乳球菌和腸球菌均為兼性厭氧的乳酸菌，產(chǎn)生乳酸。這些菌的繁殖可消耗體系中的氧氣，同時乳酸菌繁殖產(chǎn)生的乳酸降低了體系中的pH值，兩方面的作用使不耐酸、不耐缺氧的芽孢桿菌數(shù)量逐漸下降，至發(fā)酵第6 天時相對豐度降到了10%以下。耐酸、耐缺氧的厭氧菌開始繁殖，Clostridium_1發(fā)酵第1 天開始增殖，發(fā)酵第6 天達到最大值（36.02 %），Clostridium_12（通常認(rèn)為的己酸菌克氏梭菌屬于此類群）發(fā)酵第2 天即達到較高數(shù)量（16.72%），在整個發(fā)酵期均維持較高的數(shù)量，相對豐度均大于1 %。厭氧芽孢桿菌在發(fā)酵第9 天至第30 天均維持較高的水平（大于5 %）。Caproiciproducens（一種能利用半乳糖醇產(chǎn)己酸的細(xì)菌）在發(fā)酵第6 天開始大量繁殖，在整個發(fā)酵期均占有較大比例，發(fā)酵15～75 d 其相對比例均占到20%以上。腸球菌在發(fā)酵第6天后數(shù)量下降，另一種乳酸菌乳芽孢桿菌（Sporolactobacillus）數(shù)量增加，至第15 天時相對豐度達到23.06%。至發(fā)酵第90天，窖泥中相對比例大于1 %的微生物屬均為厭氧或兼性厭氧類群，包括Caproiciproducens（10.10 %）、Escherichia-Shigella（9.46 %）、厭氧孢桿菌（2.56 %）、乳芽孢桿菌（2.51%）、Clostridium_1（2.93%）等。

圖9 不加菌液培養(yǎng)窖泥過程中主要微生物相對豐度（屬水平，%）

2.2.2 添加克氏菌液培養(yǎng)窖泥過程中的微生物群落組成與多樣性分析

圖10 列出了加克氏梭菌培養(yǎng)窖泥過程中屬水平上排名前10的微生物類群。

由圖10 可知，剛和制好的窖泥以芽孢桿菌（Bacillus，16.99%）、Clostridium_12（9.66%）和乳桿菌（Lactobacillus，4.94%）為主，其他類群的比例均小于1 %。發(fā)酵90 d 的窖泥以Caproiciproducens（22.97 %）、Escherichia-Shigella（7.58 %）、乳球菌（Lactococcus，2.41 %）、Clostridium_1（1.47 %）和乳桿菌（Lactobacillus，1.16%）為主，其他類群的相對豐度均小于1%。芽孢桿菌在發(fā)酵第1 天和第2 天大量增殖，之后數(shù)量逐漸下降，到第90 天時，相對比例為0.9 %。Clostridium_12 在發(fā)酵第1 天到第2天時因為其他菌的生長相對比例下降，之后開始繁殖，第4 天時相對比例達到最大，之后又逐漸下降，第9 天后基本穩(wěn)定在相對比例1%左右。乳桿菌在第12 天之前相對比例基本上無變化，第15 天時比例迅速增加到21.14%，之后又迅速下降，19 d 時相對豐度僅為3.04 %。培養(yǎng)第1天，乳球菌（Lactococcus）和瘤胃桿菌Rummeliibacillus的數(shù)量迅速增加到23.56 %和19.77 %，二者均為兼性厭氧菌。Rummeliibacillus耐乙醇，能產(chǎn)生乙醇、乙酸乙酯、乙偶姻等代謝產(chǎn)物，該屬菌在發(fā)酵第2 天后比例開始下降，第4 天開始，比例降到1%以下。乳球菌屬于乳酸菌，能產(chǎn)生乳酸，該類群在發(fā)酵前期比例均較高，第6 天之前比例大于30 %，第9～15 天相對豐度在10 %以上。乳桿菌和乳球菌均為乳酸菌，可產(chǎn)生乳酸。體系中還存在另一類乳酸菌——芽孢乳桿菌，該類群在初始窖泥中比例不高，但培養(yǎng)第1 天相對豐度即開始增加，到第6 天時達到23.58%，直到第30天，相對比例均在15%以上，之后逐漸下降，90 d 時相對豐度為0.96%。Clostridium_1 從發(fā)酵第1 天開始增殖，到發(fā)酵第12 天時相對豐度達到12.57%，之后逐漸下降，45～90 d 時穩(wěn)定在1%左右。

2.2.3 添加復(fù)合菌液培養(yǎng)窖泥過程中微生物群落組成與多樣性分析

圖11 列出了加復(fù)合菌液培養(yǎng)窖泥過程中屬水平上排名前10的微生物類群。

由圖11 可知，剛和制好的窖泥以芽孢桿菌（Bacillus，30.82 %）、Clostridium_1（13.79 %）、Clostridium_15（4.88 %）、Clostridium_12（3.17 %）、乳桿菌（Lactobacillus，2.88 %）和魏斯氏菌（Weissella，2.78 %）為主，其他類群的比例均小于1 %。發(fā)酵90 d 的窖泥相對豐度大于1 %能定性的類群僅有Escherichia-Shigella（8.30 %）和乳桿菌（Lactobacillus，3.04 %），其他能定性的類群比例均小于1 %，此外還有較多數(shù)據(jù)庫不能比對的厭氧菌類群的相對豐度大于1%。芽孢桿菌在培養(yǎng)第1 天相對豐度即開始迅速下降，到第90 天時，相對豐度為0.36%。Clostridium_1 在培養(yǎng)第1 天相對豐度迅速下降，直到第45 天開始增殖，相對豐度達到6.60%，第90 天時相對豐度仍維持在較高的水平。Clostridium_12和Clostridium_15 的變化規(guī)律相似，均為培養(yǎng)初期下降，第12 天時比例增加，之后又下降，第24 天時比例上升，之后又下降，第45 天時回升，之后又下降，到第90 天時，比例已低于1%。乳桿菌在整個培養(yǎng)過程中相對豐度較穩(wěn)定，均維持在1 %～10 %。魏斯氏菌(乳酸菌)初期豐度雖然較高，但在整個培養(yǎng)過程中比例沒有太大的增加，第6 天后開始下降，到第90 天時已低于1%。乳球菌在發(fā)酵第1 天相對豐度迅速增加，第1 天到第4 天相對豐度均在25%左右，之后開始下降，到第90 天時低于1 %。芽孢乳桿菌初始時比例較低，第4 天時開始增加，第6 天到24 天時比例均在20%以上，之后開始下降，第90天時低于1%。

圖11 加復(fù)合菌液培養(yǎng)窖泥過程中主要微生物相對豐度（屬水平，%）

2.3 3 個方案窖泥培養(yǎng)過程中微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律

2.3.1 培養(yǎng)初期樣品

3 種樣品中芽孢桿菌均為豐度最大的類群，窖泥以黏土為材料，芽孢桿菌是土壤中的主要微生物類群。加克氏梭菌組初始體系中Clostridium_12 的比例較高，克氏梭菌屬于Clostridium_12 類群。乳桿菌的相對豐度較高異常，推測是否在克氏梭菌菌液培養(yǎng)過程中伴生了乳桿菌的增殖。加復(fù)合菌液組初始體系中微生物類群相對較豐富，大于1%的類群有6個，芽孢桿菌主要來自于土壤，其他的類群應(yīng)該均來自于復(fù)合菌液，包括了厭氧的Clostridium_1、Clostridium_12和Clostridium_15 及兼性厭氧的兩類乳酸菌（乳桿菌和魏斯氏菌），表明在復(fù)合菌液的擴大培養(yǎng)過程中有可能也伴隨著乳酸菌的擴大培養(yǎng)。

2.3.2 培養(yǎng)過程樣品

3種樣品均以芽孢桿菌和乳酸菌的繁殖為起始發(fā)酵動力。芽孢桿菌中的大多數(shù)類群為好氧菌，生長迅速，芽孢桿菌的繁殖可以消耗體系中的氧氣，為厭氧菌的繁殖提供條件，部分芽孢桿菌發(fā)酵糖后可以產(chǎn)酸，降低體系的pH，抑制有害微生物的生長繁殖。隨著發(fā)酵的進行，體系中氧氣減少，厭氧菌繁殖，芽孢桿菌生長受到抑制，相對比例逐漸降低。3種樣品中復(fù)合菌液組芽孢桿菌的比例下降最快，可能是因為添加的復(fù)合菌液體系中厭氧菌和兼性厭氧菌的比例相對更高，厭氧菌起始生長的速度更快，芽孢桿菌的生長更早被抑制。

乳酸菌是中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的重要微生物，在窖泥培養(yǎng)過程中同樣起著重要的作用。乳酸菌為兼性厭氧菌，在有氧和缺氧環(huán)境中均能生長，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸可降低體系的pH值，還具抑菌作用，這些特性對抑制有害微生物生長、凈化釀造環(huán)境非常重要。3 種樣品均從第1 天開始就有乳酸菌迅速繁殖，第6 天以前主要是乳球菌的快速增殖，6 d 以后是乳桿菌、芽孢乳桿菌的增殖，所有乳酸菌在培養(yǎng)后期相對比例均下降，不加菌液組下降最快，15 d后所有乳酸菌的比例均下降到5%以下，加克氏梭菌和加復(fù)合菌液組的芽孢乳桿菌均在45 d后下降到5%左右。6～24 d之間，復(fù)合菌液組芽孢乳酸菌的相對比例比其他兩組高，反映在乳酸產(chǎn)量上，復(fù)合菌液組在培養(yǎng)6～24 d 期間乳酸含量高于其他兩組。芽孢乳桿菌為兼性厭氧菌，產(chǎn)生芽孢，最適生長溫度37 ℃（這可能也是其在培養(yǎng)中期階段仍能保持較高比例的原因），能產(chǎn)生D-乳酸，魯少文等[8]在人工窖泥培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)芽孢乳桿菌在窖泥培養(yǎng)不同時期均為優(yōu)勢微生物屬，關(guān)于該屬菌株在窖泥中的作用還需要進一步研究。

通常認(rèn)為的己酸菌克氏梭菌（屬于Clostridium_12類群）在3種處理中均有分布，但演替規(guī)律存在差異。不加菌液組初始體系中Clostridium_12 類群比例較低，發(fā)酵第2 天即迅速增加，第6 天開始下降，但整個培養(yǎng)過程一直維持較高水平，相對比例均大于1 %。加克氏梭菌組初始體系中Clostridium_12類群比例在3組中最高，起始生長慢，發(fā)酵第4 天相對比例增加，第6 天后又開始下降。復(fù)合菌液組Clostridium_12 的波動幅度更大，起始生長較慢，第12 天時達到培養(yǎng)初期相對比例的最大值，15～19 d 時比例迅速下降，19 d 后又回升，24 d 時達到3 組處理中Clostridium_12 相對比例的最大值，之后又迅速下降。

培養(yǎng)過程中還檢測到另外一類產(chǎn)己酸的類群Caproiciproducens，該屬菌能利用半乳糖醇產(chǎn)生己酸，有研究表明在分析不同窖泥的微生物種群結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)窖泥中這屬菌的比例較高。不加菌液組在9 d 后該類菌的比例迅速增加，30 d 時相對比例近50 %，30～75 d 的相對比例均在20 %以上。加克氏梭菌組該類菌生長的速度稍慢，24 d 之前相對比例增加的幅度較小，24 d 后迅速增加，30 d 時相對比例達40 %，之后整個培養(yǎng)期一直保持大于20%的比例。復(fù)合菌液組該類菌生長的速度最慢，相對比例也最小，30 d 時相對比例為2.09 %，45 d時相對比例達最大值15.44 %，60 d 后相對比例下降較快，90 d 時小于1%?？赡芙涯嘀衅渌麉捬蹙姆敝硶种艭aproiciproducens的生長，但未分離到這類菌，無法進行驗證。

2.3.3 培養(yǎng)結(jié)束樣品

3種樣品中芽孢桿菌的豐度均比初始狀態(tài)降到了1 %以下，體系中均以厭氧或兼性厭氧菌為主，均包括許多未鑒定或未培養(yǎng)菌（因沒有菌名，表1、表2、表3 均未列出未鑒定或未培養(yǎng)菌），復(fù)合菌液組厭氧未鑒定或未培養(yǎng)菌的種類和數(shù)量相對更高。不加菌液組相對比例大于1 %的有8屬，豐度最高的是Caproiciproducens（10.10 %）?？耸纤缶M相對比例大于1%的有5屬，豐度最高的也是Caproiciproducens（22.97 %）。復(fù)合菌液組相對比例大于1 %的有3屬，豐度最高的是Escherichia-Shigella（8.30%）。乳酸菌在3種樣品中均占有一定比例，相對豐度在5%左右。

3 結(jié)論

3.1 理化方面

窖泥培育中添加功能菌液，窖泥質(zhì)量優(yōu)于不加任何菌液的。在本實驗理化指標(biāo)中體現(xiàn)較為明顯，克氏方案有機質(zhì)、有效磷和氨態(tài)氮高于對照和復(fù)合，說明克氏組消耗有機質(zhì)和有效磷較少，使得克氏組有較強的營養(yǎng)物質(zhì)保留能力和蓄水能力，利于營養(yǎng)物質(zhì)的可持續(xù)利用，更有利于保證窖泥的肥力和緩沖性能，使得窖泥在后期的發(fā)酵中老化速度減慢；在整個發(fā)酵過程中添加克氏梭菌的方案乳酸相對較低，較低的乳酸在窖泥使用中會降低乳酸鈣和乳酸鐵的形成，延緩窖泥的老化，同時會抑制正丙醇、正丁醇等雜醇油的產(chǎn)生；對于己酸和丁酸等微生物代謝物質(zhì)規(guī)律不明顯。

3.2 微生物方面

無論是否加菌液，窖泥的培養(yǎng)均以芽孢桿菌和乳酸菌啟動，為厭氧體系的形成提供了經(jīng)濟高效的模式。加克氏梭菌或復(fù)合菌液培養(yǎng)，起始克氏梭菌的數(shù)量更高，但培養(yǎng)90 d 后克氏梭菌的相對比例并不高于不加菌液培養(yǎng)的窖泥。窖泥中還存在其他相對比例更高的產(chǎn)己酸菌，比如Caproiciproducens、Megasphaera埃氏巨球型菌、Ruminococcus_1瘤球菌1。3 組在發(fā)酵過程均出現(xiàn)放線菌，克氏組比例高于對照和復(fù)合，己酸菌和放線菌具有協(xié)同促進生長的作用，種類較多的放線菌可結(jié)瘤固氮，為窖泥己酸菌提供豐富的有機氮，增強窖泥肥力。同時還存在其他的厭氧菌影響窖泥的質(zhì)量。

培育中的窖泥微生態(tài)系統(tǒng)是由己酸菌、丁酸菌、甲烷菌、乳酸菌、硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌等多種微生物組成的微生物共生群落系統(tǒng)，該微生物群落隨發(fā)酵時間的不同，導(dǎo)致窖泥的化學(xué)生態(tài)不同,菌類菌種呈現(xiàn)明顯的區(qū)別。窖泥的培育過程是一個典型微生態(tài)群落的演替過程和各菌種間的共生、共酵、代謝調(diào)控過程，該過程不但對微生態(tài)群落中的菌種演替具有反饋抑制作用，而且會體現(xiàn)到窖泥的理化以及感官上，直接影響窖泥的質(zhì)量。