結(jié)腸癌組織中SRSF1蛋白的表達及其臨床意義

王姝昊，常肖璐，趙 磊，孫紫洋，樸俊杰，林貞花，金愛花

結(jié)腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤，也是全球癌癥死亡的主要原因[1]，其發(fā)病率在全球位居第3位，病死率位居第2位[2]，且其發(fā)病年齡呈年輕化趨勢[3]。預(yù)計2030年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)將超過220萬，死亡例數(shù)將達110萬[4]。隨著醫(yī)學水平的發(fā)展，腫瘤標志物在腫瘤的普查、診斷、預(yù)后評估和評價療效等起重要作用。CA19-9、AFP、CEA等是應(yīng)用較為廣泛的腫瘤血清標志物，由于結(jié)腸癌組織的異質(zhì)性和復(fù)雜性，目前尚未發(fā)現(xiàn)特異性較高的結(jié)腸癌標志物。因此，篩選可應(yīng)用于臨床的高特異性結(jié)腸癌標志物是當前亟需解決的問題。

富含絲氨酸/精氨酸剪接因子1(serine/arginine-rich splicing factor 1, SRSF1)又稱為SF2/ASF，屬于典型的SR蛋白家族成員[5]，其主要功能是參與細胞內(nèi)mRNA的剪接作用。研究顯示SRSF1可通過調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的剪接過程，介導(dǎo)腫瘤細胞增殖與凋亡，進而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。已有研究證實SRSF1高表達普遍存在于乳腺癌[7]、肺癌[8]、胃癌[9]等多種惡性腫瘤中，被認為是一種重要的原癌蛋白[10]。目前，關(guān)于SRSF1蛋白在結(jié)腸癌中的表達及其與患者預(yù)后關(guān)系的報道較少。因此，本文擬通過分析SRSF1蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達及其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，旨在為結(jié)腸癌的診斷提供潛在的分子標志物。

1 材料與方法

1.1 臨床資料結(jié)腸癌組織芯片(HColA180Su19)購自上海芯超公司，其中結(jié)腸癌組織94例，結(jié)腸癌癌旁正常組織86例，合計180點位。94例患者中男性48例，女性46例；年齡27～90歲，中位年齡65歲。隨訪截至2015年7月，患者生存期最長為78個月，最短為11天，中位生存期為70(23,75)個月。臨床病理分期采用AJCC第七版癌癥分期標準。

1.2 數(shù)據(jù)庫分析應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫檢索SRSF1 mRNA在33種腫瘤組織中的表達，通過TCGA官方數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站下載結(jié)腸癌STAR-Counts基因表達數(shù)據(jù)，整理獲得mRNA差異表達矩陣，分析結(jié)腸癌與癌旁正常組織中SRSF1 mRNA表達水平的差異。應(yīng)用GEO數(shù)據(jù)庫分析結(jié)腸癌與癌旁正常組織中SRSF1 mRNA表達水平的差異。

1.3 免疫組化采用免疫組化SP法染色，切片常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)，加入一抗SRSF1(1 ∶50稀釋)4 ℃孵育過夜；次日滴加二抗，DAB顯色，Mayer蘇木精對比染色，中性樹膠封固。免疫組化檢測SRSF1蛋白抗體的特異性，用已知陽性組織作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷SRSF1定位于細胞質(zhì)或細胞核中呈棕褐色為陽性，根據(jù)陽性細胞染色強度和陽性細胞百分率進行判斷。(1)根據(jù)陽性細胞染色強度計分：未著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；黃褐色為3分。(2)根據(jù)陽性細胞百分比計分：陽性細胞數(shù)0～5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。將上述兩項得分結(jié)果相乘：0～3分為(-)，4～6分為(+)，7～9分為()，10～12分為()。其中，將()和()定義為SRSF1高表達。

1.5 統(tǒng)計學分析采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗方法，運用Kaplan-Meier法和Cox回歸模型進行生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌中SRSF1 mRNA的表達通過TCGA數(shù)據(jù)庫檢索SRSF1基因在不同腫瘤中的表達，結(jié)果顯示：SRSF1 mRNA在多種腫瘤組織(膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、食管癌、結(jié)腸癌等)中表達增高；而在腎嫌色細胞癌、嗜鉻細胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤中表達降低(圖1A)。TCGA數(shù)據(jù)庫還顯示SRSF1 mRNA在473例結(jié)腸癌組織中的表達水平顯著高于41例正常結(jié)腸組織(P<0.01，圖1B)；GEO檢索顯示GSE74604數(shù)據(jù)集中SRSF1 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達水平為(7 369.9±1 328.7)TPM，顯著高于癌旁正常組織的(4 006.5±801.8)TPM(P<0.01,圖1C)；GES10972數(shù)據(jù)集同樣顯示SRSF1 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達水平為(0.29±0.36)TPM，顯著高于癌旁正常組織的(-0.40±0.33)TPM(P<0.01，圖1D)。

圖1 SRSF1 mRNA在結(jié)腸癌及癌旁正常組織中的表達及其與預(yù)后的相關(guān)性：A.SRSF1 mRNA在多種腫瘤中的表達(TCGA)；B.SRSF1 mRNA在結(jié)腸癌及癌旁正常組織中的表達(TCGA)；C.SRSF1 mRNA在結(jié)腸癌及癌旁正常組織中的表達(GSE74604數(shù)據(jù)集)；D.SRSF1 mRNA在結(jié)腸癌及癌旁正常組織中的表達(GES10972數(shù)據(jù)集)；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.2 結(jié)腸癌中SRSF1蛋白的表達本組對94例結(jié)腸癌組織及86例癌旁正常組織進行免疫組化染色，結(jié)果顯示：SRSF1主要表達于結(jié)腸癌細胞胞核與胞質(zhì)內(nèi)(圖2)。SRSF1蛋白在結(jié)腸癌組織中的陽性率和高表達率分別為92.6%(87/94)和67.0%(63/94)；在癌旁正常組織中的陽性率和高表達率分別為57.0%(49/86)、11.6%(10/86)。結(jié)腸癌組織中SRSF1蛋白表達與癌旁正常組織中相比，其在結(jié)腸癌組織中的表達顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

ABCD

表1 結(jié)腸癌、癌旁正常組織中SRSF1蛋白的表達

2.3 結(jié)腸癌中SRSF1蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系SRSF1蛋白高表達與患者臨床分期(χ2=4.835，P=0.028)密切相關(guān)，與患者性別(χ2=0.133，P=0.716)、年齡(χ2=1.178，P=0.278)、腫瘤大小(χ2=0.417，P=0.519)、分化程度(χ2=2.153，P=0.142)、原發(fā)腫瘤(T)分期(χ2=1.234，P=0.267)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=3.700，P=0.054)無關(guān)(表2)。在臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者中SRSF1蛋白的高表達率為80.6%(29/36)，顯著高于Ⅰ～Ⅱ期患者(58.6%，34/58，P<0.05，表2)。

表2 結(jié)腸癌中SRSF1蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 結(jié)腸癌中SRSF1蛋白表達與患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：SRSF1蛋白高表達結(jié)腸癌患者的總生存期顯著低于SRSF1蛋白低表達者(P=0.040，圖3A)。為進一步分析SRSF1蛋白表達對結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響，分別將結(jié)腸癌患者按分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、原發(fā)腫瘤(T)分期及腫瘤大小分成亞組進行生存分析。結(jié)果顯示：在pT為3～4及腫瘤最大徑>5 cm的亞組中，SRSF1蛋白高表達患者預(yù)后較差，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3B、C)。Cox單因素回歸分析顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR：3.638，95%CI=1.913～6.917，P<0.001)、高臨床腫瘤分期(HR：4.313，95%CI=2.228～8.348，P<0.001)及SRSF1蛋白高表達(HR：2.130，95%CI=1.010～4.492，P=0.047)是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立風險因素(圖4)。

圖3 結(jié)腸癌中SRSF1蛋白表達與患者生存期的關(guān)系：A.SRSF1表達水平與結(jié)腸癌患者總生存期的關(guān)系；B.SRSF1表達水平與pT為3～4的結(jié)腸癌患者生存期的關(guān)系；C.SRSF1表達水平與腫瘤最大徑>5 cm的結(jié)腸癌患者生存期的關(guān)系

圖4 Cox單因素回歸分析結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立風險因素：SRSF1蛋白高表達、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床腫瘤分期高是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立風險因素

3 討論

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷提高，人類的平均壽命得以延長，然而惡性腫瘤的發(fā)生率卻不斷攀升，其中結(jié)腸癌已經(jīng)成為影響人類生命健康的重要危險因素[11]。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)GLOBOCAN 2020數(shù)據(jù)顯示，全球約94萬人死于結(jié)腸癌[12]。由于結(jié)腸癌發(fā)病具有極強的隱匿性，早期診斷率較低，大多數(shù)患者在確診時已為中晚期[13]。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展受許多因子共同調(diào)控，這些調(diào)節(jié)因子可以調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因的表達，發(fā)揮促進或抑制腫瘤進展的作用[14]。剪接因子SRSF1是一種多功能蛋白質(zhì)，參與調(diào)節(jié)選擇性剪接與RNA代謝相關(guān)的過程。通常在癌癥中可以觀察到SRSF1表達的改變，包括選擇性剪接、mRNA穩(wěn)定性以及癌基因和腫瘤抑制因子的翻譯紊亂。由于SRSF1在腫瘤進展中的重要作用，其有望成為抗癌治療的靶點[15]。SRSF1位于染色體17q23上，該位點在某些腫瘤中通常被擴增且與不良預(yù)后相關(guān)[16-17]。Gout等[18]發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，非小細胞肺癌中這些剪接調(diào)節(jié)因子的整體過度表達與腺癌更具侵襲性的臨床病理特征相關(guān)。Gout等提供的證據(jù)表明，人肺腺癌細胞模型中SRSF1過表達導(dǎo)致p42/44MAPK和AKT信號通路的激活，軟瓊脂中菌落形成增加，上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，以及對卡鉑和紫杉醇的耐藥性，從而導(dǎo)致更具攻擊性的表型。

目前，已有研究顯示SRSF1的異常表達發(fā)生在不同的腫瘤中。祝興旺等[19]發(fā)現(xiàn)SRSF1在膀胱尿路上皮細胞癌中高表達，并且與腫瘤的初發(fā)和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。Du等[20]采用免疫組化染色法和qRT-PCR分析證實：與正常組織相比，腫瘤組織中SRSF1在蛋白和mRNA水平顯著均上調(diào)。Sheng等[21]通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)，SRSF1的相關(guān)基因主要富集于細胞周期、腫瘤相關(guān)信號通路以及結(jié)腸癌相關(guān)信號通路，但尚未對結(jié)腸癌組織中SRSF1蛋白的表達及其臨床意義進行深入分析。本組對94例結(jié)腸癌和86例癌旁正常組織進行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)SRSF1在結(jié)腸癌組織中顯著高表達，且其高表達與結(jié)腸癌患者臨床分期密切相關(guān)。以上結(jié)果說明SRSF1在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

有研究顯示，SRSF1蛋白是多種腫瘤的預(yù)后標志物。Liu等[22]通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，SRSF1細胞核表達較高的患者總生存率較低。盛俊秀等[23]收集60例肺癌患者的臨床數(shù)據(jù)，分析SRSF1在肺癌組織中的表達與生存率的相關(guān)性，結(jié)果表明SRSF1高表達患者的生存率明顯低于SRSF1低表達患者。本組結(jié)果顯示：隨著SRSF1表達水平越高，結(jié)腸癌患者的生存期越短、預(yù)后越差，提示SRSF1在結(jié)腸癌組織中的表達可作為潛在的腫瘤標志物，其對臨床診療中的預(yù)后判斷具有重要指導(dǎo)意義。此外，SRSF1作為結(jié)腸癌患者的預(yù)后獨立風險因素，或許可以通過降低SRSF1表達水平干預(yù)結(jié)腸癌的進展，促進患者預(yù)后。由于SRSF1在結(jié)腸癌中的分子作用機制尚未完全明確，還需積累更多病例進一步分析。