結(jié)直腸癌中Keap1、Nrf2、Gpx4表達(dá)與鐵死亡的相關(guān)性分析及臨床意義

路麗禎，何 雙，溫菲菲，崔忠澤，武 寒，徐 磊，吳淑華

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升且呈年輕化趨勢(shì)[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)長(zhǎng)期、多階段、多基因改變的過程，具有基因控制和多因素調(diào)節(jié)的復(fù)雜性[2]。新近研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡(ferroptosis)參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。鐵死亡是一種鐵依賴性、以細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧積累為特征的非凋亡性調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式，與多種腫瘤的發(fā)生和治療反應(yīng)有關(guān)[3-4]。研究顯示，在鐵死亡發(fā)生過程中核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)、Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelchike Ech-associated protein 1, Keap1)、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, Gpx4)等均發(fā)揮重要作用[5]。本文檢測(cè)結(jié)直腸癌中Keap1、Nrf2、Gpx4以及鐵死亡相關(guān)標(biāo)志因子GSH、MDA、PLOOH和組織鐵的表達(dá)，探討其與臨床病理特征的相關(guān)性及其臨床意義，為尋找新的腫瘤治療靶點(diǎn)及緩解耐藥提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 收集2016～2017年濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔的具有完整隨訪資料的T2高危及T3期結(jié)直腸癌患者106例，術(shù)后均采用FOLFOX化療方案。根據(jù)WHO(2019)消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，由兩位資深病理專家采用雙盲法閱片重新診斷。其中，男性56例，女性50例；年齡47～75歲，中位年齡65歲；腫瘤最大徑≥5 cm者44例，<5 cm者62例；組織學(xué)類型：管狀腺癌86例，黏液腺癌20例；分化程度：高分化13例，中分化82例，低分化11例；浸潤(rùn)深度：侵犯肌層34例，侵及或浸透外膜者72例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者86例。所選病例均為首次發(fā)現(xiàn)，術(shù)前均未行任何放、化療。同時(shí)，選取距病變邊緣>5 cm的正常結(jié)直腸黏膜組織作為對(duì)照。隨訪截至2021年12月或患者死亡，失訪者不予入組。

1.1.2試劑 鼠抗人Keap1(ab119403)、兔抗人Nrf2(ab62352)抗體均購自Abcam公司，兔抗人Gpx4(DF6701)抗體購自Affinity公司，羊抗兔/鼠二抗(ab5878)購自福州邁新公司，免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。Western blot實(shí)驗(yàn)試劑及MDA、GSH檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天公司，組織鐵檢測(cè)試劑購自Solarbio公司，PLOOH檢測(cè)試劑盒購自Cayman公司，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)試劑盒購自Takara公司，特異性引物序列由Takara公司合成。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。免疫組化采用EnVision法染色，3 μm厚連續(xù)切片，脫蠟至水，高壓熱修復(fù)抗原。3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，加入一抗Keap1(1 ∶100)、Nrf2(1 ∶100)、Gpx4(1 ∶100)于4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封固。用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.2.2Western blot法 將新鮮結(jié)直腸癌標(biāo)本采用液氮冷凍，冰上充分研磨新鮮組織后經(jīng)RIPA裂解，離心后取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度定量，樣品煮沸變性后上樣、電泳。TBST洗滌15 min×3次，5%的脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉2 h；加入一抗Keap1(1 ∶1 000)、Nrf2(1 ∶1 000)、Gpx4(1 ∶1 000)于4 ℃孵育過夜；TBST洗滌15 min×3次；二抗室溫孵育2 h；TBST洗滌15 min×3次，ECL曝光，用Quantity One軟件分析目的蛋白和β-actin的吸光度值，以目的蛋白與β-actin吸光度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3qRT-PCR法 按照Trizol試劑盒說明書提取組織RNA并檢測(cè)其濃度，在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s條件下將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)采用SYBR Green相對(duì)定量PCR法，按試劑盒說明書配置25 μL體系反應(yīng)液，在CFX96T RT-PCR Detection System C1 000上進(jìn)行擴(kuò)增(表1)。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s、GOTO 95 ℃ 5s、60 ℃ 30 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4PLOOH、組織鐵、MDA及GSH水平檢測(cè) 應(yīng)用組織鐵含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及正常腸黏膜組織中鐵離子的濃度，脂質(zhì)氧化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MDA的濃度，GSH試劑盒測(cè)量GSH水平，脂質(zhì)氫過氧化物試劑盒檢測(cè)PLOOH的濃度。計(jì)算平均光密度值，將數(shù)值大于平均值者判為陽性，低于或等于平均值者判為陰性。

1.3 判讀標(biāo)準(zhǔn)Keap1、Nrf2主要表達(dá)于細(xì)胞核或胞質(zhì)，Gpx4主要表達(dá)于胞膜或胞質(zhì)，在低倍鏡下觀察10個(gè)獨(dú)立視野，選取5個(gè)陽性細(xì)胞數(shù)最多的視野，采用Image Pro 6.0軟件進(jìn)行半定量分析，檢測(cè)視野內(nèi)陽性細(xì)胞的積分光密度值，取其平均值。將數(shù)值大于平均值者判為陽性，低于或等于平均值者判為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。運(yùn)用Graph pad 8.0及Image J進(jìn)行圖像和數(shù)據(jù)處理，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及矯正χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析及線性回歸分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，并以Log-rank法檢驗(yàn)；采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同腸組織中Keap1、Nrf2及Gpx4的表達(dá)106例結(jié)直腸癌中Keap1、Nrf2和Gpx4的陽性率分別為60.5%(64/106)、35.8%(38/106)、39.6%(41/106)，其平均光密度值分別為134.87±21.65、114.73±16.22、119.61±15.77，蛋白表達(dá)量均高于正常腸黏膜組織，差異有顯著性(P<0.05，圖1)。

ABCDEF

選取30例結(jié)直腸癌及相對(duì)應(yīng)的正常腸黏膜組織檢測(cè)Keap1、Nrf2及Gpx4蛋白和mRNA表達(dá)。Western blot顯示結(jié)直腸癌組織中Keap1、Nrf2及Gpx4的平均灰度值分別為289 667±4 252、562 761±29 819、1 426 764±68 772，其蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.78±0.14、0.70±0.13、0.63±0.10，均高于正常腸黏膜組織，差異有顯著性(P<0.05，圖2A、B)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中Keap1、Nrf2及Gpx4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，分別為0.80±0.018、0.68±0.019、0.52±0.016，均高于正常腸黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2C)。

圖2 Western blot、qRT-PCR檢測(cè)Keap1、Nrf2及Gpx4在正常腸黏膜及結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)：A.電泳圖；B.直方圖；C.Keap1、Nrf2、Gpx4 mRNA水平；N.正常腸黏膜組織；T.結(jié)直腸癌組織；**P<0.01，***P<0.000 5；****P<0.000 1

2.2 結(jié)直腸癌中Keap1與Nrf2、Gpx4表達(dá)的相關(guān)性分析應(yīng)用Image J進(jìn)行圖像處理，根據(jù)結(jié)直腸癌組織中Keap1、Nrf2、Gpx4表達(dá)的灰度值，采用線性回歸的對(duì)數(shù)趨勢(shì)線分析各因子表達(dá)間的相關(guān)性。本組結(jié)果顯示：結(jié)直腸癌組織中Keap1與Nrf2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(R2=0.188 1)，Nrf2與Gpx4的表達(dá)呈正相關(guān)(R2=0.252 7)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 線性回歸的對(duì)數(shù)趨勢(shì)線分析結(jié)直腸癌組織中Keap1、Nrf2、Gpx4表達(dá)的相關(guān)性：A.結(jié)直腸癌組織中Nrf2與Keap1表達(dá)的關(guān)系；B.結(jié)直腸癌組織中Gpx4與Nrf2表達(dá)的關(guān)系

2.3 結(jié)直腸癌中組織鐵、PLOOH、GSH和MDA的表達(dá)結(jié)直腸癌中組織鐵及PLOOH、GSH、MDA含量的平均光密度值均高于正常腸黏膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。線性回歸的對(duì)數(shù)趨勢(shì)線分析表明：結(jié)直腸癌組織中PLOOH與組織鐵、MDA的表達(dá)呈正相關(guān)，而與GSH的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05，圖4)。經(jīng)與平均光密度值比較判定，PLOOH、組織鐵、GSH、MDA在結(jié)直腸癌中的陽性率分別為59.4%(63/106)、58.5%(62/106)、37.7%(40/106)、61.3%(65/106)。

表2 結(jié)直腸癌和正常腸黏膜中組織鐵、GSH、MDA的平均光密度值

圖4 線性回歸的對(duì)數(shù)趨勢(shì)線分析結(jié)直腸癌組織中PLOOH與組織鐵、MDA、GSH含量的相關(guān)性：A.PLOOH與組織鐵表達(dá)的關(guān)系；B.PLOOH與MDA表達(dá)的關(guān)系；C.PLOOH與GSH表達(dá)的關(guān)系

2.4 結(jié)直腸癌中Keap1、Nrf2、Gpx4表達(dá)與鐵死亡的相關(guān)性分析PLOOH陽性組中Keap1表達(dá)高于陰性組，而Nrf2、Gpx4表達(dá)則低于陰性組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Spearman相關(guān)分析顯示，PLOOH與Keap1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.273)，而與Gpx4、Nrf2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.304，r=-0.330)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表3 結(jié)直腸癌中PLOOH與Keap1、Nrf2、Gpx4表達(dá)的相關(guān)性

2.5 生存分析本組106例結(jié)直腸癌患者中位生存時(shí)間為61個(gè)月，平均5年生存率為63.2%。Kaplan-Meier分析顯示：Keap1、Nrf2、Gpx4、PLOOH、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者的預(yù)后密切相關(guān)(P<0.05，圖5)。Cox回歸模型分析顯示：Keap1、Nrf2、Gpx4、PLOOH、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05，表4)。

表4 Cox多因素分析結(jié)直腸癌患者預(yù)后因素

圖5 結(jié)直腸癌患者的預(yù)后分析：A.Keap1表達(dá)與患者生存期的關(guān)系；B.Nrf2表達(dá)與患者生存期的關(guān)系；C.Gpx4表達(dá)與患者生存期的關(guān)系；D.PLOOH表達(dá)與患者生存期的關(guān)系；E.浸潤(rùn)深度與患者生存期的關(guān)系；F.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者生存期的關(guān)系

3 討論

鐵死亡是一種不同于細(xì)胞壞死、凋亡、自噬等其他形式的新型細(xì)胞程序性死亡方式。大量證據(jù)表明，鐵死亡與多種疾病有關(guān)，且多種實(shí)體腫瘤中均有鐵死亡激活現(xiàn)象[6]。隨著人們對(duì)鐵死亡認(rèn)識(shí)的不斷加深，鐵死亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的促進(jìn)和抑制腫瘤的雙重作用越來越引起人們的關(guān)注[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡后可刺激腫瘤生長(zhǎng)[8-9]；Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)，激活鐵死亡可以逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌對(duì)順鉑的耐藥性。由此可見，鐵死亡在不同的腫瘤中發(fā)揮作用不同，深入研究鐵死亡與腫瘤的關(guān)系具有重要臨床意義。

鐵死亡發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜，主要通過兩條途徑啟動(dòng)：內(nèi)在途徑是通過阻斷細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的激活而啟動(dòng)；外在途徑則通過抑制細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或通過激活多種鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來啟動(dòng)[7]。Gpx4和鐵死亡抑制蛋白1(FSP1)則構(gòu)成了細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)主要的鐵死亡防御系統(tǒng)[11]，其中最為經(jīng)典的是Gpx4介導(dǎo)的抑制鐵死亡途徑。Gpx4是唯一的用于脂質(zhì)過氧化物還原的抗氧化酶，其以還原性GSH作為電子供體，可以直接將PLOOH還原為羥基磷脂，使其失去過氧化物的活性，從而抑制鐵死亡[12-13]。由于Gpx4在細(xì)胞中充當(dāng)鐵死亡的中樞抑制因子[14]，因而其與腫瘤鐵死亡的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。Lu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用KLF2抑制Gpx4的表達(dá)激活鐵死亡，抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲。Song等[16]通過抑制Gpx4激活鐵死亡增強(qiáng)三陰型乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。在結(jié)直腸癌中同樣存在鐵死亡現(xiàn)象，Shen等[17]通過樹脂蟾蜍素導(dǎo)致Gpx4失活觸發(fā)鐵死亡，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。目前，結(jié)直腸癌中Gpx4與PLOOH的相關(guān)性及其調(diào)控尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：盡管在結(jié)直腸癌中Gpx4的表達(dá)普遍高于正常腸黏膜組織，但其表達(dá)卻不盡相同，并且與PLOOH的表達(dá)量及患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)；提示結(jié)直腸癌中Gpx4抑制鐵死亡可能與中和PLOOH有關(guān)，而高表達(dá)的Gpx4可通過抑制鐵死亡影響患者預(yù)后。因此，通過降低Gpx4的表達(dá)、激發(fā)腫瘤細(xì)胞鐵死亡，有可能成為抑制腫瘤、改善患者預(yù)后的新策略。結(jié)直腸癌中關(guān)于干預(yù)調(diào)控Gpx4的相關(guān)研究較少，尋找調(diào)控Gpx4的小分子結(jié)合位點(diǎn)，通過影響鐵死亡進(jìn)而抑制腫瘤，對(duì)于提高結(jié)直腸癌的療效具有重要價(jià)值。

轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是一種帽領(lǐng)(CNC)堿性區(qū)亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子，負(fù)責(zé)通過激活解毒酶和抗氧化蛋白的基因，促進(jìn)抗氧化蛋白表達(dá)來保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的負(fù)性調(diào)節(jié)因子[18]。已有研究表明，Nrf2是啟動(dòng)Gpx4轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子[19]。Nrf2的活性與Keap1密切相關(guān)[20]。Keap1是BTB Kelch蛋白家族的成員，富含624個(gè)氨基酸和半胱氨酸，監(jiān)測(cè)各種應(yīng)激刺激[21]。生理情況下，Nrf2錨定于細(xì)胞質(zhì)中與Keap1結(jié)合，Keap1介導(dǎo)Nrf2泛素化降解，使其在細(xì)胞內(nèi)的含量處于較低水平，其轉(zhuǎn)錄活性受抑[22]。Keap1與Nrf2結(jié)合不穩(wěn)定，當(dāng)受氧化應(yīng)激刺激時(shí)，Nrf2被釋放隨之活化、入核，執(zhí)行轉(zhuǎn)錄功能[23]。Zhao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，抑制Keap1可增加Nrf2的表達(dá)，進(jìn)而激活GSH轉(zhuǎn)移酶等調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白，緩解肝臟脂質(zhì)沉積。目前，結(jié)直腸癌中有關(guān)Keap1、Nrf2與Gpx4關(guān)系的研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Keap1與Nrf2、Gpx4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與PLOOH呈正相關(guān)；提示結(jié)直腸癌中鐵死亡與Keap1與Nrf2對(duì)Gpx4的調(diào)控有關(guān)。由此我們推測(cè)，結(jié)直腸癌中存在Keap1/Nrf2-Gpx4-鐵死亡途徑，在影響鐵死亡的過程中發(fā)揮重要作用。干預(yù)Keap1/Nrf2-Gpx4通路有可能成為促進(jìn)鐵死亡，進(jìn)而抑制腫瘤進(jìn)展的重要途經(jīng)。

鐵死亡是由脂質(zhì)過氧化作用引起的，其最終產(chǎn)物PLOOH是鐵死亡的執(zhí)行者[25]，當(dāng)PLOOH過度積累時(shí)發(fā)生鐵死亡，其被認(rèn)為是鐵死亡的標(biāo)志物。近年研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中存在鐵死亡現(xiàn)象[26]，但其在結(jié)直腸癌發(fā)展中的作用以及與鐵死亡關(guān)鍵分子變化規(guī)律的關(guān)系鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：結(jié)直腸癌組織中PLOOH、組織鐵、GSH及MDA的含量普遍高于正常腸黏膜組織，其中有59.4%的結(jié)直腸癌中PLOOH顯著高于平均值，同時(shí)伴鐵死亡相關(guān)因子的改變；提示部分結(jié)直腸癌中存在鐵死亡激活現(xiàn)象。我們推測(cè)腫瘤細(xì)胞處于高度活躍的增殖和代謝狀態(tài)，高鐵代謝及活躍的氧化應(yīng)激狀態(tài)在一定程度上維持了腫瘤旺盛的代謝需求。同時(shí)，為避免過多的過氧化物和鐵積累而觸發(fā)鐵死亡，腫瘤通過內(nèi)在的保護(hù)機(jī)制抑制鐵死亡，使腫瘤細(xì)胞免受損傷。因此，明確鐵死亡的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于利用鐵死亡抑制腫瘤，進(jìn)而尋找腫瘤治療的新途徑具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不僅Keap1、Nrf2、Gpx4、PLOOH與鐵死亡及患者的預(yù)后密切相關(guān)，而且是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，結(jié)直腸癌的良好預(yù)后與高水平的鐵死亡有關(guān)。由于本組病例術(shù)后均接受化療，進(jìn)一步提示其良好預(yù)后也可能與鐵死亡提高了化療敏感性有關(guān)。

綜上所述，Keap1、Nrf2、Gpx4、PLOOH以及鐵死亡相關(guān)因子在結(jié)直腸癌中呈不同程度的表達(dá)，由于其表達(dá)水平不同，患者的預(yù)后也不相同。抑制Keap1/Nrf2-Gpx4通路，進(jìn)而激活鐵死亡可能成為結(jié)直腸癌治療的新途徑。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)結(jié)直腸癌組織中Keap1、Nrf2、Gpx4表達(dá)和鐵死亡的相關(guān)性及其臨床意義進(jìn)行初步探討，還需積累更多病例進(jìn)一步分析，并同時(shí)深入開展分子機(jī)制研究，為利用鐵死亡抑制腫瘤發(fā)展、改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后提供新思路。