基于線粒體COI和D-loop序列的黑龍江流域蛇種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

胡宗云，楊培民，宋紅梅，牟希東

(1.遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省水生動(dòng)物病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧遼陽(yáng) 111000；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部休閑漁業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380)

線粒體DNA分子標(biāo)記是核基因組分子標(biāo)記的重要補(bǔ)充，已廣泛用于水產(chǎn)動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)育、生物地理學(xué)和保護(hù)生物學(xué)研究[15]。細(xì)胞色素氧化還原酶I(COI) 基因位于mtDNA的蛋白質(zhì)編碼區(qū)，進(jìn)化速率適中，在物種分子系統(tǒng)演化和分類中應(yīng)用較多；而D-loop序列屬于非編碼區(qū)，是mtDNA進(jìn)化速度最快的區(qū)域，常用于魚(yú)類進(jìn)化生物學(xué)和群體遺傳學(xué)研究。本研究測(cè)定、分析了黑龍江流域3個(gè)蛇群體的COI和D-loop序列，研究了其遺傳多樣性水平和群體間遺傳分化程度，以期為東北地區(qū)蛇種質(zhì)資源保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年4月至2021年5月，采用地籠網(wǎng)和掛網(wǎng)采集了3個(gè)群體88尾野生蛇樣本，其中撫遠(yuǎn)群體30尾(黑龍江水系，標(biāo)記為FY)、饒河群體29尾(烏蘇里江水系，標(biāo)記為RH)、榆樹(shù)群體29尾(松花江水系，標(biāo)記為YS)(表1)。樣本體長(zhǎng)為13～23 cm，體重為16～51 g。每尾剪取鰭條1～2 g，保存于95%酒精內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

表1 蛇樣品來(lái)源信息

Tab.1 The source information on samples of longnose gudgeon S.dabryi Bleeker

表1 蛇樣品來(lái)源信息

群體所屬河流取樣時(shí)間采集地經(jīng)緯度樣品數(shù)FY黑龍江2020年4月黑龍江省佳木斯市撫遠(yuǎn)市濃橋鎮(zhèn) N48°11'58.36″;E134°17'1.28”30RH烏蘇里江2020年5月黑龍江省雙鴨山市饒河縣八五九農(nóng)場(chǎng) N47°20'13.50″; E134°9'10.42″29YS松花江2021年5月吉林省長(zhǎng)春市榆樹(shù)市培英街道N44°50'13.35″ ;E126°37'30.50″29

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

取鰭條0.1g左右，利用天根生化科技有限公司的基因組提取試劑盒(DP304)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總DNA。COI序列擴(kuò)增引物為C-F(5′-TC AACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′)和C-R(5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′)[16]，D-loop序列擴(kuò)增引物為D-F(5′-CTAACTCCCAAAGC TAGAATTCT-3′)和D-R(5′-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3′)[17]，上述引物均由生工生物(上海)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL：含2.5 μL 10×PCR buffer(Mg2+plus，20 mmol/L)、2 μL dNTP mix(2.5 mmol/L)、0.25 μL Taq DNA polymerase(5 U/μL)、上下游引物各1 μL(10 μmol/L)、模板1 μL，雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s；最后73 ℃總延伸10 min。本研究所有的PCR反應(yīng)均在ABI 9700擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得目的條帶的產(chǎn)物于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物送至生工生物(上海)有限公司進(jìn)行純化，并由ABI 3730全自動(dòng)測(cè)序儀雙向測(cè)序，測(cè)序引物為上述PCR擴(kuò)增引物。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

測(cè)得的序列經(jīng)BioEdit編輯去除兩端低質(zhì)量的堿基，然后在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，留取與蛇線粒體基因組(KF534790.1、KF612272.1)COI和D-loop序列同源性99%以上的序列。運(yùn)用MEGA 6.0軟件包中的Alignment by ClustalW程序?qū)α羧〉男蛄羞M(jìn)行比對(duì)和剪切，并計(jì)算序列堿基組成、變異位點(diǎn)數(shù)和轉(zhuǎn)換與顛換值；采用鄰接法(Neighbor-Joining)，基于Kimura雙參數(shù)法(Kimura 2-parameter,K2p)模型構(gòu)建單倍型進(jìn)化樹(shù)。利用DnaSP 6.0軟件統(tǒng)計(jì)兩個(gè)基因的單倍型數(shù)、單倍型多樣性(h)、平均核苷酸差異數(shù)(K)及核苷酸多樣性(π)。應(yīng)用Arlequin 3.5 軟件進(jìn)行中性檢驗(yàn)，并用其分子方差分析(AMOVA)方法計(jì)算遺傳變異在群體內(nèi)和群體間的分布及群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)，1 000次重復(fù)隨機(jī)抽樣重排后進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05作為差異顯著性水平。利用Popart 1.7軟件構(gòu)建TCS單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 序列組成與遺傳多樣性分析

COI和D-loop序列經(jīng)比對(duì)剪齊后，分別獲得了長(zhǎng)度為582～583 bpCOI和834～835 bp D-loop的同源序列(表2)。COI同源序列中共檢測(cè)出15個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)12個(gè)，單突變位點(diǎn)3個(gè)，一共定義了13個(gè)單倍型；平均堿基組成：A=28.7%、T=23.2%、G=28.9%、C=19.2%，A+T含量(52%)大于G+C含量(48%)；平均轉(zhuǎn)換/顛換值為9.8。D-loop同源序列中共檢測(cè)到14個(gè)變異位點(diǎn)，包括9個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和5個(gè)單突變位點(diǎn)，定義單倍型15個(gè)，平均堿基組成：A=32%、T=31.9%、G=14.4%、C=21.8%,A+T含量(64%)大于G+C含量(36%)；平均轉(zhuǎn)換/顛換值為4.6。COI和D-loop堿基組成均呈較明顯的AT偏好。

3個(gè)群體COI基因片段總體單倍型多樣性、核苷酸多樣性和核苷酸差異數(shù)分別為0.377 3、0.000 9和0.510 4；各群體的單倍型多樣性指數(shù)為0.330 7～0.406 2，單倍型多樣性指數(shù)大小順序?yàn)閅S>RH>FY；核苷酸多樣性指數(shù)均為0.000 9(表2)。3個(gè)群體D-loop序列總體單倍型多樣性、核苷酸多樣性和核苷酸差異數(shù)分別為0.577 0、0.000 9和0.780 4；各群體的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)分別介于0.492 0～0.692 0和0.000 8～0.001 1；群體間D-loop單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)大小順序一致，均為YS>RH>FY。3個(gè)群體基于COI和D-loop序列的遺傳多樣性指數(shù)相近，單倍型多樣性、核苷酸多樣性指數(shù)處于較低水平，樣本間兩個(gè)序列的核苷酸差異較小。

表2 蛇3個(gè)群體COI 和D-loop基因的遺傳多樣性參數(shù)

Tab.2 Genetic diversity parameters of COI and D-loop genes in three populations of longnose gudgeon S.dabryi Bleeker

表2 蛇3個(gè)群體COI 和D-loop基因的遺傳多樣性參數(shù)

遺傳多樣性參數(shù)COIFYRHYS總體D-loopFYRHYS總體序列長(zhǎng)度582^583582^583582^583582^583835835834^835834^835變異位點(diǎn)數(shù)5771568914單一突變位點(diǎn)數(shù)46733565簡(jiǎn)約突變位點(diǎn)數(shù)110123339單倍型數(shù)67513791015單倍型多樣性0.330 70.404 30.406 20.377 30.492 00.545 00.692 00.577 0核苷酸多樣性0.000 90.000 90.000 90.000 90.000 80.001 00.001 10.000 9平均核苷酸差異數(shù)k0.500 00.511 80.520 00.510 40.627 00.831 00.872 00.780 4

2.2 遺傳距離和遺傳分化

用Kimura雙參數(shù)法(Kimura 2-parameter,K2p)計(jì)算3個(gè)群體間遺傳距離和遺傳分化指數(shù)如表3所示?；贑OI序列的分析結(jié)果顯示，3個(gè)群體的群體內(nèi)和群體間遺傳距離相等，均為0.000 9；3個(gè)群體的群體間遺傳分化指數(shù)-0.004 9～0.007 6。基于D-loop序列的計(jì)算結(jié)果表明，3個(gè)群體的群體內(nèi)遺傳距離為0.008 0～0.010 0，大小順序?yàn)镽H =YS >FY；群體間遺傳距離為0.000 9～0.001 0，YS與FY群體間遺傳距離和FY與RH群體間遺傳距離相等(0.000 9)，略小于YS與RH群體間的遺傳距離(0.001 0)；3個(gè)群體間的遺傳分化指數(shù)介于-0.002 8～0.011 4。3個(gè)群體基于COI和D-loop序列的遺傳距離、遺傳分化指數(shù)較小，預(yù)示3個(gè)群體間遺傳差異較小，遺傳分化不明顯。

表3 蛇遺傳分化指數(shù)(對(duì)角線上)、群體間遺傳距離(對(duì)角線下)和群體內(nèi)遺傳距離(對(duì)角線)

Tab.3 Pairwise Fst(above diagonal),genetic distance between(below diagonal) and within(diagonal) populations of longnose gudgeon S.dabryi Bleeker

表3 蛇遺傳分化指數(shù)(對(duì)角線上)、群體間遺傳距離(對(duì)角線下)和群體內(nèi)遺傳距離(對(duì)角線)

群體FYRHYSFY0.000 9-0.004 9-0.003 4COIRH0.000 90.000 90.007 6YS0.000 90.000 90.000 9FY0.000 80.011 4-0.002 8 D-loopRH0.000 90.001 00.006 8YS0.000 90.001 00.001 0

基于COI序列的分子方差分析(AMOVA)顯示，群體內(nèi)遺傳變異占遺傳變異的100.02%，遠(yuǎn)大于群體間遺傳變異(-0.02%)；基于D-loop序列AMOVA分析同樣顯示，群體內(nèi)的遺傳變異占比(99.49%)也遠(yuǎn)大于群體間遺傳變異(0.51%)?；贑OI和D-loop序列的分子方差分析表明，3個(gè)蛇群體整體遺傳變異幾乎全部來(lái)自群體內(nèi)，群體間遺傳變異占比極小(表4)。

表4 蛇3個(gè)群體COI和D-loop基因的AMOVA分析

Tab.4 The AMOVA analysis of COI and D-loop genes in three populations of longnose gudgeon S.dabryi Bleeker

表4 蛇3個(gè)群體COI和D-loop基因的AMOVA分析

變異來(lái)源COI自由度平方和方差組分方差比例/%D-loop自由度平方和方差組分方差比例/%群體間20.508-0.000 05-0.0220.8910.002 00.51群體內(nèi)8520.9270.255 21100.028531.8850.388 8599.49總體8721.4354.751 98732.7760.390 85固定指數(shù)-0.000 2(P=0.479 0)0.005 1(P=0.277 6)

2.3 單倍型聚類分析與分布

88個(gè)COI序列共檢測(cè)到13個(gè)單倍型(圖1)，Hap1和Hap3為3個(gè)群體共享單倍型，在所測(cè)樣本中出現(xiàn)頻率分別為79.55%和4.55%，其中Hap1在每個(gè)群體占比均最高，屬于優(yōu)勢(shì)單倍型；Hap9為FY和YS的共享單倍型，其余單倍型為3個(gè)群體特有的單倍型，F(xiàn)Y、RH和YS群體特有單倍型的數(shù)量分別為3、5和2。88個(gè)D-Loop序列共定義了15個(gè)單倍型(圖2)，Hap2、Hap7和Hap9為3個(gè)群體共享單倍型，其中Hap2數(shù)量達(dá)到58個(gè)，占樣本總數(shù)的65.91%，屬于優(yōu)勢(shì)單倍型；Hap11、Hap12為FY與YS的共享單倍型，Hpa1、Hap8為RH與FY的共享單倍型，Hap6為FY和RH的共享單倍型，其余單倍型為各群體特有單倍型，特有單倍型數(shù)量1-3個(gè)不等。

圖1 蛇3個(gè)群體COI基因單倍型的NJ樹(shù)及在各群體中的分布

2.4 種群歷史動(dòng)態(tài)

圖4 蛇COI(A)和D-loop序列的核苷酸錯(cuò)配分布圖

表5 基于COI和D-loop序列的Tajima′D和檢驗(yàn)

3 討論

3.1 蛇群體遺傳多樣性

單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)是評(píng)價(jià)種群遺傳多樣性的重要指標(biāo)，也是衡量物種或種群線粒體DNA變異程度的重要指標(biāo)。本研究3個(gè)蛇群體基于D-Loop序列的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.492 0～0.692 0、0.000 8～0.001 1，低于嘉陵江蛇種群(h：0.875～0.940；π：0.010 0～0.264 0)[4]，也低于近緣種斑點(diǎn)蛇(S.punctatus)(h：0.703～0.960；π：0.021 7～0.048 2)[4]和長(zhǎng)鰭吻(Rhinogobioventralis))(h：0.640～0.837；π:0.001 0～0.0.01 5)[18]，這些差異除與物種的遺傳特性有關(guān)外，還與樣本量大小、序列長(zhǎng)短、分析序列的位置有關(guān)。本研究88個(gè)蛇樣本基于COI序列的遺傳多樣性指數(shù)(h =0.377 3；π=0.000 9)略小于D-loop(h=0.577 0；π=0.000 9)，這可能與COI和D-loop的進(jìn)化速率不同有關(guān)：COI和D-loop分別位于線粒體的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，COI受到的選擇壓力大于D-loop，進(jìn)化速度相對(duì)較慢，發(fā)生變異的概率相對(duì)低一些，相似的結(jié)果在銀鯧(Pampusargenteus)[19]、強(qiáng)彈涂魚(yú)(Periophthalmuscantonensis)[20]、鯉(Cyprinuscarpio)[21]等魚(yú)類上亦有報(bào)道。根據(jù)GRANT等[22]設(shè)定h=0.5，π=0.005閾值，本研究3個(gè)蛇群體基于COI和D-loop序列的遺傳多樣性指數(shù)類型分別屬于低h低π型、高h(yuǎn)低π型，考慮到核苷酸多樣性在一定程度上比單倍型多樣性更能反映群體的遺傳多樣性[22]， 3個(gè)蛇群體遺傳多樣性處于較低水平，應(yīng)加強(qiáng)該區(qū)域蛇的種質(zhì)資源保護(hù)。

3.2 蛇群體遺傳分化

群體間遺傳距離、遺傳分化指數(shù)與群體分化程度為線性關(guān)系，是衡量群體分化程度的重要指標(biāo)[23]。3個(gè)蛇群體基于兩個(gè)序列的群體間遺傳距離與群體內(nèi)的遺傳距離均較小，大小范圍相互重疊且處于一個(gè)水平，群體間遺傳距離遠(yuǎn)低于0.05種群這一標(biāo)準(zhǔn)[24]，這說(shuō)明3個(gè)群體間遺傳差異較小。群體間的遺傳分化指數(shù)小于0.05，表明群體間遺傳分化極小[25]。AMOVA分析表明，群體內(nèi)的變異遠(yuǎn)大于群體間變異，3個(gè)蛇群體總的遺傳變異主要來(lái)自群體內(nèi)，預(yù)示3個(gè)蛇群體親緣關(guān)系較近。此外，本研究基于COI和D-loop序列的單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和網(wǎng)絡(luò)圖顯示，3個(gè)蛇群體共享單倍型較多，特有單倍型交錯(cuò)地聚集在一起或分布在祖先單倍型周圍，沒(méi)有形成明顯的地理譜系，也印證了群體間遺傳分化較小的觀點(diǎn)。上述結(jié)果可能與蛇棲息環(huán)境和繁殖習(xí)性有關(guān)：本研究中 3個(gè)群體的采樣點(diǎn)分布于黑龍江水系的支流，河流間處于連通狀態(tài)，采樣點(diǎn)之間未形成嚴(yán)格意義上的地理隔離；而蛇產(chǎn)漂流性卵，魚(yú)卵或魚(yú)苗隨水流進(jìn)行擴(kuò)散[1]，利于群體擴(kuò)散。換言之，敞開(kāi)性水域和較強(qiáng)的擴(kuò)散能力促進(jìn)了3個(gè)蛇群體的基因交流，使群體間遺傳分化較小。相似的結(jié)果在蛇長(zhǎng)江種群[26]、長(zhǎng)鰭吻(R.ventralis)[18]、圓筒吻(Rhinogobiocylindricus)[27]等亞科魚(yú)類上亦有報(bào)道。鑒于3個(gè)群體遺傳距離較小、遺傳分化水平較低這一現(xiàn)狀，漁業(yè)資源管理實(shí)踐中可以將其設(shè)為一個(gè)管理單元(MU)。

3.3 蛇群體歷史動(dòng)態(tài)