敲除TRIF基因?qū)LR3介導(dǎo)胰島β細胞損傷的影響及機制研究*

張子月,朱祎婧,鐘大鵬

1.中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院干部病房，四川成都 610083；2.四川省成都新華醫(yī)院藥學(xué)部，四川成都 610081；3.中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川成都 610083

糖尿病是一組由遺傳和環(huán)境相互作用所致的代謝性疾病，據(jù)最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國18歲以上人群糖尿病患病率為11.2%[1]，已成為威脅人類健康的主要公共衛(wèi)生問題之一。目前，糖尿病的發(fā)病機制尚不完全清楚，有研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體家族(TLRs)所介導(dǎo)的非特異性炎癥反應(yīng)可以導(dǎo)致胰島β細胞功能的損傷[2-3]。本研究團隊在前期研究中亦證實，激活胰島β細胞的Toll樣受體3(TLR3)會通過TRIF信號通路釋放核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)，損傷胰島β細胞，抑制細胞的增殖和促進細胞的凋亡[4]。由此推測，在TLR3所介導(dǎo)的胰島β細胞免疫損傷機制中TRIF信號通路至關(guān)重要。因此，本研究中將敲除TRIF基因，阻斷TRIF信號通路，觀察能否減輕胰島β細胞的免疫損傷程度并探討相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 小鼠胰島素瘤β細胞株NIT-1。

1.1.2藥物及試劑 Poly(I：C)購自美國Sigma公司，DMEM、胎牛血清購自美國Hyclone公司，F(xiàn)-12K購自美國Gibco公司，Triton X-100購自美國Sigma公司，Rnase A solution購自上海生工生物有限公司，Light Cycler?480 SYBR Green Ⅰ Master購自瑞士Roche公司，RIPA lysis buffer、BCA蛋白定量檢測試劑盒、細胞膜蛋白與細胞質(zhì)蛋白提取試劑盒購自碧云天生物公司，HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，Membrane nuclear and cytoplasmic protein Extraction Kit購自上海生工生物有限公司，CCND1、CASP3購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，TRIF購自英國Abcam公司，NF-κB購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1敲除TRIF基因細胞株的制備及鑒定 利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備敲除TRIF基因的細胞株，首先設(shè)計引物(表1)，用BbsⅠ限制性內(nèi)切酶酶切pX330載體，構(gòu)建pX330-sgRNA-1和pX330-sgRNA-2敲減載體，再通過細胞轉(zhuǎn)染、DNA提取、PCR擴增、單克隆鋪板、純合細胞株篩選，最終得到敲除TRIF基因的細胞株。

表1 引物設(shè)計

1.2.2細胞培養(yǎng)及分組 以敲除TRIF基因的NIT-1細胞株為研究對象，用DMEM培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，當(dāng)細胞處于增殖期比例達到80%～90%時進行實驗分組，分為空白對照組和實驗組。實驗組根據(jù)給予不同水平的TLR3特異性激動劑病毒聚肌胞(PIC)刺激48 h，分為30 μg/mL PIC組、60 μg/mL PIC組、90 μg/mL PIC組。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測細胞周期 取敲除TRIF基因的細胞株，吸去原培養(yǎng)液，經(jīng)胰酶消化、離心(1 000 r/min，5 min)、計數(shù)后，以2×105個/孔(12孔板)進行鋪板，在5% CO2、37 ℃條件下過夜培養(yǎng)。次日細胞再經(jīng)沉淀、離心 (1 500 r/min，10 min)后，加入200 μL DNA染液(PI溶液20 μg+ Triton X-100 1 μL+RNase A 溶液 0.2 mg+PBS定容到1 mL)，孵育(室溫)15 min后檢測細胞。

1.2.4Western blot檢測NF-κB、CyclinD1及Caspase-3蛋白表達 取敲除TRIF基因的細胞株，經(jīng)RIPA裂解后離心(12 000 r/min，10 min)，取上清液，采用BCA法測定NF-κB、CyclinD1及Caspase-3蛋白水平。具體檢測方法嚴格按照檢測試劑盒說明書進行操作。

1.2.5PCR檢測NF-κB的mRNA表達 取敲除TRIF基因的細胞株，提取RNA后加入反應(yīng)混合液(42 ℃反應(yīng)2 min，然后置于4 ℃保持)，最后嚴格按照RT-PCR試劑盒說明書檢測NF-κB的mRNA表達量。參照GenBank設(shè)計引物。

2 結(jié) 果

2.1敲除TRIF基因細胞株鑒定 利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在小鼠NIT-1細胞株中敲除mouse TRIF基因，通過篩選，得到敲除TRIF基因的單克隆細胞株，見圖1。

注：通過篩選，在3-4、6-4、9-5、6-7號孔板中成功制備敲除TRIF基因的細胞株，1-1和8-3號孔板為正常細胞株對照。結(jié)果顯示 3-4、6-4、9-5、6-7在1 000 bp左右沒有條帶，500 bp左右條帶明顯，證明這4株細胞TRIF基因敲除徹底。圖1 制備敲除TRIF基因的細胞株及鑒定

2.2細胞周期 與空白對照組相比，PIC刺激后細胞停留在G0/G1期的比例明顯增加(P<0.05)，并呈濃度依賴性(P<0.05)，而細胞在S期和G2/M期的比例出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.05)，細胞增殖受抑制。見表2。

表2 刺激敲除TRIF基因細胞株的TLR3對細胞增殖的影響

2.3CyclinD1、CASP3及NF-κB蛋白表達 Western blot檢測各組CyclinD1、CASP3及NF-κB表達情況。敲除TRIF基因后，刺激細胞TLR3，周期蛋白CyclinD1表達下降，凋亡蛋白CASP3及細胞因子NF-κB表達增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并呈濃度依賴性(P<0.05)。見表3。

表3 刺激敲除TRIF基因細胞株的TLR3對CyclinD1、 CASP3及NF-κB蛋白表達的影響

2.4NF-κB mRNA表達 敲除TRIF基因后，與空白對照組相比，刺激細胞TLR3，仍能上調(diào)NF-κB mRNA表達(P<0.05)，并呈濃度依賴性(P<0.05)。與正常細胞株相比較，敲除TRIF基因細胞株的NF-κB mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，均可上調(diào)NF-κB mRNA表達。見表4。

表4 分別刺激敲除TRIF基因細胞株和正常細胞株的 TLR3對NF-κB mRNA表達的影響

3 討 論

糖尿病防治中，如何保護及改善胰島β細胞功能一直是研究的熱點，近年來免疫炎癥學(xué)說備受關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)天然免疫系統(tǒng)的激活可導(dǎo)致胰島β細胞損傷，破壞胰島β細胞增殖、凋亡的動態(tài)平衡，最終導(dǎo)致血糖的波動及糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[5-7]。

本研究團隊在前期研究中已經(jīng)相繼證實了小鼠胰島β細胞表面有TLR3受體的表達，并刺激TLR3受體后，可激活NF-κB、IL-6、TNF-α等細胞因子，抑制細胞的增殖，促進其細胞凋亡[8-9]。有研究表明，TLR3的激活依賴于TRIF相關(guān)接頭分子(TRAM)信號通路[10]。本研究團隊在前期研究中同樣發(fā)現(xiàn)激活NIT-1細胞的TLR3可上調(diào)TRIF mRNA表達，抑制細胞增殖，提示NIT-1細胞的損傷可能與TLR3-TRIF-NF-κB炎癥信號通路有關(guān)，并且TRIF可能是整個信號通路中的關(guān)鍵因子。因此，在本研究中敲除小鼠胰島β細胞TRIF基因后，再次刺激細胞TLR3，觀察能否改善細胞的增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠胰島β細胞的TRIF基因后，刺激細胞TLR3，同樣能刺激NF-κB的表達，促使細胞凋亡，抑制細胞增殖，也并不能保護胰島β細胞。研究人員推測有以下原因：其一，天然免疫系統(tǒng)是一個極其復(fù)雜的系統(tǒng)，目前已知的TLRs就多達12種，同樣已知的信號通路除激活TLR3的TRIF非MyD88依賴信號通路外，還有MyD88依賴信號通路[11-13]，其中TRIF介導(dǎo)的非MyD88依賴信號通路又可分為激活干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)及腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 (TRAF6)等多種NF-κB活化途徑[12]，由此可見，本研究只阻斷其中一條信號通路，并不能完全阻斷炎癥因子的激活。其二，細胞周期同樣受到復(fù)雜分子機制調(diào)控，除常見的周期蛋白CyclinD、凋亡蛋白外[14-16]，還受其他因素調(diào)控，例如激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路，同樣能導(dǎo)致胰島β細胞凋亡，抑制細胞增殖[17-19]。

綜上所述，敲除TRIF基因后刺激TLR3，并不能保護胰島β細胞。但該研究為后續(xù)進一步深入研究胰島素β細胞TLR3信號通路奠定了基礎(chǔ)，同時也為尋找新的抑制靶點提供了新的思路。