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    植物組織培養(yǎng)中抗污染培養(yǎng)基新配方初探

    2023-03-27 22:00:39楊文雅
    科技資訊 2023年4期
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)基植物

    楊文雅

    關(guān)鍵詞: 植物 組培 抗污染配方 培養(yǎng)基 紅掌組培苗

    現(xiàn)階段,植物組織培養(yǎng)技術(shù)(tissue culture)屬于實操性非常強的生物技術(shù),能夠分離一個或數(shù)個細胞或外植體。伴隨現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,植物組織培養(yǎng)技術(shù)為相關(guān)科學(xué)實驗提供可靠證據(jù),成為規(guī)?;?、產(chǎn)量化生產(chǎn)種苗的廣泛性方法,其憑借可人為控制、生長周期短、繁育率高和可自動化控制管理等優(yōu)勢,已經(jīng)獲得迅速普及、應(yīng)用[1]。植物組織培養(yǎng)技術(shù)關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)在于控制污染率,而雜菌污染屬于組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基普遍存在污染問題。使用酒精和次氯酸溶液進行外植體消毒的過程,不僅消耗時間較長,同時操作流程較為繁瑣,存在較大的雜菌污染風(fēng)險。這種方法容易導(dǎo)致植物組織培養(yǎng)過程出現(xiàn)疏漏,造成培養(yǎng)基被污染,這些污染的來源主要是真菌、細菌、雜菌。一旦雜菌和雜菌孢子污染植物組織培養(yǎng)基,約5 天后,在培養(yǎng)基表面和培養(yǎng)基內(nèi)部會大量出現(xiàn)雜菌繁殖,同時還會分泌出具備酸性的有害物質(zhì),對培養(yǎng)的植物進行大批污染和毒害,造成植物培苗的死亡。有鑒于此,一旦在植物組織培養(yǎng)實驗中發(fā)生外植體雜菌污染,必須立即銷毀,控制雜菌污染率。

    雜菌污染抑制了植物組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛推廣和利用,對農(nóng)業(yè)的發(fā)展造成了直接影響。因此,對植物組織培養(yǎng)基實驗的細菌、雜菌抑制研究逐漸被提上日程,是未來研究的必然趨勢。該實驗前提是節(jié)約實驗室資源,以紅掌組織培養(yǎng)為實驗材料,添加銀粒子到培養(yǎng)基中,觀察培養(yǎng)基的生長情況以及抗雜菌污染效果,并對其中的組織實驗變化情況加以詳細的記錄與分析對比,獲得實際的、完整的組織實驗成果研究數(shù)據(jù)。以此探索一種成本低廉可靠、可以高效抵抗雜菌污染的抗污染配方及方法[2]。

    1 實驗背景

    以往的植物組織培養(yǎng)實驗過程中,不同的植物自身帶有一定的細菌,這些細菌多種多樣,所以為植物進行殺菌工作十分繁瑣與困難。如果沒有徹底地對植物攜帶的細菌進行殺除,就會將其帶進植物的培養(yǎng)基以內(nèi),導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)生雜菌的污染問題。這些不穩(wěn)定因素,均會導(dǎo)致培養(yǎng)基污染的產(chǎn)生,會使實驗研究的植物組織培養(yǎng)基實驗數(shù)據(jù)造成偏差,導(dǎo)致實驗無法進行[3]。

    隨著時代的變化,對植物培養(yǎng)基中的雜菌進行控制的科學(xué)技術(shù)手段也在不斷更新。通過實驗與探索,發(fā)現(xiàn)植物組織開放式的培養(yǎng)方式讓植物可以在開放式的載體中生長與變化,有效抑制雜菌產(chǎn)生。與此同時,可以對植物組織的培養(yǎng)工作加以簡單化轉(zhuǎn)換,從而降低實驗難度,節(jié)約植物組織實驗的經(jīng)濟消耗成本,促進相關(guān)實驗成果的發(fā)展。此外,如果將有明顯控制作用的新配方抗污染制劑加入,將促組織培養(yǎng)具備更高培養(yǎng)價值。

    2 材料與方法

    2. 1 實驗材料

    2.1.1 實驗試劑

    利用不同的實驗試劑,如硝酸銀AgNO3、果糖、葡萄糖等。

    2.1.2 實驗儀器

    透射電子顯微鏡Transmission Electron Microscope,日立H-7650。

    2.1.3 外植體材料及其生物學(xué)特性

    紅掌組培苗及種子。紅掌(Anthurium andraeanumLinden)別名火鶴花、紅鵝掌、安祖花和紅燭等。紅掌以獨特的風(fēng)姿給人以熱情、進取之感,屬于熱帶花卉名種,品種繁多,可以作為切花栽培,也可以作為盆花栽植。在規(guī)?;?、產(chǎn)量化生產(chǎn)種苗的過程中,通常采用植物組織培養(yǎng)方式進行快速繁育,植物組織培養(yǎng)紅掌組培苗及種子是否能夠成功,是紅掌規(guī)?;a(chǎn)量化育苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。紅掌原產(chǎn)于熱帶雨林區(qū),喜歡溫暖、潮濕的環(huán)境,生長對于溫度的要求較為嚴苛,通常適宜在20 ℃~30 ℃的環(huán)境存活,喜歡陽光但嚴格禁止被陽光直射,防止葉片、花苞片因為高溫產(chǎn)生灼傷、褪色,失去光澤,葉片生長緩慢。

    2.1.4 實驗時間

    2020 年3 月至2020 年12 月進行。

    2. 2 制備植物組織培養(yǎng)基

    2.2.1 納米銀溶膠的制備

    在溫度40 ℃以下時,硝酸銀溶液濃度分別達到1.0×10?4、1.0×10?3、1.0×10?2時,分別在25 mL 硝酸銀溶液中加入5 mL 氨水溶液,同時將三口瓶分別置放于磁力攪拌器上進行均速攪拌,在溶液充分混合之后,分別再加入10 mL 的果糖溶液、5 mL 的葡萄糖溶液,靜置1 min 后,滴入0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液,然后進行混合調(diào)節(jié),調(diào)節(jié)要達到整個溶液的酸堿度為9 左右的pH值,具體反應(yīng)需要滿足1.5 h。

    2.2.2 納米銀粒子的表征

    就納米銀粒子的表征而言,可以對細菌進行充分的抑制與消殺,并且不需要任何的化學(xué)或其他輔助成分的幫助。可以用于人們?nèi)粘I钪械募毦麣?,對人們的健康防護具有一定的作用。在使用納米銀粒子的過程當(dāng)中,只需要微量的粒子,就可以產(chǎn)生十分有效的殺菌作用,對細菌的生長、繁衍與轉(zhuǎn)變具有較大的抑制能力。有鑒于此,人們開始研究將其加入到植物組織的培養(yǎng)基實驗之中,是否能對細菌的生產(chǎn)產(chǎn)生較大的抑制影響,增加培養(yǎng)基的抗菌能力,從而對在植物組織培養(yǎng)基的實驗產(chǎn)生一定的推動作用,抑制雜菌生成。

    該文實驗中主要利用果糖和葡萄糖為還原試劑,實驗在室溫下,水相體系中還原硝酸銀溶液之后得到納米銀溶膠。在實驗進行的過程中可以發(fā)現(xiàn),實驗試劑顏色、粒子的大小、粒子的散落位置情況都出現(xiàn)了不同的變化。并在此過程之中,研究綜合性、整體性的變化與影響,從而給出結(jié)論。同使用有機溶劑作還原試劑的實驗相對比而言,在該實驗中使用果糖和葡萄糖更加具備環(huán)保屬性,綠色健康,而且果糖和葡萄糖可以同時作為植物組織培養(yǎng)基的能量來源物質(zhì),所制備出來的納米銀粒子可以添加到B5 培養(yǎng)基之中,在實驗中可以測試該復(fù)合培養(yǎng)基的具體抗菌性能[4]。

    2.2.3 納米銀粒子復(fù)合B5 培養(yǎng)基制備

    把3.02 g 的B5 干粉培養(yǎng)基溶解在100 mL 的去離子水之中,加熱到完全溶解,然后向去離子水中加入10 mL 的納米銀粒子的溶膠,再倒入潔凈的表面器皿之中。

    2.2.4 最佳抑制雜菌配方對紅掌組培苗及種子生長的影響

    為了驗證最佳抑制雜菌配方對紅掌組培苗及種子生長的影響,配制含有該配比配方培養(yǎng)基,同時配比更高濃度梯度的培養(yǎng)基,以不含納米銀粒子抑菌制劑的培養(yǎng)基為空白對照。

    (1)采集與消毒。

    采集紅掌組培苗根、莖、葉、花、芽及種子的子葉,也可以利用花粉粒和花藥,培養(yǎng)無病毒苗采用莖尖分生組織部分,長度約為0.1 mm。將紅掌組培苗莖尖分生組織部分用流水沖洗干凈,用蒸餾水沖洗后,使用無菌紗布將水分吸取干凈,使用消毒刀片將紅掌組培苗莖尖分生組織部分切成小塊。在無菌實驗環(huán)境中,將紅掌組培苗莖尖分生組織部分放置進入70% 酒精或次氯酸溶液中進行浸泡。30~60 s 后將紅掌組培苗莖尖分生組織部分移動至裝有漂白粉的飽和液中,或置放在汞水中消毒10 min,最后在取出時,使用無菌水進行沖洗,沖洗3~4 次后晾干備用。

    (2)外植體制備。

    使用消毒后的無菌刀、剪子和鑷子等,在無菌實驗環(huán)境下進行嫩枝外皮、種皮胚乳等的剝除。在外植體制備過程中,嚴格禁止實驗人員觸碰實驗用紅掌組培苗及種子。

    (3)接種與培養(yǎng)。

    在無菌實驗環(huán)境下,將已經(jīng)切好的外植體接種在培養(yǎng)基上,每排培養(yǎng)基點播72 個外植體,每次處理重復(fù)8 次。成功接種后,使用無菌膠帶對培養(yǎng)皿進行封口,設(shè)置培養(yǎng)基處24 ℃溫度,濕度達到55%,要求每天記錄紅掌植株的生長情況與污染情況。外植體增值是植物組織培養(yǎng)關(guān)鍵,為擴大增值系數(shù)需要進行繼代培養(yǎng)。

    2. 3 抗雜菌的性能測試

    將納米銀溶膠添加到B5 培養(yǎng)基之中,然后把紅掌外植體放置在復(fù)合培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),伴隨培養(yǎng)基表面出現(xiàn)雜菌,將已經(jīng)被污染的紅掌外植體組織置于1 500~2 000 lx 光照強度下,每天光照14 h,溫度保持在25 ℃左右[5]。

    3 結(jié)果與分析

    3. 1 納米銀粒子的主要表征

    就納米銀粒子的主要表征而言,可以將納米銀粒子應(yīng)用在植物組織的培養(yǎng)基實驗當(dāng)中,在進行實驗反應(yīng)的具體過程之中可以發(fā)現(xiàn),伴隨著實驗反應(yīng)的產(chǎn)生,納米銀粒子在制備反應(yīng)開始前和開始后,其實驗反應(yīng)開始出現(xiàn)不同的改變,其顏色的呈現(xiàn)最終變化成為了棕黃顏色:

    這主要是因為納米銀粒子的表面等離子體產(chǎn)生了共振引起。

    不同的硝酸銀濃度下制備納米銀粒子時,制備出的納米銀粒子表現(xiàn)為并不規(guī)則的球狀形狀,且保持較好的分散性。一旦硝酸銀的濃度達到:1.0×10?4 mol/L、1.0×10?3 mol/L、1.0×10?2 mol/L;制備出的納米銀粒子對應(yīng)的平均粒徑可以分別達到48 nm、55 nm、66 nm,將實驗之中的數(shù)據(jù)信息參數(shù)加以詳細的記錄,并在實驗完畢后,將這3 種濃度的硝酸銀濃度進行對比,發(fā)現(xiàn)當(dāng)硝酸銀的濃度達到1.0×10?2 mol/L 時所制備出的納米銀粒子出現(xiàn)了塊狀銀顆粒,同時塊狀的銀顆粒的粒徑分布范圍比較寬,平均的寬度分布在45~98 nm 之間:

    3. 2 具體抗菌性能測試

    將紅掌處于兩種不同參數(shù)的B5 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)狀態(tài)進行數(shù)據(jù)比較之后可以了解到,在進行實驗的第5 天,沒有添加納米銀溶膠的實驗培養(yǎng)基之中,紅掌表面和瓊脂進行接觸的周圍存在大量的霉菌和雜菌,同時,培養(yǎng)基表面也大量產(chǎn)生霉菌和雜菌;與這樣的結(jié)果有所不同,復(fù)合納米銀粒子B5 培養(yǎng)基沒有發(fā)生新型的細菌變化和生長,而當(dāng)紅掌進行實驗過后,其紅掌的實驗結(jié)果顯示發(fā)生少數(shù)的表皮變化。實驗數(shù)據(jù)表明,納米銀粒子可以對不同的細菌產(chǎn)生較強的、十分有效果的抑制與抵抗作用,具有明顯的控制雜菌和霉變的效果[6],其可以運用在植物組織培養(yǎng)基實驗中,推動相關(guān)實驗得以順利進行。

    受雜菌污染干擾,將造成紅掌組培苗及種子的組織培養(yǎng)質(zhì)量迅速下降,而現(xiàn)有抗污染技術(shù)過于強調(diào)無菌操作環(huán)境,雖然能在一定程度上減少污染,但是成本相對較高。在實驗的準備過程中,需要采取綠色、無毒的操作方法通過科學(xué)的實驗配比方法,對其按照穩(wěn)定流程進行實驗,并將實驗數(shù)據(jù)加以詳細的數(shù)據(jù)信息記錄,并在實驗完畢后,對其進行準確的分析[7]。

    在該次實驗中,實驗主要應(yīng)用的原料為硝酸銀,以果糖和葡萄糖作為還原試劑。一旦硝酸銀的濃度分別達到1.0×10?4 mol/L、1.0×10?3 mol/L、1.0×10?2 mol/L時,所制備出的納米銀粒子平均粒徑分別處于48 nm、55 nm、66 nm,鑒于此,將納米銀粒子科學(xué)添加到B5 植物培養(yǎng)基中,可以得到復(fù)合培養(yǎng)基,具有顯著的抗雜菌性能[8-9]。

    4 結(jié)語

    在進行植物組織培養(yǎng)的實驗過程之中,探索對環(huán)境沒有污染,并且成本較低的優(yōu)良解決方法。該實驗進行了一種植物組織培養(yǎng)基抗雜菌污染的配方配比制備方法,需要對其原有的液體進行一定的還原處理工作,再將處理過后得到的新型粒子加入到內(nèi)含植物組織的載體,也就是培養(yǎng)基之中,得到一種對雜菌性質(zhì)具備一定抗體能力的復(fù)合培養(yǎng)基,利用現(xiàn)有的科學(xué)技術(shù)手段,對培養(yǎng)基內(nèi)的污染因子加以管理和控制。該次實驗主要添加蔗糖作為能源物質(zhì),全部實驗過程無污染、安全綠色,并且具有成本小、經(jīng)濟適用的特點,屬于一種可以進行全面推廣應(yīng)用的納米銀粒子制備配比配方,能夠有效抑制真菌、細菌、雜菌生長,實驗的制備方法簡單可靠、容易操作,對植物無害,制備出的納米銀粒子粒徑非常均勻,而且顆粒的大小合適,同時狀態(tài)分布均勻。該實驗中的納米銀溶膠和紅掌組培苗及種子培養(yǎng)基的相容性明顯適合,該實驗有利于優(yōu)化紅掌組培苗及種子滅菌保存效果,添加了納米銀溶膠的培養(yǎng)基具備較好的控制雜菌效果。

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