PYCR1在肝癌中的表達(dá)特點(diǎn)及其臨床價(jià)值

張麗紅 胡良峰 楊 燁 王宏斌

肝癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)報(bào)道，肝癌病死率位列惡性腫瘤的第3位，嚴(yán)重威脅著人們的健康[1]。肝癌早期癥狀不明顯，且缺乏有效的早期診斷指標(biāo)，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，失去了最佳治療機(jī)會(huì)。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是改善患者生活質(zhì)量，降低病死率的關(guān)鍵[2]。目前肝癌的診斷主要依靠影像學(xué)檢查和血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物，但是影像學(xué)檢查往往難以準(zhǔn)確地判斷微小病灶，而目前臨床常用的甲胎蛋白、甲胎蛋白異質(zhì)體等肝癌標(biāo)志物敏感度均較低，很難準(zhǔn)確篩選出早期肝癌[3, 4]。因此，探討肝癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，篩選出新的肝癌標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)用于肝癌的診斷和治療，具有重要的科學(xué)意義。PYCR1是吡咯啉-5-羧酸還原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase, PYCR)的3種同工酶之一，是一種廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的管家基因[5]。PYCR1在骨骼、脂肪和結(jié)締組織的發(fā)育過(guò)程中起重要作用，基因突變會(huì)導(dǎo)致皮膚及骨骼系統(tǒng)異常，引起人類皮膚松弛癥[6]。近年來(lái)研究證實(shí)，PYCR1與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[7, 8]。本研究主要檢測(cè)PYCR1在肝癌組織及患者外周血中的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)PYCR1對(duì)肝癌的臨床價(jià)值。

材料與方法

1.臨床標(biāo)本：收集筆者醫(yī)院2019年6月～2021年12月經(jīng)病理診斷為肝癌的患者腫瘤組織41例(其中肝細(xì)胞肝癌29例、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌10例、混合型肝癌2例)、正常肝組織25例、血清標(biāo)本58例(其中肝細(xì)胞肝癌39例、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌16例、混合型肝癌3例)，所有患者均為原發(fā)性肝癌(轉(zhuǎn)移性肝癌患者不納入)；另收集同期肝良性疾病患者血清34例(其中包括肝血管瘤16例、肝膿腫8例、增生性病變7例、肝硬化3例)。組織標(biāo)本采用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚切片，4℃保存；外周血標(biāo)本3ml入真空采血管，3500r/min離心5min，收集血清，分裝后于-20℃保存。本研究經(jīng)紹興市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：2019-K-Y-189-01)，并由患者和(或)監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

2.主要試劑：兔抗PYCR1單克隆抗體(ab279385)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；PYCR1蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒(MM-60192H1)購(gòu)自江蘇酶免公司。

3.生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析PYCR1在肝癌組織中的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系：利用GEPIA在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析PYCR1在肝癌與正常肝組織中的表達(dá)情況，以正常組織為對(duì)照，選擇差異表達(dá)倍數(shù)>2，且P<0.001的結(jié)果。利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析肝癌組織中PYCR1表達(dá)水平及其與患者總生存期的關(guān)系，以PYCR1表達(dá)的中位數(shù)為cut-off值，對(duì)肝癌患者PYCR1表達(dá)水平與總生存期的關(guān)系進(jìn)行生存分析。

4.免疫組化SP染色方法檢測(cè)肝癌及正常肝組織PYCR1：使用PYCR1單克隆抗體試劑盒。3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波加熱抗原修復(fù)，10%正常羊血清孵育，滴加一抗，4℃冰箱中過(guò)夜，PBS緩沖液振蕩清洗后分別滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)封片。結(jié)果判定：在高倍鏡下每張切片選擇5個(gè)有代表性的視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，共計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，PYCR1定位于胞質(zhì)、胞膜或胞核，出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞比例≥5%判斷為陽(yáng)性，<5%判斷為陰性。

5.ELISA法檢測(cè)血清PYCR1蛋白：將標(biāo)準(zhǔn)樣品和患者樣品(1∶5稀釋)各50μl加入96孔板，37℃溫育30min，洗板，加入酶標(biāo)試劑50μl，37℃溫育30min，洗板，依次加入顯色劑A、B各50μl，37℃避光顯色10min，每孔加終止液50μl，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔吸光度(A)值。每塊板均以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品濃度與實(shí)際所測(cè)的A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，將樣品的A值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，進(jìn)行板間差異校正。

6. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)[n(%)]表示，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(Q1,Q3)]表示，組間差異比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果：PYCR1在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于正常肝組織(P<0.05)，見(jiàn)圖1A；PYCR1高表達(dá)的肝癌患者預(yù)后較低表達(dá)患者差(P=0.0085)，見(jiàn)圖1B。以上結(jié)果提示PYCR1在肝癌組織中表達(dá)升高，且其表達(dá)水平與患者預(yù)后相關(guān)。

圖1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果A.PYCR1在肝癌組織中的表達(dá)高于正常肝組織；B.PYCR1高表達(dá)的肝癌患者預(yù)后較差(P=0.0085)

2.PYCR1在肝癌組織中的表達(dá)：本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)41例肝癌組織和25例正常肝組織PYCR1表達(dá)情況，PYCR1在肝癌組織中的表達(dá)主要呈胞質(zhì)分布，偶見(jiàn)胞膜、胞核分布，陽(yáng)性信號(hào)為黃色或棕黃色顆粒(圖2中A、B)；PYCR1在絕大多數(shù)正常肝組織中不表達(dá)(圖2中C、D)。采用χ2檢驗(yàn)比較組間表達(dá)差異，見(jiàn)表1。由表1可以得出，肝癌組織PYCR1表達(dá)(25/41，61.0%)明顯高于正常肝組織(1/25，4.0%)(χ2=21.116，P<0.001)；PYCR1的表達(dá)水平與患者年齡、性別無(wú)關(guān)(P均>0.05)。

圖2 免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PYCR1在肝癌組織及正常肝組織中的表達(dá)A、B.PYCR1在肝癌組織中表達(dá)；C、D.PYCR1在正常肝組織中不表達(dá)。A、C.×100；B、D.×400

表1 肝癌及正常肝組織PYCR1的表達(dá)情況比較

3.PYCR1蛋白在肝癌患者外周血中的表達(dá)：本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)58例肝癌和34例肝良性疾病患者血清PYCR1水平，兩組人群PYCR1濃度資料均不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較組間各指標(biāo)差異，肝癌組PYCR1蛋白水平明顯高于肝良性疾病組(P=0.001，表2)；肝癌患者PYCR1蛋白水平與年齡、性別無(wú)關(guān)(P值分別為0.851、0.837)。繪制血清PYCR1蛋白診斷肝癌的ROC曲線，計(jì)算曲線下面積(AUC)，選擇約登(Youden)指數(shù)最大處為最佳篩查陽(yáng)性界值(cut-off值)，得到PYCR1診斷肝癌的cut-off值為102.1pg/ml，AUC為0.711，敏感度為79.3%，特異性為64.7%，詳見(jiàn)圖3。

表2 肝癌與肝良性疾病患者血清PYCR1水平比較[M(Q1,Q3)]

圖3 PYCR1診斷肝癌的ROC曲線

討 論

吡咯啉-5-羧酸還原酶是一種線粒體酶，廣泛存在于人體各種組織細(xì)胞中，在脯氨酸生物合成的過(guò)程中具有重要作用。人類PYCR存在3種同工酶，即PYCR1、PYCR2和PYCRL，其中PYCR1位于染色體17q25.3，含319個(gè)氨基酸，是一種多聚蛋白復(fù)合物，有活性的PYCR1是由5個(gè)相同的二聚體形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這5個(gè)二聚體形成一個(gè)圓形凹槽，是輔因子和底物的結(jié)合位點(diǎn)[9]。PYCR1基因缺陷可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞中的線粒體膜電位發(fā)生改變，使線粒體網(wǎng)絡(luò)破壞及氧化過(guò)程中的凋亡率增加。PYCR1是脯氨酸代謝中的關(guān)鍵酶之一，能在NAD(P)H的作用下，催化吡咯啉-5-羧酸(pyrroline-5-carboxylate, P5C)轉(zhuǎn)化為脯氨酸，并可逆向轉(zhuǎn)化哌啶-6-羧酸生成哌可酸[10]。

脯氨酸是細(xì)胞微環(huán)境中最豐富的氨基酸之一，它在細(xì)胞的應(yīng)激保護(hù)和維持氧化還原平衡中起著關(guān)鍵作用[11，12]。此外，從細(xì)胞外基質(zhì)的膠原降解而來(lái)的脯氨酸，也提供ATP以滿足細(xì)胞的能量需求，在缺氧或低血糖的情況下，脯氨酸的利用有助于ATP的生成，還可以促進(jìn)活性氧的生成而引起細(xì)胞自噬。因此，脯氨酸的合成和代謝對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義[13，14]。脯氨酸主要通過(guò)其代謝過(guò)程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展：脯氨酸脫氫酶/脯氨酸氧化酶(PRODH/POX)和PYCR1。其中PRODH/POX具有誘導(dǎo)抑癌基因p53的作用，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而起到抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用[15，16]。PYCR1作為脯氨酸代謝的另一關(guān)鍵酶，主要通過(guò)生物合成脯氨酸進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，是原癌基因c-Myc的靶點(diǎn)，具有抗細(xì)胞凋亡和抗氧化功能[17，18]。近年來(lái)，PYCR1與惡性腫瘤形成的關(guān)系逐漸受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注，已有研究者在直腸癌、胃癌等惡性腫瘤的組織中檢測(cè)到了高水平的PYCR1，并證實(shí)PYCR1的高表達(dá)有助于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，但PYCR1在肝癌中的研究較少[19～22]。

筆者所在的課題組利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，PYCR1在肝癌組織中的表達(dá)高于正常肝組織，且PYCR1高表達(dá)的患者預(yù)后較低表達(dá)患者差，提示PYCR1在肝癌的臨床診斷和預(yù)后判斷中可能具有一定的作用。筆者所在的課題組進(jìn)一步收集了肝癌患者腫瘤組織和外周血標(biāo)本進(jìn)行PYCR1表達(dá)水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肝癌組織PYCR1表達(dá)高于正常肝組織，且其表達(dá)水平與患者年齡、性別無(wú)關(guān)；肝癌患者血清PYCR1水平高于肝良性疾病患者，其表達(dá)水平與患者年齡、性別無(wú)關(guān)。以上結(jié)果與生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致。為了明確PYCR1對(duì)肝癌的診斷價(jià)值，筆者繪制了ROC曲線，發(fā)現(xiàn)PYCR1診斷肝癌的cut-off值為102.1pg/ml，AUC為0.711，敏感度為79.3%，特異性為64.7%。雖然ROC曲線結(jié)果顯示，PYCR1診斷肝癌的特異性不高，但其敏感度較高，對(duì)肝癌的診斷具有一定輔助診斷價(jià)值，尤其是針對(duì)AFP陰性的肝癌，更具價(jià)值。但是本實(shí)驗(yàn)納入病例較少，無(wú)法進(jìn)一步分析PYCR1的表達(dá)水平與肝癌病理分型、臨床分期等臨床病例資料的關(guān)系，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行相關(guān)研究。

綜上所述，肝癌組織及外周血PYCR1表達(dá)水平對(duì)肝癌具有一定的臨床價(jià)值，可以作為潛在的肝癌診斷及預(yù)后標(biāo)志物，血清PYCR1具有采樣方便、損傷小等優(yōu)點(diǎn)，更具臨床價(jià)值。隨著檢測(cè)方法學(xué)的改進(jìn)及標(biāo)準(zhǔn)化，PYCR1有望大規(guī)模應(yīng)用于臨床肝癌的診療，然而PYCR1在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的具體作用及機(jī)制尚不清楚，值得更深入研究。