小鼠頸部異位心臟移植模型的初步探索

劉一緯 楊鵬杰 魏起友

器官移植已成為治療終末期器官衰竭最有效的方法[1]。2022年1月7日，馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院成功完成了一例豬心異種移植[2]。自1973年Corry等[3]首次建立小鼠心臟移植模型以來，如今常用的移植模型分為兩種，即腹部心臟移植和頸部心臟移植[4～6]。頸部解剖結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于日后觀察供體心臟活動(dòng)狀態(tài)；頸部創(chuàng)口小，全身反應(yīng)輕，相比之下腹腔移植創(chuàng)傷大、時(shí)間長(zhǎng)、感染概率高、腸管粘連可能性大[7]。在頸部移植模型中，袖套法(cuff技術(shù))更適用于初學(xué)者，降低了手術(shù)難度，有效減少供心缺血時(shí)間[8]。因此，筆者對(duì)小鼠頸部心臟移植模型進(jìn)行探索，總結(jié)建模經(jīng)驗(yàn)，分析要點(diǎn)難點(diǎn)，為研究移植免疫學(xué)打下基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料：選用近交系雄性C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠，8～12周齡，體質(zhì)量為20～22g，購(gòu)自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，環(huán)境符合SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蒙)2020-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蒙)2020-0003。單人雙目體視顯微鏡購(gòu)自深圳奧斯微光學(xué)儀器有限公司；顯微手術(shù)器械購(gòu)自上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠；4-0非吸收縫線購(gòu)自揚(yáng)州富達(dá)醫(yī)療器械有限公司；10-0帶針縫合線購(gòu)自寧波醫(yī)用縫針有限公司；0.3mm×0.6mm、0.6mm×0.8mm四氟毛細(xì)管購(gòu)自上?？÷⊙b飾工程有限公司；0.4mm×0.5mm、0.8mm×1.0mm硬塑料毛細(xì)管購(gòu)自南通伊諾精密塑膠導(dǎo)管有限公司；水合氯醛、HE染液試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；肝素鈉注射液購(gòu)自天津生物化學(xué)制藥有限公司；4%多聚甲醛固定液購(gòu)自福州白鯨生物科技有限公司。

2.供體手術(shù)：小鼠麻醉(采用5%水合氯醛0.07ml/10g腹腔注射)、備皮、固定、消毒、鋪單，沿腹正中線剪開皮膚、肌肉，推開腸管找出下腔靜脈。下腔靜脈注射預(yù)冷(4℃)的肝素鹽水(100U/ml)1ml，等待1min后小鼠全身血液肝素化，剪斷下腔靜脈和腹主動(dòng)脈放血。向上剪開膈肌，沿兩側(cè)腋中線剪斷肋骨，成倒“U”型打開胸腔暴露心臟，撕開心包膜使用冰鹽水(4℃ 0.9%氯化鈉溶液)滴注小鼠心臟，心跳逐漸緩慢至?xí)和！７蛛x主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈并于遠(yuǎn)心端分叉處剪斷，使用10-0縫合線將上下腔靜脈、肺靜脈、左心耳集束結(jié)扎后剪去相應(yīng)血管及組織，取下供心放置于4℃ 0.9%氯化鈉溶液中保存。

受體手術(shù)：小鼠麻醉(采用5%水合氯醛0.07ml/10g腹腔注射)、備皮、固定、消毒、鋪單，沿右鎖骨中線向上、下方切開頸部皮膚，上至小鼠下頜骨，下至鎖骨下0.5cm，暴露下頜腺并摘除。分離脂肪組織，游離頸外靜脈，于頸外靜脈遠(yuǎn)心端分叉處用10-0縫合線結(jié)扎，近心端分離至鎖骨上方，用10-0縫合線打活結(jié)備用。去除胸鎖乳突肌，游離頸總動(dòng)脈于遠(yuǎn)心端分叉處用10-0縫合線結(jié)扎，近心端使用微型動(dòng)脈夾夾閉血流。分別于遠(yuǎn)心端結(jié)扎處剪斷頸動(dòng)、靜脈，將血管斷端從備好的套管內(nèi)部穿過，張開血管壁向外翻轉(zhuǎn)使其完全包裹套管，成功后用10-0縫合線結(jié)扎固定，使用肝素鹽水(100U/ml)沖洗血管套管端口預(yù)防血栓形成(圖1)。

圖1 血管套管外翻過程A.血管穿過套管；B.血管壁外翻；C.血管套管結(jié)扎

連接與術(shù)后：在受體頸動(dòng)、靜脈血管套管下方放置10-0縫合線。將供心移至受體頸部，張開供心肺動(dòng)脈斷端完全包裹受體頸靜脈套管端口，使血管套管進(jìn)入肺動(dòng)脈內(nèi)，用預(yù)埋的10-0縫合線結(jié)扎肺動(dòng)脈和頸靜脈完成靜脈連接。動(dòng)脈連接方法與靜脈相同，供心主動(dòng)脈包裹受體頸動(dòng)脈端口完成套入，結(jié)扎連接。血管連接完成后，松開頸靜脈根部活結(jié)，打開頸動(dòng)脈根部微型動(dòng)脈夾，血液流通，供心滴注37℃ 0.9%氯化鈉溶液復(fù)溫，30～60s后可見供心復(fù)跳并逐漸恢復(fù)正常節(jié)律，用4-0縫線縫合頸部皮膚，傷口常規(guī)消毒。若術(shù)中出血過多，可皮下注射37℃ 0.9%氯化鈉溶液0.5～1.0ml補(bǔ)液，術(shù)后將小鼠放置于潔凈鼠籠內(nèi)，25℃恒溫復(fù)蘇， 30～60min后小鼠蘇醒，正常飲水飼料喂養(yǎng)，每日觀察供心活動(dòng)情況(心率、節(jié)律、強(qiáng)度)，詳見圖2。

圖2 心臟移植過程A.供體心臟；B.剪斷頸靜脈；C.夾閉頸動(dòng)脈；D.外翻結(jié)扎；E.心臟連接；F.恢復(fù)跳動(dòng)

3.失敗原因記錄：第1階段為訓(xùn)練階段，指從零開始(無顯微外科基礎(chǔ)、無實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立經(jīng)驗(yàn))至第1例模型建立成功(術(shù)后供心復(fù)跳，小鼠活動(dòng)正常，持續(xù)3天以上視為手術(shù)成功，3天內(nèi)供心停跳或小鼠死亡視為手術(shù)失敗)，統(tǒng)計(jì)每例小鼠死亡失敗原因。

4.分組處理：第2階段將小鼠按品系隨機(jī)分為同系組和模型組，同系組：C57BL/6小鼠作為供、受體；模型組：BALB/c小鼠為供體，C57BL/6小鼠為受體。每組完成18對(duì)小鼠模型，其中隨機(jī)選取9只統(tǒng)計(jì)供心存活時(shí)間，余下9只術(shù)后第7日取移植物組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后供心復(fù)跳順利，心率、節(jié)律、強(qiáng)度正常，小鼠精神狀態(tài)良好、行為活動(dòng)正常，持續(xù)3天以上視為手術(shù)成功，3天內(nèi)供心停跳或小鼠死亡視為手術(shù)失敗，不計(jì)入統(tǒng)計(jì)。

5.心臟移植物存活時(shí)間：從術(shù)后第1天開始計(jì)算移植物存活時(shí)間，每天經(jīng)小鼠頸部觸摸移植心臟跳動(dòng)情況，心臟停跳視為移植物死亡，記錄存活時(shí)間(n=9)。

6.標(biāo)本取材及HE染色：術(shù)后第7天取出供心，置于4%多聚甲醛固定液中，固定48h后按HE染液試劑盒說明書進(jìn)行移植物心肌組織染色、封片。根據(jù)國(guó)際心肺移植學(xué)會(huì)(ISHLT)2004年修訂版的排斥反應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)(表1)，光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄移植心臟急性排斥反應(yīng)組織病理學(xué)分級(jí)(n=9)[9]。

表1 移植排斥反應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)(ISHLT2004年修訂版)

結(jié) 果

1.失敗原因比較：訓(xùn)練階段共進(jìn)行119次小鼠心臟移植手術(shù)，失敗原因按出現(xiàn)前后順序依次為：麻醉意外(14例，11.76%)、解剖結(jié)構(gòu)不熟和顯微外科水平低(總結(jié)為手術(shù)操作不當(dāng)，23例，19.33%)、血管套管外翻失敗(36例，30.25%)、供心結(jié)扎口出血(17例，14.29%)、靜脈連接處淤血(15例，12.61%)、環(huán)境溫度過低(3例，2.52%)、術(shù)后感染(9例，7.56%)和其他原因(2例，1.68%),詳見表2。

2.移植物生存期比較：生存期觀察以30天為終止，同系組9只全部存活，模型組存活時(shí)間(7.44±1.01天)較同系組明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，詳見圖3。

圖3 生存曲線

3.移植物排斥反應(yīng)程度比較：供心組織HE 染色后在 200 倍光學(xué)顯微鏡下觀察可見同系組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少，病理分級(jí)多為0～1級(jí)(0級(jí)6只，1級(jí)3只)；模型組呈現(xiàn)中到重度急性排斥反應(yīng)現(xiàn)象，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，間質(zhì)水腫、出血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，病理分級(jí)多為3～4級(jí)(3級(jí)4只，4級(jí)5只)，其排斥反應(yīng)病理分級(jí)明顯高于同系組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，詳見圖4。

圖4 供心排斥反應(yīng)組織病理學(xué)檢查(HE染色，×200)A、B.同系組，兩圖為同一組中不同個(gè)體的病理表現(xiàn)；C、D.模型組,兩圖為同一組中不同個(gè)體的病理表現(xiàn)

討 論

本實(shí)驗(yàn)成功建立了小鼠頸部異位心臟移植模型，血管套管外翻是建模的重點(diǎn)難點(diǎn)，特別是頸動(dòng)、靜脈血管的外翻操作[10]。因外翻失敗造成小鼠死亡36例，發(fā)生率為30.25%，是引起實(shí)驗(yàn)失敗發(fā)生率最高的原因。當(dāng)下套管常采用靜脈留置針導(dǎo)管制作而成，靜脈留置針導(dǎo)管外壁光滑，在血管內(nèi)可自由滑動(dòng)；導(dǎo)管材質(zhì)軟，可隨血管進(jìn)行一定程度曲折且更注重導(dǎo)管外徑，無內(nèi)徑數(shù)據(jù)[11,12]。頸部血管套管外翻時(shí)因套管未固定，始終處于搖擺狀態(tài)造成外翻困難，若使用靜脈留置針導(dǎo)管，無詳細(xì)內(nèi)徑數(shù)據(jù)不利于實(shí)驗(yàn)研究，導(dǎo)管外壁光滑外翻后易滑動(dòng)脫出，材質(zhì)軟易曲折，更增加了外翻時(shí)晃動(dòng)、彎折概率?？紤]以上原因?qū)嶒?yàn)初期選取質(zhì)地更硬的四氟毛細(xì)管，根據(jù)血管粗細(xì)動(dòng)脈選用0.3mm×0.6mm套管，靜脈選用0.6mm×1.0mm套管。循環(huán)血經(jīng)供心流出后，動(dòng)脈血變?yōu)殪o脈血，血壓較低，若套管內(nèi)徑不足易造成靜脈阻塞淤血，供心右心淤血復(fù)跳失敗，此原因造成小鼠死亡15例，發(fā)生率為12.61%。此外實(shí)驗(yàn)前期采用微型動(dòng)脈夾夾閉靜脈血流，由于動(dòng)脈夾張力過大，松開后靜脈內(nèi)壁粘連無法復(fù)張，進(jìn)一步導(dǎo)致靜脈淤血，遂后期采用10-0縫合線打活結(jié)的方式阻斷靜脈血流，同時(shí)換用硬塑料毛細(xì)管，0.8mm×1.0mm套管作為靜脈管，0.4mm×0.5mm套管作為動(dòng)脈管，改善了連接后靜脈淤血的情況。更換套管后，外徑變小動(dòng)脈血管外翻時(shí)間縮短，也使得供心連接時(shí)動(dòng)脈端口更容易套入主動(dòng)脈內(nèi)，節(jié)省了供心連接時(shí)間。因此在保持套管內(nèi)徑的基礎(chǔ)上，選用外徑小、管壁薄但材質(zhì)偏硬的套管，可以使血管外翻更加簡(jiǎn)單、快速，避免靜脈淤血，提高成功率，節(jié)省手術(shù)時(shí)間。

操作過程中可能因解剖不熟練造成下頜腺及胸鎖乳突肌出血、供心主肺動(dòng)脈撕裂、受體頸動(dòng)靜脈破損等情況，此階段因手術(shù)操作不當(dāng)致死23例，占總數(shù)的19.33%，是造成手術(shù)失敗的第2大原因。顯微外科技術(shù)(鏡下操作感、分離、打結(jié)、帶線、外翻等)需要花費(fèi)時(shí)間練習(xí)，特別是對(duì)于沒有顯微外科基礎(chǔ)的初學(xué)者，會(huì)造成更高的死亡率和失敗率。開始可以先在鏡下無實(shí)物練習(xí)，適應(yīng)操作感后用紗布練習(xí)縫合打結(jié)等基礎(chǔ)操作，最后再使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行手術(shù)。小鼠解剖結(jié)構(gòu)獨(dú)特，右下頜腺血管位于腺體右上方，可自左下鈍性分離后去除；頸靜脈分支較多、胸鎖乳突肌深部血管及供心主肺動(dòng)脈根部分離等均是易造成失敗的原因。

供心的摘取方式分為集束結(jié)扎和單獨(dú)結(jié)扎兩類[13]。集束結(jié)扎是指供心切斷主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈后，一次性結(jié)扎除這兩根血管之外的其余血管，優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單，摘取速度快，減少供心缺血時(shí)間，利于復(fù)跳和長(zhǎng)期存活，但缺點(diǎn)在于此法易形成出血。集束結(jié)扎一次結(jié)扎較多血管，若結(jié)扎后剪血管時(shí)殘端過短，易造成結(jié)扎口內(nèi)有血管、組織脫出，使連接成功后供心出血。單獨(dú)結(jié)扎是指分別結(jié)扎上、下腔靜脈和左、右肺靜脈，優(yōu)點(diǎn)在于解決了集束結(jié)扎易出血的問題，減少失敗概率，但缺點(diǎn)在于操作時(shí)間較長(zhǎng)、供心缺血時(shí)間延長(zhǎng)。本研究采用集束結(jié)扎法，訓(xùn)練階段因出血致死17例，發(fā)生率14.29%，注意結(jié)扎時(shí)打4～5個(gè)結(jié)，同時(shí)結(jié)扎左心耳，且務(wù)必在剪斷多余血管時(shí)保留較長(zhǎng)殘端，可避免供心出血的情況發(fā)生，此法使得供心恢復(fù)血流后復(fù)跳良好，未出現(xiàn)因冷缺血時(shí)間過長(zhǎng)而導(dǎo)致的復(fù)跳失敗。另外供體手術(shù)的充分肝素化(預(yù)防血栓形成)和整個(gè)過程供心的低溫狀態(tài)也是需要注意的細(xì)節(jié)。

文獻(xiàn)中大多數(shù)動(dòng)物模型均采用水合氯醛麻醉，本實(shí)驗(yàn)麻醉劑量為5%水合氯醛(0.07ml/10g)腹腔注射[14,15]。從效果來看，麻醉致死14例(11.76%)，主要原因在于小鼠個(gè)體對(duì)水合氯醛的耐受性差異較大，麻醉藥物劑量依據(jù)小鼠體重而無法做到個(gè)體化給藥，造成麻醉過深或過淺的結(jié)果。同時(shí)動(dòng)物麻醉后，靜脈血管擴(kuò)張回流減少、心率血壓下降、體溫降低，在手術(shù)過程中及術(shù)后應(yīng)注意保溫，溫度過低可能造成小鼠術(shù)中死亡和術(shù)后無法蘇醒，環(huán)境溫度過低造成3例死亡，發(fā)生率為2.52%，注意保溫即可避免此類事件的發(fā)生。把握麻藥劑量酌情給藥，手術(shù)環(huán)境及術(shù)后保溫是實(shí)施麻醉時(shí)應(yīng)注意的關(guān)鍵點(diǎn)。同時(shí)尋找、研發(fā)一種新型的，具有更好麻醉效能和更少不良反應(yīng)的麻醉藥物，具有重要意義。

術(shù)后感染造成9例小鼠死亡，發(fā)生率為7.56%。在小鼠頸部心臟移植模型中，手術(shù)部位較清潔，繼發(fā)感染情況較少，進(jìn)行無菌手術(shù)后無需使用抗生素干預(yù)，嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，提升手術(shù)間無菌環(huán)境即可。使用袖套法進(jìn)行心臟移植，術(shù)后無血栓生成、無血管漏血滲血等情況發(fā)生，避免了吻合法在吻合口附近易繼發(fā)血栓影響術(shù)后血運(yùn)通暢及血管斷端對(duì)合不良或針距偏大漏血等影響手術(shù)成功率的風(fēng)險(xiǎn)[16]。

第2階段進(jìn)行分組對(duì)照研究，同系組移植物長(zhǎng)期存活，無明顯排斥情況，模型組移植物存活時(shí)間短，排斥情況嚴(yán)重，其病理表現(xiàn)多為心肌細(xì)胞損傷、血管炎，間質(zhì)水腫、出血，伴大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，是影響移植物早期存活的主要原因。在同種異體移植情況下，急性排斥反應(yīng)的發(fā)生難以避免，且多發(fā)生于早期，移植術(shù)后5～7天即有明顯現(xiàn)象[17,18]。本實(shí)驗(yàn)建立的小鼠頸部異位心臟移植模型，能夠產(chǎn)生明顯的急性排斥反應(yīng)，為研究移植免疫學(xué)打下基礎(chǔ)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠頸部異位心臟移植模型進(jìn)行探索，分析建模過程中的要點(diǎn)、難點(diǎn)，總結(jié)各類致死原因并提出改進(jìn)策略，為后人學(xué)習(xí)提供了完整的思路與經(jīng)驗(yàn)。頸部袖套法無需血管吻合，降低手術(shù)難度縮短手術(shù)時(shí)間，是一種特別適合無基礎(chǔ)初學(xué)者的術(shù)式，其中0.4mm×0.5mm、0.8mm×1.0mm套管的使用值得推廣與學(xué)習(xí)。