硫酸吲哚酚通過芳香烴受體介導p53的表達

李 靜 張夢珂 米娜娃爾·玉努斯 葉力夏提·阿德力別克

硫酸吲哚酚(indophenol sulfate，IS)是腎臟終末期產(chǎn)生的一種尿毒癥毒素。它與白蛋白的結合率超過90%，在血液透析時很難被濾過[1]。因此大量IS在體內(nèi)蓄積，對人體產(chǎn)生危害。目前，越來越多的研究證實慢性腎臟病終末期腎衰竭尿毒癥毒素與心血管疾病存在相關性[2～4]。其中，IS是研究最廣泛的尿毒癥毒素，它的相對分子質(zhì)量是251.3，主要來源于色氨酸代謝。色氨酸在腸道細菌的作用下生成吲哚，吲哚被吸收入血后經(jīng)門靜脈進入肝臟，在肝臟中經(jīng)過羥化、硫酸化以后生成IS[5]。p53是一種調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的序列特異性DNA結合蛋白，p53的功能集中在其促進細胞周期停滯和細胞凋亡的能力上[6，7]。

血管平滑肌細胞的凋亡與心血管疾病的發(fā)病機制密切相關，抑制血管平滑肌細胞凋亡是減緩心血管疾病尤其是動脈粥樣硬化發(fā)展的有效預防策略[8]。有研究表明，p53水平與亞臨床動脈粥樣硬化患者的頸動脈內(nèi)膜中層厚度呈正相關[9]。芳香烴受體(aromatic hydrocarbon receptor，AHR)是IS的天然配體，硫酸吲哚酚通過AHR的轉(zhuǎn)運進入細胞核內(nèi)[10]。筆者采用IS刺激人主動脈血管平滑肌細胞，并給與AHR的特異性抑制劑(CH223191)進行干預處理，檢測p53的表達，探索IS是否能夠通過AHR受體介導p53的表達。

材料與方法

1.細胞和試劑:人主動脈血管平滑肌細胞(CP-H081，武漢普諾賽公司)；人主動脈血管平滑肌細胞完全培養(yǎng)基(CM-H081，武漢普諾賽公司)；吲苷鉀鹽(I3875，美國Sigma-Aldrich公司)；兔抗p53抗體、鼠抗GAPDH單克隆抗體(美國Proteintech公司)；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠或兔 IgG 抗體(美國Proteintech公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶公司)； 高效RIPA組織/細胞裂解緩沖液(北京索萊寶公司)；蛋白酶抑制劑(北京索萊寶公司)；磷酸酶抑制劑(北京索萊寶公司)；蛋白印跡法專用發(fā)光液(美國Affinity公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(北京索萊寶公司)；實時定量 PCR 試劑盒(美國Invitrogen公司)；RNA 提取試劑盒(美國Omega公司)；cDNA 第一鏈合成試劑盒(中國MCE公司)；SYBR Green PCR Master Mix(美國Sigma-Aldrich公司)；Trizon Reagent、Ultrapure RNA 超純 RNA 提取試劑盒(江蘇康為試劑公司)； 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金公司)。

2.細胞培養(yǎng):人主動脈血管平滑細胞用完全培養(yǎng)基，放置在37℃、5%CO2條件下恒溫培養(yǎng)。貼壁生長至融合狀態(tài)，用0.25%的胰蛋白酶進行消化，選擇生長狀態(tài)良好的細胞進行傳代。當細胞貼壁融合至80%以上時，更換為無血清培養(yǎng)基使細胞饑餓24h。每次實驗均選取4代細胞，并重復實驗3次。

3.Western blot法檢測相關蛋白表達:收集各組細胞，加入100μl配制的細胞裂解液，冰上裂解30min后刮取細胞及裂解液，離心后取上清，選取BCA法測定蛋白濃度。取30μg總蛋白凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，加一抗p53(濃度1∶1000)或GAPDH(濃度1∶10000)，4℃下孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5min，加入相應二抗室溫孵育1h，洗膜后用化學發(fā)光曝光顯影，以GAPDH作為對照，分析各組細胞目的蛋白的相對表達量。

4.實時定量PCR 檢測相關 mRNA 表達:每組細胞加入400μl的Trizol，待細胞充分裂解后移入1.5ml的EP管中，加入80μl的氯仿，離心后取上清，加入等體積的異丙醇離心后棄上清，接著用75%的乙醇洗滌沉淀。用無菌無酶水溶解沉淀后測定RNA的濃度和純度。將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過PCR擴增cDNA。反應體系包括：下游引物0.75μl，上游引物0.75μl，cDNA 2μl，ddH2O 6.4μl，SYBR Green 10μl，ROX 0.1μl，總體積20μl。各基因引物序列詳見表1。

表1 各基因引物序列

結 果

1.不同濃度的IS對于p53表達的影響:Western blot法結果顯示，不同濃度IS(250、500、1000μmol/L)作用于人主動脈血管平滑肌細胞48h后，p53的表達顯著增多。與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 不同濃度的IS對于p53表達的影響A.p53蛋白的表達的情況(Western blot法)；B.p53蛋白的表達的情況(柱形圖)，與對照組比較，*P<0.05(n=3)

2.IS作用于人主動脈血管平滑肌細胞不同時間對于p53表達的影響:Western blot法檢測結果顯示，500μmol/L的IS分別以12、24、48h作用于人主動脈血管平滑肌細胞。24h時p53的表達量明顯增多，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。

圖2 IS作用不同時間對p53表達的影響A.p53蛋白的表達的情況(Western blot法)；B.p53蛋白的表達的情況(柱形圖),與對照組比較，*P<0.05(n=3)

3.AHR抑制劑對于p53表達的影響:Western blot法結果顯示，IS(500μmol/L作用48h)組，比較于對照組p53表達增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但是在加入有機陰離子轉(zhuǎn)運體(organic anion transporter，OAT)抑制劑丙磺舒(150μmol/L)和AHR抑制劑CH-223191(10μmol/L)，p53的表達量明顯降低，與IS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。實時熒光定量PCR的結果顯示，IS(500μmol/L作用24h)會使得p53mRNA的表達量增多，在加入OAT抑制劑丙磺舒(150μmol/L)和芳香烴受體抑制劑CH-223191(10μmol/L)后，與IS組比較p53mRNA的表達量明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義。(P均<0.05，圖4)。

圖3 AHR抑制劑對于IS誘導p53蛋白表達的影響A.p53蛋白的表達的情況(Western blot法)；B.p53蛋白的表達的情況(柱形圖)，與對照組比較，*P<0.05;與IS組比較，#P<0.05(n=3)

圖4 AHR抑制劑對于IS誘導p53mRNA表達的影響與對照組比較，*P<0.05;與IS組比較，#P<0.05(n=3)

討 論

筆者采用IS刺激人主動脈血管平滑細胞，觀察p53蛋白的表達情況，加入AHR抑制劑CH223191，探討AHR抑制劑對于IS誘導的p53的表達情況。本研究結果表明，IS會促進p53蛋白的表達，并且隨著時間的延長和濃度的升高，其表達量越來越高。AhR抑制劑會拮抗IS對于p53表達的影響。

心血管疾病是慢性腎臟病患者(chronic kidney disease,CKD)死亡的重要原因。近年來研究證實，CKD誘發(fā)心血管疾病的發(fā)生與IS的蓄積密切相關[11]。IS是目前研究最廣泛的尿毒癥毒素，在腎衰竭時常積聚在血液中，給人體帶來很大危害[12,13]。Barreto等[14]研究表明，在CKD患者中，心血管死亡風險與IS水平升高密切相關。IS可誘導CKD患者的靶器官損傷，并引起心血管疾病、腎性骨營養(yǎng)不良、肌肉萎縮和貧血等并發(fā)癥[15,16]。IS刺激CKD中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，從而引發(fā)心血管風險，并且通過對系膜細胞的直接細胞毒性作用損害腎小球濾過，進一步加重IS的積累[17]。研究表明升高的IS誘導氧化應激、促炎反應和增強的內(nèi)皮細胞中黏附分子的表達，并且IS對內(nèi)皮細胞的毒性作用導致CKD患者心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[18]。IS通過OAT轉(zhuǎn)運體進入細胞，發(fā)揮其功能。先前有研究表明，AHR是尿毒癥毒素的激動劑[19]。如今已被證實IS是AHR的配體，它可通過芳香烴受體的介導轉(zhuǎn)運進入細胞核內(nèi)[20]。AHR是一種轉(zhuǎn)錄因子，通過與特定配體結合來調(diào)節(jié)廣泛的生物學和毒理學效應。AHR 配體廣泛存在于各種內(nèi)部和外部環(huán)境中，不同的配體會表現(xiàn)出不同的反應[21]。據(jù)報道，AHR與CKD的整個過程都密切相關[21]。

p53是一種轉(zhuǎn)錄因子，通過反式激活和反式抑制參與調(diào)節(jié)多種基因以及功能，包括DNA損傷、癌基因表達、核糖體功能障礙和氧化應激[22]。p53表達的升高促進了細胞凋亡、細胞周期停滯和代謝改變[23]。因此，長期以來p53主要被認為是一個重要的腫瘤抑制因子。然而，它在其他病理過程中也發(fā)揮作用，其在各種心血管疾病中的作用受到關注[23]。越來越多的研究表明，p53在包括心肌在內(nèi)的心血管疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。Annarosa等[24]研究確定在心臟功能障礙的狗模型中，p53的表達和活性增加，伴隨著程序性細胞死亡增加。在病理性心血管環(huán)境中，p53在患者樣本和動物模型中的表達都升高，在晚期心力衰竭患者中檢測到p53表達增加[25]。升高的p53通過抑制血管生成、細胞程序性死亡、代謝調(diào)節(jié)和細胞周期停滯調(diào)節(jié)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。這在很大程度上促進了心血管疾病的發(fā)展，特別是心肌梗死、肥厚性心肌病、擴張型心肌病和糖尿病心肌病的心臟重構。p53在動脈粥樣硬化的中的作用也被發(fā)現(xiàn)。動脈粥樣硬化的病理過程涉及p53對動脈粥樣硬化相關細胞增殖和衰老的調(diào)節(jié)。巨噬細胞是動脈硬化斑塊中的重要細胞，在斑塊形成過程中發(fā)揮著重要作用。p53可通過增加巨噬細胞的增殖來促進動脈粥樣硬化斑塊的形成[26,27]。

綜上所述，IS和p53都與心血管疾病的發(fā)生密切相關。本研究通過時間依賴和劑量依賴兩種方式證實了IS會促進人主動脈血管平滑肌細胞上p53的表達。在加入了AHR抑制劑CH223191之后，p53的表達又降低。這表明IS可能會通過AHR的介導轉(zhuǎn)運進入細胞核內(nèi)，然后促進p53的表達。