HOXA11-AS/miR-149-3p通路在肺鱗狀細(xì)胞癌中的作用及機(jī)制研究

趙 靜 黃珺霞 唐秀花 王 紅

肺鱗狀細(xì)胞癌是一種常見的癌癥[1]。近年來(lái)，隨著臨床技術(shù)的不斷發(fā)展，肺鱗狀細(xì)胞癌的診療方法相比以前有了一定的進(jìn)步[2, 3]。然而，手術(shù)、化療和放療等常規(guī)治療方法由于轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥等原因，并沒有明顯提高晚期患者的生存率[4, 5]。因此，深入研究和闡明肺鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制，對(duì)于該類疾病的診治具有重要意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lnc RNA)在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[6～9]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在肺鱗狀細(xì)胞癌中處于異常表達(dá)的狀態(tài)，提示其可能與肺鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)。例如，LINC00511在肺鱗狀細(xì)胞癌中作為癌基因而發(fā)揮作用，有可能成為肺鱗狀細(xì)胞癌患者診斷的生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[10]。此外，lncRNA HOXA11-AS被確定為多種人類癌癥病理過(guò)程中的致癌基因，如胰腺癌和結(jié)直腸癌[11，12]。提示其可能在癌癥相關(guān)疾病中發(fā)揮著重要作用。然而，尚不清楚HOXA11-AS在肺鱗狀細(xì)胞癌中是否也具有重要的調(diào)控作用。非編碼小分子RNA(micoRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼短RNA，其長(zhǎng)度為19～25個(gè)核酸，可與3′-非翻譯區(qū)結(jié)合，轉(zhuǎn)錄后可通過(guò)與mRNA結(jié)合，導(dǎo)致基因沉默[13, 14]。此外，據(jù)報(bào)道，miR-149-3p可以抑制某些人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展，如骨肉瘤[15]。但是，miR-149-3p是否可作為HOXA11-AS的下游分子而介導(dǎo)肺鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展鮮見報(bào)道。SPT16是染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄促進(jìn)復(fù)合體的重要組成部分，是一種組蛋白伴侶，其在基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和DNA修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有趣的是，SPT16可以作為肺癌的預(yù)后指標(biāo)[16]。然而，SPT16在肺鱗狀細(xì)胞癌中的作用尚不清楚。

因此，筆者研究了HOXA11-AS的表達(dá)水平及其對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移以及腫瘤生長(zhǎng)的影響，以及其與miR-149-3p和SPT16在肺鱗狀細(xì)胞癌可能的調(diào)控機(jī)制。

材料與方法

1.組織來(lái)源：收集2018年6月～2019年6月收治于筆者醫(yī)院的肺鱗狀細(xì)胞癌患者手術(shù)切除癌組織和癌旁組織30例。在切除手術(shù)中獲得癌組織及對(duì)應(yīng)的相鄰正常組織，并立即保存在液氮容器中。所有受試者均符合肺鱗狀細(xì)胞癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)前均未接受放療、化療或其他治療。所有患者均簽署知情同意書，本研究已通過(guò)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：人肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系NCI-H226、NCI-H520、SK-MES-1和正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所(上海)。所有細(xì)胞均用含8%胎牛血清(以色列BI公司)的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)培養(yǎng)在37℃含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)中。

靶向HOXA11-AS的小干擾RNA(siRNA)(si-HOXA11-AS)及其陰性對(duì)照(si-NC)、miR-149-3p 抑制劑(anti-miR-149-3p)及其陰性對(duì)照miR-NC抑制劑(anti-miR-NC)、miR-149-3p mimics (miR-149-3p)及其陰性對(duì)照miR-NC mimic (miR-NC)由中國(guó)上?；蛑扑幱邢薰驹O(shè)計(jì)合成。對(duì)于HOXA11-AS和SPT16的過(guò)表達(dá)，由漢恒生物技術(shù)有限公司(中國(guó)上海)構(gòu)建相應(yīng)的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HOXA11-AS (HOXA11-AS)，同時(shí)，以非靶向質(zhì)粒(pcDNA)為陰性對(duì)照。根據(jù)用戶手冊(cè)，使用Lipofectamine 3000將上述寡核苷酸或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞NCI-H520中。

3.定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)：使用RNA分離試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)從肺鱗狀細(xì)胞癌組織和配對(duì)的相鄰正常組織、肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中分離總RNA。對(duì)于互補(bǔ)DNA (cDNA)的合成，使用1μg RNA，借助高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒。選用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix檢測(cè)HOXA11-AS和SPT16mRNA的表達(dá)。miR-149-3p分析使用all-in-one MIRNA RT-qPCR試劑盒。HOXA11-AS、miR-149-3p和SPT16的相對(duì)表達(dá)采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行評(píng)估。RT-qPCR研究中涉及的引物序列詳見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

4．MTT細(xì)胞增殖測(cè)定：用四甲基偶氮唑鹽細(xì)胞活力分析試劑盒(美國(guó)Sigma公司)檢測(cè)細(xì)胞活力。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板(200μl，3×103個(gè)/孔)。每孔加入10μl四甲基偶氮唑鹽(5mg/ml)繼續(xù)孵育4h，沉淀溶解于二甲基亞砜(100μl)中。在分光光度計(jì)下于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。

5.Transwell實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞被胰酶消化，并放置在上室中，其中包含非涂層膜。下室加入600μl 1%胎牛血清。37℃孵育24h后，用棉簽去除膜的上表面，而下表面的細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色30min。為了進(jìn)行侵襲試驗(yàn)，按照試劑說(shuō)明進(jìn)行Matrigel小室實(shí)驗(yàn)。收集轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(200μl，5000個(gè)/孔)，懸浮于無(wú)血清培養(yǎng)液中，移入50μl的小室。在含10%胎牛血清的500μl DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)過(guò)夜。將上表面的細(xì)胞刮去，將下表面的侵襲細(xì)胞固定，用0.1%結(jié)晶紫染色半小時(shí)。

6.雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)：利用miRcode和target Scan Human7.2在線軟件預(yù)測(cè)HOXA11-AS、miR-149-3p、SPT16的相互作用關(guān)系。構(gòu)建了含有miR-149-3P野生型(WT)和突變型(MUT)結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶表達(dá)載體。進(jìn)一步，將SPT16基因3′-UTR上miR-149-3p的WT或MUT結(jié)合位點(diǎn)克隆到pmirGLO載體(美國(guó)Rromega公司)中，構(gòu)建了WT或MUT SPT16 3′-UTR熒光素酶表達(dá)載體。用脂質(zhì)體2000將熒光素酶報(bào)告基因與miR-149-3p mimics和陰性對(duì)照分別共轉(zhuǎn)染入NCI-H520細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后，用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)(Promega)檢測(cè)熒光素酶的相對(duì)活性，用螢火蟲熒光素酶活性進(jìn)行歸一化。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：本研究中的數(shù)據(jù)來(lái)自至少3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。差異通過(guò)Student′st檢驗(yàn)(兩組數(shù)據(jù))或單因素方差分析(3組數(shù)據(jù))確定。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.HOXA11-AS在肺鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)：為了明確HOXA11-AS在肺鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展中的作用，筆者首先采用RT-qPCR方法檢測(cè)了HOXA11-AS在肺鱗狀細(xì)胞癌組織和配對(duì)的相鄰正常組織，以及在肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與相應(yīng)的正常組織和正常細(xì)胞對(duì)照比較，HOXA11-AS在肺鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)更高(圖1)。

圖1 HOXA11-AS在肺鱗狀細(xì)胞癌組織(A)和細(xì)胞系(B)中上調(diào)*P<0.01,**P<0.001

2.沉默HOXA11-AS抑制肺鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展：為了闡明HOXA11-AS是否參與了肺鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生過(guò)程，筆者使用小干擾RNA(siRNA)來(lái)特異性敲低HOXA11-AS的表達(dá)。與si-NC組比較，si-HOXA11-AS組的肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中HOXA11-AS的表達(dá)顯著降低(圖2A)。此外，MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染si-HOXA11-AS的細(xì)胞存活率明顯降低(圖2B)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，敲低HOXA11-AS后，腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移能力降低(圖2C)。上述研究結(jié)果表明，HOXA11-AS的敲低在體外阻礙了肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖。

圖2 HOXA11-AS的沉默抑制了肺鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展A.轉(zhuǎn)染后48h，檢測(cè)HOXA11-AS在細(xì)胞中的表達(dá);B.MTT法分析轉(zhuǎn)染后24、48和72h細(xì)胞的細(xì)胞活力;C.Transwell法分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲和遷移能力。*P<0.01，**P<0.001

3.HOXA11-AS通過(guò)ceRNA機(jī)制靶向調(diào)控miR-149-3p表達(dá)：現(xiàn)有研究表明，lncRNA可通過(guò)靶向結(jié)合minRNA來(lái)發(fā)揮其調(diào)控作用。在本研究中，筆者使用miRcode軟件搜索了HOXA11-AS的下游miRNA，發(fā)現(xiàn)HOXA11-AS可以與miR-149-3p結(jié)合，HOXA11-AS與miR-149-3p之間的結(jié)合位點(diǎn)如圖3A所示。與miR-NC比較，miR-149-3p mimics有效地提高了其在NCI-H520細(xì)胞中的表達(dá)(圖3B)。隨后的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了HOXA11-AS和miR-149-3p之間的靶向關(guān)系，在細(xì)胞中，使用miR-149-3p mimics，導(dǎo)致HOXA11-AS WT的熒光素酶活性降低(圖3C)，而HOXA11-AS MUT的熒光素酶活性未見明顯變化(圖3D)。其次，筆者分析了肺鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中的miR-149-3p水平，發(fā)現(xiàn)肺鱗狀細(xì)胞癌中miR-149-3p表達(dá)明顯降低(圖3E)。然后，筆者探索了HOXA11-AS對(duì)miR-149-3p表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)沉默HOXA11-AS可上調(diào)細(xì)胞中miR-149-3p的表達(dá)；相比之下，HOXA11-AS的引入顯著降低了miR-149-3p水平(圖3F)。RT-qPCR檢測(cè)顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染anti-miR-149-3p成功下調(diào)miR-149-3p表達(dá)(圖3G)。如圖3H所示，轉(zhuǎn)染si-HOXA11-AS顯著抑制了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞活力，但同時(shí)引入anti-miR-149-3p幾乎消除了抑制作用。此外，如圖3中I和J所示，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果與MTT結(jié)果一致。綜上所述，HOXA11-AS敲低可能通過(guò)增加miR-149-3p的表達(dá)而抑制肺鱗狀細(xì)胞癌的增殖。

圖3 HOXA11-AS直接與miR-149-3p相互作用A.miRcode預(yù)測(cè)的HOXA11-AS與miR-149-3p之間的潛在結(jié)合位點(diǎn);B.通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)miR-149-3p表達(dá);C、D.轉(zhuǎn)染了miR-149-3p或miR-NC的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行WT-HOXA11-AS和MUT-HOXA11-AS熒光素酶活性的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè);E.通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞正常細(xì)胞中的miR-149-3p水平;F.RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染對(duì)照(空白)、si-NC、si-HOXA11-AS、pcDNA或HOXA11-AS 的肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中miR-149-3p的表達(dá);G.RT-qPCR檢測(cè)miR-149-3p抑制劑的敲低水平;H.MTT法分析轉(zhuǎn)染后24、48和72h癌細(xì)胞的細(xì)胞活力;I、J.Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。所有實(shí)驗(yàn)都獨(dú)立重復(fù)3次

4.SPT16是miR-149-3p的直接靶點(diǎn)，HOXA11-AS通過(guò)靶向沉默miR-149-3p而上調(diào)SPT16：此外，筆者還利用TargetScanHuman 7.2尋找miR-149-3p的下游基因，發(fā)現(xiàn)了miR-149-3p與SPT16之間的結(jié)合區(qū)域。miR-149-3p與SPT16 3′-UTR的關(guān)系如圖4A所示。然后采用雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證miR-149-3p與SPT16的相互作用。miR-149-3p mimics的使用顯著降低了NCI-H520細(xì)胞中WT-SPT16的熒光素酶活性，但對(duì)MUT-SPT16沒有影響(圖4中B和C)。隨后，采用RT-qPCR檢測(cè)SPT16在肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明，與相應(yīng)的對(duì)照比較，SPT16在肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中呈高表達(dá)(圖4D)。此外，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明(圖4E)，在細(xì)胞中，miR-149-3p過(guò)表達(dá)導(dǎo)致SPT16mRNA表達(dá)量明顯減少，而當(dāng)過(guò)表達(dá)HOXA11-AS后，SPT16mRNA表達(dá)量升高。因此，HOXA11-AS在肺鱗狀細(xì)胞癌中通過(guò)靶向沉默miR-149-3p來(lái)介導(dǎo)SPT16表達(dá)。

圖4 SPT16是miR-149-3p的直接靶點(diǎn)，HOXA11-AS通過(guò)靶向抑制miR-149-3p上調(diào)SPT16A.TargetScanHuman 7.2預(yù)測(cè)的miR-149-3p與SPT16之間的結(jié)合區(qū)域;B、C.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-149-3p或miR-NC細(xì)胞中WT-SPT16的熒光素酶活性;D. SPT16在肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系以及正常細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平;E.檢測(cè)轉(zhuǎn)染對(duì)照(空白)、miR-NC、miR-149-3p、miR-149-3p + pcDNA或miR-149-3p+HOXA11-AS的SPT16mRNA水平。*P<0.01，**P<0.001。所有實(shí)驗(yàn)都獨(dú)立重復(fù)3次

討 論

肺鱗狀細(xì)胞癌是一種惡性程度較高并且存活率很低的腫瘤[17]。筆者觀察到相比于正常肺組織和肺細(xì)胞系，HOXA11-AS在肺鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)更高，敲低HOXA11-AS抑制了肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的增殖和遷移能力。本研究進(jìn)一步探索了HOXA11-AS、miR-149-3p和SPT16之間的靶向關(guān)系，得出HOXA11-AS直接靶向miR-149-3p, 而miR-149-3p可進(jìn)一步調(diào)控SPT16而發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，HOXA11-AS可以通過(guò)靶向沉默miR-149-3p而介導(dǎo)SPT16表達(dá)，本研究顯示，HOXA11-AS/miR- 149-3p/SPT16軸參與了肺鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展。

研究發(fā)現(xiàn)，HOXA11-AS可作為某些癌癥病理過(guò)程中的誘導(dǎo)劑而發(fā)揮致癌作用。既往研究顯示，HOXA11-AS在癌組織中高表達(dá)，而敲低HOXA11-AS可抑制肺鱗癌細(xì)胞的增殖能力。因此，筆者旨在研究HOXA11-AS在肺癌中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制。通過(guò)在線軟件miRcode尋找到HOXA11-AS的靶向miRNA，并確定了miR-149-3p作為候選miRNA，隨后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究數(shù)據(jù)顯示，與正常組織和細(xì)胞系比較，miR-149-3p在肺鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中明顯下調(diào)。此外，miR-149-3p的敲低部分逆轉(zhuǎn)了si-HOXA11-AS對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的抑制作用。

為明確miR-149-3p所作用的下游靶基因，筆者使用TargetScanHuman 7.2進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定了SPT16為miR-149-3p的候選靶基因，隨后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析了兩者的研究關(guān)系。結(jié)果顯示，相比于正常組織和細(xì)胞系，SPT16的表達(dá)水平在肺鱗癌組織和細(xì)胞系中均顯著上調(diào)。肺鱗癌中SPT16的表達(dá)與HOXA11-AS的表達(dá)呈正相關(guān)。在功能上，過(guò)表達(dá)SPT16明顯逆轉(zhuǎn)了si-HOXA11-AS所介導(dǎo)的對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的抑制作用。

綜上所述，HOXA11-AS可通過(guò)與miR-149-3p結(jié)合促進(jìn)miR-149-3p下游靶基因SPT16的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)肺鱗癌細(xì)胞的增殖能力。本研究明確了HOXA11-AS/miR-149-3p/SPT16軸在肺鱗癌中的作用及調(diào)控機(jī)制，為研究HOXA11-AS在肺鱗癌及其他腫瘤疾病中的作用及機(jī)制提供了理論依據(jù)。HOXA11-AS/miR- 149-3p/SPT16軸有望成為肺鱗狀細(xì)胞癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物，針對(duì)HOXA11-AS/miR-149-3p/SPT16軸的靶向治療可能成為緩解肺鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤的新手段。