廈門(mén)市生鮮水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌基因分型及耐藥性研究

◎陳佳璐

（廈門(mén)市食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院,廈門(mén) 361012）

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）屬于弧菌科弧菌屬，是一種革蘭氏陰性、嗜鹽、氧化酶陽(yáng)性、兼性厭氧、有莢膜、不產(chǎn)芽孢、有動(dòng)力的弧菌[1]。創(chuàng)傷弧菌是引起人獸共患病的病原菌，食用受創(chuàng)傷弧菌污染的海產(chǎn)品或水源，或是創(chuàng)口接觸了帶菌的海水或海洋動(dòng)物，都有可能感染上創(chuàng)傷弧菌。受到該菌感染后的臨床表現(xiàn)主要有原發(fā)性敗血癥、傷口感染及急性胃腸炎三大癥狀[2]，敗血癥和傷口感染都以宿主組織中細(xì)菌極快復(fù)制和皮膚組織廣泛損傷而聞名，即使進(jìn)行了治療，敗血癥的死亡率也可高達(dá)75%，傷口感染的死亡率可高達(dá)50%。該細(xì)菌廣泛存在于亞熱帶海洋環(huán)境及海產(chǎn)品中，當(dāng)海水溫度持續(xù)2 周以上超過(guò)20 ℃時(shí)，創(chuàng)傷弧菌會(huì)大量繁殖。廈門(mén)地處我國(guó)東南沿海，屬于亞熱帶地區(qū)，當(dāng)?shù)厮a(chǎn)品種類豐富，海水水溫適宜創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)。為了解廈門(mén)地區(qū)水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的污染情況，本研究依據(jù)GB 4789.44-2020 中的檢驗(yàn)方法對(duì)2021-2022 年廈門(mén)地區(qū)市售的210 份水產(chǎn)品進(jìn)行創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)，結(jié)合PCR 及VITEK 對(duì)分離株進(jìn)行毒力基因及耐藥性檢測(cè)，以期為水產(chǎn)品創(chuàng)傷弧菌監(jiān)測(cè)工作的深入開(kāi)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

采集廈門(mén)地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市出售的新鮮水產(chǎn)品，涉及海水魚(yú)、淡水魚(yú)及貝類。

1.2 儀器與試劑

CFX96 Touch 熒光定量PCR 儀，美國(guó)Bio-Rad 公司生產(chǎn)；Powerpac 基礎(chǔ)電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司生產(chǎn)；Gel Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司生產(chǎn)；VITEK 2 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀，法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)；Centrifuge 5424 微量離心機(jī)，德國(guó)eppendorf 公司生產(chǎn)。

細(xì)菌分離用培養(yǎng)基購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司、北京陸橋技術(shù)有限公司及上海欣中生物工程有限公司，瓊脂糖、Taq PCR 預(yù)混液、5×TBE、Gelred 染料購(gòu)于生物工程（上海）股份有限公司，DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker 購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，革蘭氏陰性菌鑒定卡及藥敏鑒定卡購(gòu)于法國(guó)梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

現(xiàn)場(chǎng)采集完整個(gè)體，置4 ℃保存，4 h 內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.3.2 創(chuàng)傷弧菌分離培養(yǎng)

魚(yú)類取其鰓、內(nèi)臟等易富集微生物的部位，貝類去殼取可食整體部分，共計(jì)25 g，剪碎后加入225 mL PNCC 增菌液，36 ℃增菌18 h，轉(zhuǎn)種纖維二糖-多黏菌素E（CC）瓊脂平板及改良纖維二糖-多黏菌素B-多黏菌素E（mCPC）瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)18 h，挑取可疑菌落，接種3%氯化鈉胰蛋白胨大豆（TSA）瓊脂平板，36 ℃純培養(yǎng)18 h。

1.3.3 生化實(shí)驗(yàn)

經(jīng)革蘭氏染色、氧化酶試驗(yàn)、三糖鐵實(shí)驗(yàn)及嗜鹽性試驗(yàn)后，再采用梅里埃生物公司革蘭氏陰性鑒定卡鑒定。

1.3.4 藥敏實(shí)驗(yàn)

取一個(gè)或多個(gè)純培養(yǎng)菌落，制成菌懸液，將菌懸液和藥敏卡放入VITEK 鑒定儀自動(dòng)判讀數(shù)據(jù)并給予結(jié)果，共檢測(cè)25 種抗生素。

1.3.5 基因分型

依據(jù)GB 4789.44-2020 中的方法對(duì)創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行毒力相關(guān)基因（vcgC/E）、16S rRNA 基因分型（16S rRNA A/B）、生物Ⅱ型（Bt2）和血清E 型（SerE）檢測(cè)。

1.3.6 AmpC 酶的檢測(cè)

提取創(chuàng)傷弧菌的粗酶，通過(guò)三維實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確證[3]，若看到狹縫與抑菌環(huán)交界處的抑菌環(huán)變形，細(xì)菌擴(kuò)大生長(zhǎng)，可判斷結(jié)果為陽(yáng)性。若抑菌環(huán)呈圓形，沒(méi)有細(xì)菌擴(kuò)大生長(zhǎng)現(xiàn)象則結(jié)果為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 創(chuàng)傷弧菌的污染情況

在210 份水產(chǎn)品中，有69 份檢出創(chuàng)傷弧菌，檢出率32.85%。其中，貝類檢出率達(dá)43.33%，其次為海水魚(yú)26.03%及淡水魚(yú)23.40%。見(jiàn)表1。

表1 各類水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的檢出率表

2.2 創(chuàng)傷弧菌核酸檢測(cè)與基因分型

對(duì)69 株創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示所有菌株均為溶血素A 基因（vvhA）核酸陽(yáng)性，未檢出血清E 型；檢出6 株Bt2 核酸陽(yáng)性，為生物Ⅱ型；vcgC/E 和16SrRNA A/B 分型結(jié)果顯示有4 種基因型，分別為vcgC 和16SrRNA B（CB 型）53 株，vcgC、16SrRNA A 和B（CAB 型）8 株，vcgE 和16SrRNA（EA型）7 株，vcgC 和16SrRNA A（CA 型）1 株，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各類生鮮水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的基因分型表

2.3 創(chuàng)傷弧菌體外藥物敏感性

22 種抗菌素藥物包括β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、青霉素類、單環(huán)素類、頭孢類、頭霉素類、氨基糖苷類、碳青霉烯類、氟喹諾酮類等共8 類藥物。69 株創(chuàng)傷弧菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，僅有8 種抗菌素藥物100%敏感，其他14 種抗菌素藥物均出現(xiàn)不同程度的耐藥性，其中，68 株創(chuàng)傷弧菌均對(duì)頭孢西丁耐藥，耐藥率98.55%，見(jiàn)表3。69 株創(chuàng)傷弧菌中有12 株菌對(duì)2 種以上藥物耐藥，其樣品來(lái)源及基因型別見(jiàn)表4。

表3 創(chuàng)傷弧菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表4 耐藥菌株的樣品來(lái)源及基因型別表

3 結(jié)論與討論

由于創(chuàng)傷弧菌的嗜鹽性使其廣泛存在于海水及水產(chǎn)品中，與霍亂弧菌和副溶血性弧菌同屬致病性弧菌，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害較大的一類致病菌。Yano等[4]研究顯示，我國(guó)零售海產(chǎn)品創(chuàng)傷弧菌污染率為33%。曹敏華等[5]研究顯示，珠海地區(qū)海產(chǎn)品創(chuàng)傷弧菌的污染率為43.82%。本次研究結(jié)果顯示，廈門(mén)地區(qū)水產(chǎn)品創(chuàng)傷弧菌的污染率為32.85%，其中貝類產(chǎn)品污染最為嚴(yán)重，檢出率高達(dá)43.33%。造成貝類污染率較高的原因可能與其是濾食性生物有關(guān)，這種進(jìn)食方式使創(chuàng)傷弧菌易被濃縮在腸道和其他組織中。同時(shí)，近年來(lái)在部分內(nèi)陸地區(qū)的淡水產(chǎn)品中均發(fā)現(xiàn)不同程度的致病性弧菌污染[6-8]。本研究發(fā)現(xiàn)廈門(mén)地區(qū)淡水產(chǎn)品也存在創(chuàng)傷弧菌的感染，淡水魚(yú)中創(chuàng)傷弧菌的檢出率為23.40%，說(shuō)明在銷售環(huán)節(jié)采樣的淡水產(chǎn)品受到創(chuàng)傷弧菌的污染。采樣過(guò)程中發(fā)現(xiàn)同一商鋪同時(shí)售賣海水產(chǎn)品和淡水產(chǎn)品，水體可能存在交叉污染，從而造成淡水產(chǎn)品也攜帶創(chuàng)傷弧菌。

vcgC/E 和16SrRNA A/B 分型結(jié)果表明，廈門(mén)市售水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌基因型呈多樣性分布，分別有CB 型、CAB 型、EA 型及CA 型。其中以CB 型為主，存在于所有本次調(diào)查的3 大類水產(chǎn)品中，占所測(cè)菌株的76.81%，CB 型也是臨床分離創(chuàng)傷弧菌的主要基因型[9]。其次為CAB 型及EA 型，占比分別為11.59%及10.14%，貝類產(chǎn)品未檢出EA 型及CA 型，CA 型只從淡水魚(yú)中檢出一株，其他水產(chǎn)品中均未檢出。相關(guān)流行病學(xué)資料顯示[10]，不同基因型可能具有不同的致病潛能，CB 型被認(rèn)為是一種在臨床上潛在的致病基因型，如生食、半生食水產(chǎn)品或是在產(chǎn)品加工處理過(guò)程中，一旦手上有傷口，都有感染創(chuàng)傷弧菌的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、青霉素類、單環(huán)素類、頭孢類、頭霉素類、氨基糖苷類藥物有不同程度的耐藥性。69 株樣品中，其中，對(duì)頭霉素類藥物的頭孢西丁耐藥的菌株有68 株（98.55%），對(duì)頭孢類藥物耐藥和中度耐藥的菌株有38 株（55.07%），主要是分布在第一代頭孢（頭孢唑啉）、第二代頭孢（頭孢呋辛、頭孢呋辛酯），而對(duì)第三代頭孢（頭孢他啶、頭孢曲松）及第四代頭孢（頭孢吡肟）則表現(xiàn)為100%敏感。對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥和中度耐藥的菌株有10 株（14.49%），對(duì)單環(huán)素類藥物耐藥和中度耐藥的菌株有7 株（10.14%），對(duì)青霉素類藥物耐藥和中度耐藥的菌株有6 株（8.70%），對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類藥物耐藥和中度耐藥的菌株有3 株（4.35%）。結(jié)果顯示，創(chuàng)傷弧菌對(duì)第三代和第四代頭孢、碳青霉烯類及氟喹諾酮類藥物敏感，可作為治療疑似創(chuàng)傷弧菌感染的優(yōu)先選擇藥物。

AmpC 酶是革蘭氏陰性菌主要產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶之一，按照分子分類法，屬于C 類酶，可以水解頭霉素類抗生素。頭孢西丁對(duì)高產(chǎn)AmpC 酶的細(xì)菌常表現(xiàn)為耐藥，因此，用三維實(shí)驗(yàn)對(duì)69 株創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行AmpC 酶檢測(cè)，雖然69 株創(chuàng)傷弧菌均未檢出AmpC 酶，但已有研究表明在副溶血性弧菌中檢出AmpC 酶[11]，而質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC 酶的出現(xiàn)，表明AmpC 酶的耐藥基因可以通過(guò)質(zhì)粒在細(xì)菌間互相傳播，導(dǎo)致耐藥菌的廣泛傳播[12]。

以上討論結(jié)果顯示廈門(mén)地區(qū)市售生鮮水產(chǎn)中創(chuàng)傷弧菌的污染情況不容忽視，有潛在的致病風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)持續(xù)對(duì)其加強(qiáng)監(jiān)測(cè)并進(jìn)行深入研究。