山茶油調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/ARE信號通路對老年癡呆大鼠氧化應(yīng)激損傷的影響

譚麗萍 丁娟 韓鳳珍 胥明霞

老年癡呆又稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是一種神經(jīng)退行性疾病，通常表現(xiàn)出記憶衰退混亂、認(rèn)知障礙、語言障礙、執(zhí)行功能障礙等行為，這種疾病起病隱匿，且病程相對緩慢不易察覺，一旦發(fā)病常令人措手不及而且會縮短患者壽命，給患者及其親人帶來極大痛苦和麻煩[1,2]。然而目前AD病因尚未明確，一些研究發(fā)現(xiàn)它的發(fā)生可能與氧化應(yīng)激、炎癥、衰老、家族遺傳史、頭部損傷等因素有關(guān)；另外還發(fā)現(xiàn)，鋁、鉛、鎘等金屬毒性與神經(jīng)疾病發(fā)生有著密切關(guān)系，尤其是鋁，臨床研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦組織、血液中鋁水平顯著高于正常人[3-5]。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)/核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號通路在機(jī)體抗氧化過程中發(fā)揮重要作用，它能夠通過調(diào)控Ⅱ相酶、抗氧化酶來清除過量自由基等有害物質(zhì)，減輕或抑制氧化應(yīng)激發(fā)生發(fā)展，是治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的一個(gè)重要靶點(diǎn)[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)，健康合理飲食能夠有效降低記憶、認(rèn)知能力的減退，對AD發(fā)生具有較好預(yù)防作用。油是日常生活必不可少的一種攝入，過多食用或油質(zhì)不好都會對身體產(chǎn)生不良影響。山茶油含有較高油酸、不飽和脂肪酸、亞油酸和豐富的維生素、亞麻酸、多酚、黃酮等物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗癌等多種生物學(xué)功效[8]。因此，本研究通過建立AD大鼠模型，探究山茶油是否能夠通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/ARE信號通路對AD大鼠氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 8周SPF級雌性SD大鼠，體重(200±20)g，購于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK(蘇)2016-0010。大鼠1周時(shí)間適應(yīng)環(huán)境，期間自由飲食飲水，保持明暗循環(huán)(12∶12)h、濕度(65±5)%和室溫(22±2)℃。

1.2 主要試劑與儀器 (1)山茶油購于上海源葉生物科技有限公司(S28149)；AlCl3購于西寶生物科技(上海)股份有限公司(11018)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)ELISA試劑盒及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司(PT516、PI328、PI303、S0088、S0058、S0131S)；兔源一抗Anti-Keap1、Anti-Nrf2、Anti-HO-1、Anti-β-actin及二抗山羊抗兔IgG(8047、33649、82206、4970、7074)購于美國CST公司。(2)Morris水迷宮購于北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司；跳臺實(shí)驗(yàn)裝置購于上海然哲儀器設(shè)備有限公司；Alpha View凝膠成像儀購于蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 分組、AD模型構(gòu)建及給藥 大鼠隨機(jī)分為6組，包括空白組、AD組、山茶油低、中、高劑量組和鹽酸多奈哌齊組。AD模型構(gòu)建及藥物處理：模型組大鼠灌胃AlCl3(110 mg/kg)+大豆油(1 ml/kg)；山茶油低、中、高劑量組大鼠分別灌胃AlCl3(110 mg/kg)+山茶油(1 ml/kg)[8]、AlCl3(110 mg/kg)+山茶油(2 ml/kg)、AlCl3(110 mg/kg)+山茶油(4 ml/kg)；鹽酸多奈哌齊組大鼠灌胃AlCl3(110 mg/kg)+鹽酸多奈哌齊(1.75 mg/kg)[1]；空白組大鼠灌胃大豆油(1 ml/kg)。所有大鼠連續(xù)處理49 d，第50天處死大鼠進(jìn)行樣品收集。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及跳臺實(shí)驗(yàn) 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺實(shí)驗(yàn)對6組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行觀察，并記錄大鼠逃避潛伏時(shí)間和潛伏時(shí)間。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、跳臺實(shí)驗(yàn)方式及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考張彤等[1]方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分別在大鼠灌胃7 d、14 d和21 d后進(jìn)行3次，計(jì)算平均值。

1.5 樣品獲取 第50天，大鼠頸椎脫臼處死，取腦組織(海馬組織)置于冰上，部分放入多聚甲醛固定；部分放入-80℃冷凍保存；部分使用組織溶解緩沖液均質(zhì)化后經(jīng)組織勻漿機(jī)制備成組織勻漿，放入-80℃保存。

1.6 HE染色 多聚甲醛中固定的海馬組織制備常規(guī)石蠟切片，切片經(jīng)脫蠟、水化后進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察海馬組織病理學(xué)變化。

1.7 大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測 取出凍存腦組織勻漿，使用ELISA試劑盒檢測促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平。檢測步驟按照ELISA試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.8 大鼠腦組織SOD、GPx、MDA水平檢測 取出凍存腦組織勻漿，使用ELISA試劑盒對SOD、GPx活性和MDA水平進(jìn)行檢測。檢測步驟根據(jù)試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.9 大鼠腦組織Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)檢測 取出凍存腦組織，放入液氮中研磨，之后采用RIPA試劑盒提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度并記錄。SDS-PAGE凝膠電泳后，半干轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；5%脫脂奶粉封閉1 h；分別加入一抗Anti-Keap1、Anti-Nrf2、Anti-HO-1、Anti-β-actin(1∶500)，4℃孵育過夜；加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光法檢測，Tanon軟件進(jìn)行圖像拍攝及半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 山茶油對大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響 與空白組比較，AD組大鼠灌胃7 d、14 d、21 d后潛伏時(shí)間及逃避潛伏時(shí)間明顯延長(P<0.05)。與AD組比較，山茶油低、中、高劑量組和鹽酸多奈哌齊組大鼠潛伏時(shí)間及逃避潛伏時(shí)間明顯縮短(P<0.05)，且山茶油對大鼠潛伏及逃避潛伏時(shí)間的縮短效果存在劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。山茶油高劑量組與鹽酸多奈哌齊組潛伏及逃避潛伏時(shí)間無差異(P>0.05)。見表1、2。

表1 6組大鼠跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

表2 6組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 山茶油對大鼠腦組織病理學(xué)變化影響 空白組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則整齊，數(shù)量正常；AD組神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)變形、壞死現(xiàn)象，且細(xì)胞排列不規(guī)則，層次不清晰，細(xì)胞數(shù)量減少；山茶油低、中、高劑量組和鹽酸多奈哌齊組相較于AD組，細(xì)胞變形、壞死現(xiàn)象減少，層次較清晰，細(xì)胞數(shù)量增多。見圖1。

空白組 AD組 山茶油低劑量組

2.3 山茶油對大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 與空白組比較，AD組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高(P<0.05)。與AD組比較，山茶油低、中、高劑量組和鹽酸多奈哌齊組TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低(P<0.05)。山茶油對TNF-α、IL-1β、IL-6降低效果存在劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)山茶油高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6水平與鹽酸多奈哌齊組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 6組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

2.4 山茶油對大鼠腦組織SOD、GPx、MDA水平的影響 與空白組比較，AD組大鼠腦組織中SOD、GPx活性明顯降低(P<0.05)，MDA水平明顯升高(P<0.05)。與AD組比較，山茶油低、中、高劑量組和鹽酸多奈哌齊組SOD、GPx活性明顯提高(P<0.05)，MDA水平明顯降低(P<0.05)。山茶油對SOD、GPx、MDA作用效果存在劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)，高劑量山茶油作用效果最好。山茶油高劑量組SOD、GPx活性及MDA水平與鹽酸多奈哌齊組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 6組大鼠腦組織SOD、GPx、MDA水平

2.5 山茶油對大鼠腦組織Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，AD組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)明顯降低，Keap1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與AD組比較，山茶油低、中、高劑量組和鹽酸多奈哌齊組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)明顯升高，Keap1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。山茶油對Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)作用效果存在劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)，高劑量山茶油作用效果最好。山茶油高劑量組Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平與鹽酸多奈哌齊組比較無明顯差異(P>0.05)。見表5，圖2。

表5 6組大鼠腦組織Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平

圖2 6組大鼠腦組織Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá);A 空白組；B AD組；C 山茶油低劑量組；D 山茶油中劑量組；E 山茶油高劑量組；F 鹽酸多奈哌齊組

3 討論

AD導(dǎo)致患者出現(xiàn)學(xué)習(xí)能力下降、記憶衰退、行為改變、焦慮抑郁等情況，是威脅老年人生命健康的巨大隱患。日常干預(yù)或減緩AD的發(fā)生與發(fā)展，對AD治療及預(yù)后有重要作用[9]。山茶油因營養(yǎng)豐富，被證明具有抗氧化、抗炎、降低膽固醇、調(diào)節(jié)腸道微生物等多種功效，并且對增強(qiáng)學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知能力也有良好幫助[10,11]。Morris水迷宮和跳臺實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从吵龃笫髮W(xué)習(xí)、記憶、空間定位等情況，幫助判斷大鼠癡呆和智力程度。本研究結(jié)果，AD組大鼠潛伏時(shí)間及逃避潛伏時(shí)間明顯延長，而與AD組比較，山茶油低、中、高劑量組和鹽酸多奈哌齊組潛伏時(shí)間及逃避潛伏時(shí)間明顯縮短。提示山茶油能夠提高大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，減輕大鼠癡呆程度。

炎性反應(yīng)是造成AD的因素之一[12]，并且炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激二者之間相輔相成、相互促進(jìn)、相互影響[13]。因此抑制炎性反應(yīng)對減輕AD的發(fā)生和氧化應(yīng)激損傷具有重要意義。TNF-α、IL-6、IL-1β是較典型的促炎因子，能夠造成細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)炎癥信號通路活化，促進(jìn)更多炎性介質(zhì)如活性氧、活性氮產(chǎn)生，加劇氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)發(fā)生發(fā)展[14,15]。本研究結(jié)果顯示，AD組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯升高，而與AD組相比，山茶油低、中、高劑量組和鹽酸多奈哌齊組TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯降低。提示山茶油能夠減少大鼠腦組織促炎因子水平，從而抑制大鼠腦組織炎性反應(yīng)，減輕大鼠AD。

SOD和GPx是兩種重要的抗氧化酶，在維持氧化還原反應(yīng)中具有重要作用[16]。MDA是自由基與細(xì)胞大分子反應(yīng)的有毒產(chǎn)物，可作為氧化應(yīng)激標(biāo)志物[17]。本研究結(jié)果顯示，AD組大鼠腦組織中SOD、GPx活性明顯降低，MDA水平明顯升高，而與AD組比較，山茶油低、中、高劑量組和鹽酸多奈哌齊組SOD、GPx活性明顯提高，MDA水平明顯降低。提示山茶油具有提高抗氧化酶活性，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)的能力。

Nrf2是CNC調(diào)節(jié)蛋白家族成員，在機(jī)體各個(gè)組織器官廣泛分布，作為調(diào)控細(xì)胞氧化還原的調(diào)節(jié)因子，在正常情況下與其抑制劑Keap1相結(jié)合處于失活狀態(tài)；當(dāng)細(xì)胞受到活性氧等自由基刺激出現(xiàn)氧化還原失衡時(shí)，Nrf2會與Keap1解離，解離后Nrf2處于活化狀態(tài)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，先結(jié)合Maf蛋白，形成異質(zhì)二聚體，再結(jié)合ARE，發(fā)揮調(diào)控Ⅱ相酶、抗氧化酶的作用，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕氧化應(yīng)激損傷[18-20]。本研究結(jié)果提示山茶油能夠通過提高Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞和組織抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)和損傷。

綜上所述，山茶油能夠調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/ARE信號通路對老年癡呆大鼠氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮保護(hù)作用，其具體作用機(jī)制可能是提高Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)，加強(qiáng)抗氧化酶活性，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少氧化還原損傷，同時(shí)抑制促炎因子水平，抑制AD發(fā)生發(fā)展。