bHLH 轉(zhuǎn)錄因子在植物耐冷基因工程中的應(yīng)用進(jìn)展

齊學(xué)禮，李 瑩，李春盈，韓留鵬，趙明忠，張建周

（1.河南省作物分子育種研究院，河南 鄭州 450002；2.《河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》編輯部，河南 鄭州 450002；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 小麥研究所，河南 鄭州 450002）

低溫是植物生長(zhǎng)過程中經(jīng)常遭遇的主要非生物脅迫因子之一，影響植物的地理分布和生長(zhǎng)發(fā)育，降低產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜的低溫脅迫應(yīng)答保護(hù)機(jī)制，以降低低溫脅迫造成的傷害。當(dāng)植物遭遇低溫脅迫時(shí)，首先感知低溫信號(hào)，然后通過一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合，激活下游一系列低溫響應(yīng)基因的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生大量的功能蛋白，從而提高植物的耐冷性。可見，轉(zhuǎn)錄因子在植物低溫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中起著分子開關(guān)的重要作用。目前，已發(fā)現(xiàn)的參與植物低溫脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子主 要 有 MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）、bHLH（Basic helix-loop-helix）、AP2/ERF（APETALA2/ethylene response factor）、NAC [NAM（No apical meristem）、ATAF1（Arabidopsistranscription activation factor 1）、ATAF2、CUC2（Cup-shaped cotyledon 2）]、WRKY 等[3-7]。 其 中，bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中僅次于MYB 的第二大轉(zhuǎn)錄因子家族，擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativaL.）、小麥（Triticum aestivumL.）、甘薯[Ipomoea batatas（L.）Lam.]、辣 椒（Capsicum annuumL.）中 分 別 有162[8]、167[9]、159[10]、110[11]、107[12]個(gè)bHLH 基因。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子功能多樣，可以調(diào)控植物對(duì)低溫、干旱等非生物脅迫和病蟲害等生物脅迫的耐受性[4，13]。其中，在低溫脅迫應(yīng)答中研究最多的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子是類似MYC（Avian myelocytoma virus） 的 ICE[Inducer of CBF（C-repeat binding factor）expression]，其可特異性結(jié)合 到CBF/DREB1（Dehydration-responsive element binding 1）基因啟動(dòng)子區(qū)的MYC 順式作用元件上，激活CBF 基因，CBF 與冷調(diào)節(jié)基因COR（Cold-regulated）啟動(dòng)子區(qū)的CRT/DRE 元件特異結(jié)合，啟動(dòng)COR 基因的表達(dá)，提高植物的耐冷性[14]。ICE-CBF-COR 途徑是目前研究較清晰的植物冷信號(hào)傳遞途徑。闡述了bHLH 轉(zhuǎn)錄因子的基本結(jié)構(gòu)特征，綜述了ICE 轉(zhuǎn)錄因子和其他bHLH 轉(zhuǎn)錄因子在植物耐冷基因工程中的應(yīng)用進(jìn)展，以期為bHLH 轉(zhuǎn)錄因子在植物耐冷遺傳改良、育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 bHLH轉(zhuǎn)錄因子的基本結(jié)構(gòu)特征

bHLH 轉(zhuǎn)錄因子因含有bHLH 結(jié)構(gòu)域而得名[15]。bHLH 結(jié)構(gòu)域通常由約60 個(gè)氨基酸組成，包含堿性區(qū)域（DNA 結(jié)合域）和HLH 區(qū)域[16-18]。其中，堿性區(qū)域位于bHLH 結(jié)構(gòu)域的N-末端，由10～15 個(gè)氨基酸組成，包含堿性氨基酸殘基，該區(qū)可特異性地與靶基因啟動(dòng)子區(qū)中的E-box（5′-CANNTG-3′）順式作用元件結(jié)合，E-box 中間的2 個(gè)核苷酸可變，最常見的形式是G-box（5′-CACGTG-3′）[17-19]；HLH 區(qū)域位于bHLH 結(jié)構(gòu)域的C-末端，由約40 個(gè)氨基酸組成，依賴疏水氨基酸的相互作用，形成2 個(gè)bHLH 蛋白的同源或異源二聚體，然后調(diào)控下游靶基因的表達(dá)[20-21]。

2 ICE轉(zhuǎn)錄因子在植物耐冷基因工程中的應(yīng)用進(jìn)展

目前，已鑒定的調(diào)控植物耐冷性的bHLH 基因以ICE 居多，主要包括ICE1和ICE2，其中以ICE1基因居多，將這些基因轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥、煙草（Nicotiana tabacumL.）、水稻及其他植物，均提高了植物的耐冷性[1，22-51]。

2.1 擬南芥耐冷基因工程

前人研究發(fā)現(xiàn)，ICE1 可特異性地與CBF3基因啟動(dòng)子區(qū)的MYC 元件結(jié)合，超表達(dá)ICE1基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中CBF3基因及其下游低溫響應(yīng)基因[RD29A（Responsive to dehydration 29A）、COR15A、COR47]的表達(dá)量，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性，敲除該基因反之[1]。類似的，超表達(dá)玉米（Zea maysL.）ZmICE1基因降低了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的離子滲漏率和丙二醛（MDA）含量，提高了CBF 基因（AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3）、低 溫 響 應(yīng) 基 因[AtCOR15A、AtCOR47、AtKIN1（Kinesin-1）、AtRD29A]的表達(dá)量，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐冷性[22]。超表達(dá)馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）StICE1基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的花青素含量、細(xì)胞膜穩(wěn)定性（離子滲漏率和損傷程度降低）、活性氧清除能力[超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、抗環(huán)血酸過氧化物酶（APX）活性提高，O2-·和H2O2含量降低]及AtCBF1—AtCBF3、AtCOR15a基因的表達(dá)量，且StICE1 可與維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性的StLTI6A（Low-temperature induced 6A）基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，進(jìn)而增強(qiáng)了擬南芥的耐冷性[23]。另有研究發(fā)現(xiàn)，葡萄（Vitis viniferaL.）VvICE1a和VvICE1b基因受低溫、干旱、高鹽、脫落酸（ABA）誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)VvICE1a、VvICE1b基因均提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中脅迫響應(yīng)基因（AtRD29A、AtCOR47）的表達(dá)量，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性，同時(shí)也提高了抗旱性和耐鹽性[24]。同樣的，龍眼（Dimocarpus longanLour.）DlICE1基 因、茄 子（Solanum melongenaL.）SmICE1a基因均受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)DlICE1、SmICE1a基因均提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的脯氨酸含量及低溫響應(yīng)基因 （AtCBF1—AtCBF3、AtCOR15A、AtCOR47、AtRD29A、AtKIN1）的表達(dá)量，降低了離子滲漏率、MDA 含量和活性氧積累量，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性[25-26]。另外，橡膠樹（Hevea brasiliensis）HbICE1基因受低溫、脫水、高鹽、創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)該基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的脯氨酸含量及低溫響應(yīng)基因（COR15A、COR47、RD29A、KIN1）的表達(dá)量，降低了MDA、活性氧含量和離子滲漏率，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性[27]。此外，超表達(dá)結(jié)縷草（Zoysia japonica）ZjICE1基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的SOD、POD活性及脯氨酸含量，降低了MDA 含量，激活了低溫響應(yīng)基因（CBF1—CBF3、COR47A、RD29A、KIN1）的表達(dá)，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性，同時(shí)增強(qiáng)了抗旱性和耐鹽性[28]。超表達(dá)柳杉（Cryptomeria fortunei）CfICE1基因也提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗氧化酶（SOD、POD）活性，降低了MDA 含量，并促進(jìn)了光合作用，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性[29]。

ICE2基因與ICE1基因關(guān)系密切，是ICE1基因的同源基因，超表達(dá)ICE2基因激活了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中CBF1和CBF3基因的表達(dá)，提高了NCED3（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase 3）基因的表達(dá)量，促進(jìn)了ABA 合成，進(jìn)而促進(jìn)了氣孔的形成，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性[30-31]。類似的，超表達(dá)極耐寒的野生山葡萄（Vitis amurensis）VaICE2基因也提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的脯氨酸含量及低溫脅迫響應(yīng)基因（CBF1、COR15A、COR47、KIN1）的表達(dá)量，降低了MDA 含量和離子滲漏率，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性[32]。說(shuō)明VaICE2 通過調(diào)控CBF 途徑中低溫脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)來(lái)提高擬南芥的耐冷性。同樣的，超表達(dá)水稻OsICE2基因也提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中耐冷基因（RD29A、COR15A、COR47）的表達(dá)量，并與冷適應(yīng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子OsMYBS3互作，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株在低溫脅迫條件下的存活率[33]。另外，杭白菊（Chrysanthemum morifolium）CmICE2基因受低溫和干旱誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)該基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中耐冷相關(guān)基因（AtCBF1、AtCBF2、AtCBF4、AtCOR6.6A、AtCOR414、AtKIN1）的表達(dá)量、脯氨酸含量和SOD、POD、過氧化氫酶（CAT）活性，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性[34]。此外，在擬南芥中超表達(dá)ZjICE2基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株的SOD、POD 活性和脯氨酸含量及耐冷基因（CBF1—CBF3、COR47A、KIN1、RD29A）的表達(dá)量，降低了MDA 含量，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性，同時(shí)也提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性和耐鹽性，將ZjICE2基因轉(zhuǎn)入結(jié)縷草也得到了類似的結(jié)果[35]。說(shuō)明ZjICE2通過調(diào)節(jié)活性氧清除能力和耐冷基因的表達(dá)量來(lái)提高植物的耐冷性。

2.2 煙草耐冷基因工程

研 究 發(fā) 現(xiàn)，番 茄（Solanum lycopersicumL.）SlICE1a基因受低溫、高鹽誘導(dǎo)表達(dá)，在煙草中超表達(dá)該基因提高了低溫、高鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株的可溶性糖、脯氨酸、LEA（Late embryogenesis abundant）蛋白含量及脅迫響應(yīng)基因[NtP5CS（Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase）、NtLEA5、NtDREB2、NtERD10B（Early responsive to dehydration 10 B）、NtERD10C、NtERD10D]的表達(dá)量，降低了離子滲漏率和MDA含量，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性和耐鹽性[36]。類似的，芥菜（Capsella bursa-pastorisL.）CbICE53基因也受低溫、高鹽誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)還受吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、ABA、茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)CbICE53基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片相對(duì)含水量、葡萄糖含量和低溫響應(yīng)基因（NtDREB1、NtDREB3、NtERD10a、NtERD10b）的表達(dá)量，降低了離子滲漏率，進(jìn)而提高了轉(zhuǎn)基因植株的存活率[37]。說(shuō)明CbICE53 通過激活下游冷響應(yīng)通路來(lái)提高煙草的耐冷性。同樣的，枸桔（Poncirus trifoliateL.）PtrICE1基因也受低溫、高鹽誘導(dǎo)表達(dá)，尤其是低溫，PtrICE1 與ADC（Arginine decarboxylase）互作，超表達(dá)PtrICE1基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草和檸檬（Citrus limonL.）植株的抗氧化酶（SOD、CAT）活性、葉綠素含量、多胺含量和ADC基因表達(dá)量，降低了離子滲漏率、活性氧含量[38]。說(shuō)明PtrICE1 通過調(diào)節(jié)多胺含量來(lái)調(diào)控?zé)煵莸哪屠湫?。另外，超表達(dá)油菜（Brassica campestrisL.）BcICE1基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）活性和細(xì)胞膜穩(wěn)定性，激活活性氧清除基因（NtSOD、NtCAT、NtPOD）及其他低溫響應(yīng)基因（NtCBF1、NtDREB2B、NtERD10C等）的表達(dá)，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性，同時(shí)提高了抗旱性和耐鹽性[39]。此外，超表達(dá)VaICE1基因通過提高活性氧清除能力來(lái)提高轉(zhuǎn)基因煙草植株在低溫脅迫條件下的存活率[40]；超表達(dá)薔薇（Rosa multifloraThunb.）RmICE1基因通過提高轉(zhuǎn)基因煙草植株的脯氨酸含量，降低離子滲漏率、MDA 含量、活性氧含量，激活活性氧清除基因（NtSOD、NtCAT、NtPOD）、脅 迫 響 應(yīng) 基 因（NtDREB1—NtDREB3、NtERD10C、NtP5CS、NtLEA5）的表達(dá)來(lái)提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐冷性[41]，說(shuō)明RmICE1 通過提高活性氧清除基因及脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)量來(lái)提高煙草的耐冷性。

2.3 水稻耐冷基因工程

研究發(fā)現(xiàn)，大白菜（Brassica campestrisL.ssp.PekinensisLour.Olsson）BcICE1基 因 受 低 溫、ABA、高鹽誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)BcICE1基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因水稻植株的可溶性糖、脯氨酸和葉綠素含量，降低了MDA 含量和離子滲漏率，激活了脅迫相關(guān)基因[OsDREB1B、OsTPP1（Trehalose 6-phosphate phosphatase 1）]的表達(dá)量，說(shuō)明BcICE1依賴于CBF/DREB1 冷響應(yīng)通路來(lái)調(diào)控水稻的耐冷性[42]。類似的，蘿卜（Raphanus sativusL.）RsICE1基因受高鹽、低溫、ABA誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)RsICE1基因提高了轉(zhuǎn)基因水稻植株的可溶性糖、脯氨酸、葉綠素含量，降低了MDA 含量和離子滲漏率，激活了下游低溫響應(yīng)基因OsDREBL、OsTPP1的表達(dá)，增強(qiáng)了水稻的耐冷性和存活率[43]。有研究發(fā)現(xiàn)，OsICE1 可直接激活其靶基因OsTPP1，超表達(dá)OsICE1基因提高了轉(zhuǎn)基因水稻的耐冷性，RNAi 植株反之，這是因?yàn)樵诘蜏孛{迫條件下，OsICE1 可被OsMAPK3 磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)OsTPP1基因的表達(dá)，提高海藻糖含量，增強(qiáng)水稻的耐冷性[44]。另外，超表達(dá)AtICE1基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因水稻植株的膜穩(wěn)定性，降低了MDA、H2O2含量，激活了脅迫響應(yīng)基因（OsDREB1A、OsMYB3R2、OsTPP1）的表達(dá)，且增強(qiáng)了小穗育性，使籽粒產(chǎn)量提高0.6～2.1 倍，說(shuō)明AtICE1 通過提高活性氧清除能力、膜穩(wěn)定性及脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)量來(lái)提高水稻的耐冷性；同時(shí)，超表達(dá)AtICE1基因提高了轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性和耐鹽性[45]。此外，超表達(dá)板藍(lán)根（Isatis tinctoriaL.）ItICE1基因也提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因水稻植株的脯氨酸和葉綠素含量，降低了MDA含量和離子滲漏率，激活了脅迫響應(yīng)基因（OsDREB1A等）的表達(dá)，增強(qiáng)了水稻的耐冷性[46]。

2.4 其他植物耐冷基因工程

前人研究結(jié)果表明，超表達(dá)擬南芥ICE1基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因黃瓜的SOD、POD 活性和可溶性糖、脯氨酸含量，抑制了MDA 的積累和離子滲漏，增強(qiáng)了黃瓜的耐冷性[47]。類似的，超表達(dá)擬南芥ICE1基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因結(jié)縷草植株的脯氨酸含量和SOD、POD 活性，降低了MDA 含量，激活了ZjCBF、ZjDREB1基因的表達(dá)，進(jìn)而提高了存活率[48]。說(shuō)明ICE1 通過提高抗氧化能力來(lái)提高結(jié)縷草的耐冷性。同樣的，超表達(dá)ZjICE1基因也提高了轉(zhuǎn)基因結(jié)縷草的耐冷性和耐鹽性，RNAi（RNA interference）植株反之[49]。另外，超表達(dá)菊花（Chrysanthemum dichrum）CdICE1基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因菊花植株的SOD、POD 活性及脯氨酸含量，使存活率提高了69.6%，同時(shí)還增強(qiáng)了菊花的抗旱性和耐鹽性[50]。此外，蕪菁（Brassica rapavar.rapa）BrrICE1.1可直接與BrrADC2.2基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，激活BrrADC2.2基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腐胺的積累，增強(qiáng)了蕪菁的耐冷性[51]。

3 其他bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物耐冷基因工程中的應(yīng)用進(jìn)展

除了研究較多且較清晰的ICE 基因外，還發(fā)現(xiàn)很多其他的bHLH 基因也可以調(diào)控植物的耐冷性，大部分具有正調(diào)控作用，少部分具有負(fù)調(diào)控作用，在擬南芥、煙草、水稻及其他植物上超表達(dá)或者敲除這些基因均提高了植物的耐冷性[11，52-68]。

3.1 擬南芥耐冷基因工程

小麥?zhǔn)侵饕募Z食作物，關(guān)于小麥bHLH 基因的研究發(fā)現(xiàn)，TabHLH39基因受低溫、干旱、高鹽誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)該基因提高了低溫、高鹽、干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的脯氨酸含量和細(xì)胞膜穩(wěn)定性及脅迫響應(yīng)基因[AtGSTF6（Glutathione S-transferase F6）、AtSAG13（Senescence-associated gene 13）、AtERD6、AtICE1、AtRD29A、AtRD22、AtERD1]的表達(dá)量，增強(qiáng)了擬南芥的耐冷性、抗旱性和耐鹽性[52]。另外，小麥bHLH 轉(zhuǎn)錄因子TaMYC2是JA 信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)因子，可與TaICE41 互作，超表達(dá)TaMYC2基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的脯氨酸含量、抗氧化酶活性及ICE-CBF-COR 模塊的表達(dá)量，降低了離子滲漏率和MDA 含量，增強(qiáng)了擬南芥的耐冷性[53]。說(shuō)明TaMYC2 通過與TaICE41 互作來(lái)調(diào)控ICE-CBFCOR 耐冷通路，進(jìn)而提高擬南芥的耐冷性。類似的，苦蕎麥（Fagopyrum tataricumL.）FtbHLH2基因受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)該基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的光合效率、脯氨酸含量及抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性，降低了活性氧和MDA 含 量，激 活 了 低 溫 響 應(yīng) 基 因[CBF1、CBF3、DREB2A、COR15a、RD29A、RCI2A（Rare-cold-inducible 2A）]的表達(dá)，增強(qiáng)了擬南芥的耐冷性[54]。說(shuō)明FtbHLH2 通過提高活性氧清除能力及低溫響應(yīng)基因的表達(dá)量來(lái)提高擬南芥的耐冷性。

關(guān)于其他作物bHLH 基因的研究發(fā)現(xiàn)，野生稻（Oryza rufipogonGriff.）OrbHLH001基因是類似ICE1的基因，超表達(dá)該基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐冷性和耐鹽性[55]。甘薯IbbHLH116基因在耐冷品種中的表達(dá)量高于冷敏感品種，超表達(dá)IbbHLH116基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的POD、SOD 活性和脯氨酸、可溶性糖含量，降低了MDA含量，激活了CBF3基因的表達(dá)，增強(qiáng)了擬南芥的耐冷性[56]。另外，超表達(dá)VabHLH1、VvbHLH1基因均提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的脯氨酸含量，降低了MDA 含量和離子滲漏率，激活了CBF1、CBF2、CBF3、COR15、KIN1、RD29A基因的表達(dá)，增強(qiáng)了擬南芥的耐冷性[57]。說(shuō)明VabHLH1、VvbHLH1 通過調(diào)控低溫響應(yīng)基因的表達(dá)來(lái)提高擬南芥的耐冷性。 此外，超表達(dá)蘋果（Malus domestica）MdCIbHLH1（Cold-induced bHLH1）基 因也提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐冷性，且在蘋果和煙草上也得到了類似的結(jié)果[58]。

3.2 煙草耐冷基因工程

前人研究發(fā)現(xiàn)，PtrbHLH基因受低溫誘導(dǎo)強(qiáng)烈上調(diào)表達(dá)，超表達(dá)該基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草和檸檬植株的POD 活性，降低了H2O2含量，且PtrbHLH 與POD基因的E-box 元件結(jié)合激活了POD基因的表達(dá)，增強(qiáng)了煙草和檸檬的耐冷性，RNAi 植 株 反 之[59]。說(shuō) 明PtrbHLH 通 過 調(diào) 控POD基因的表達(dá)來(lái)提高活性氧清除能力，進(jìn)而提高煙草和檸檬的耐冷性。類似的，梨（Pyrus ussuriensis）PubHLH1基因受低溫、高鹽、脫水誘導(dǎo)表達(dá)，在煙草中超表達(dá)該基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量和抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性，降低了MDA 含量和離子滲漏率，激活了脅迫響應(yīng) 基 因（SOD、CAT、APX、DREB1、DREB3、LEA5、ERD10C、NCED1）的表達(dá)，進(jìn)而提高了煙草的存活率[60]。同樣的，煙草NtbHLH123基因也受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)該基因降低了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草植株的MDA、活性氧含量和離子滲漏率，激活了脅迫響應(yīng)基因（NtSOD、NtCAT、NtPOD、NtLEA5、NtERD10C、NtERD10D）的 表 達(dá) ，且NtbHLH123 可與NtCBF基因啟動(dòng)子區(qū)的G-box/Ebox 元件結(jié)合，直接正調(diào)控其表達(dá)，最終提高了煙草的存活率[61]。另外，甜橙（Citrus sinensis）CsbHLH18基因也受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)CsbHLH18基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性及抗氧化酶基因（SOD、POD、CAT）的表達(dá)量，且可特異性地與CsPOD基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，降低了活性氧含量，增強(qiáng)了煙草的耐 冷 性；敲 除CsbHLH18基 因 反 之[62]。 說(shuō) 明CsbHLH18 通過提高活性氧清除能力來(lái)提高煙草的耐冷性。

3.3 其他植物耐冷基因工程

在果樹上的研究發(fā)現(xiàn)，PtrbHLH 可與PtrCAT基因啟動(dòng)子區(qū)特異性結(jié)合，在柚子中超表達(dá)該基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化酶基因（SOD、POD、CAT）的表達(dá)量和抗氧化酶（SOD、POD、CAT）的活性，降低了離子滲漏率、MDA 及活性氧含量，增強(qiáng)了柚子的耐冷性[63]。說(shuō)明，PtrbHLH 通過調(diào)控PtrCAT基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控活性氧水平，進(jìn)而提高柚子的耐冷性。另外，MdbHLH33 可與MdCBF2基因啟動(dòng)子區(qū)的LTR 順式作用元件結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控其表達(dá)，超表達(dá)MdbHLH33基因提高了MdCBF2、MdCOR15A-1、MdCOR15A-2基因的表達(dá)量，增強(qiáng)了蘋果的耐冷性；同時(shí)，超表達(dá)MdCBF2基因也提高了轉(zhuǎn)基因蘋果中MdCOR15A-1、MdCOR15A-2基因的表達(dá)量，增強(qiáng)了蘋果的耐冷性，說(shuō)明MdbHLH33 通過調(diào)控MdCBF2基因的表達(dá)來(lái)提高蘋果的耐冷性[64]。相反的，超表達(dá)蘋果bHLH 轉(zhuǎn)錄因子MdPIF3（Phytochrome interacting factor 3）基因降低了蘋果和擬南芥的耐冷性，說(shuō)明MdPIF3 負(fù)調(diào)控耐冷性，可以通過沉默表達(dá)的方式提高蘋果的耐冷性[65]。

在糧食作物上的研究發(fā)現(xiàn)，水稻bHLH57 可調(diào)節(jié)活性氧代謝和植物主要的耐冷途徑CBF/DREB，超表達(dá)水稻bHLH57基因促進(jìn)了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因水稻植株中海藻糖的合成，增強(qiáng)了耐冷性，且提高了籽粒產(chǎn)量；CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的突變植株反之，其對(duì)低溫敏感，海藻糖含量、籽粒大小和結(jié)實(shí)率均降低，最終導(dǎo)致籽粒產(chǎn)量降低[66]。類似的，IbbHLH79 可激活CBF 通路，超表達(dá)IbbHLH79基因提高了轉(zhuǎn)基因甘薯的耐冷性[11]。

在蔬菜上的研究發(fā)現(xiàn)，辣椒CabHLH79 可以與CaNAC035基因的啟動(dòng)子區(qū)直接結(jié)合，超表達(dá)CabHLH79基因提高了低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因辣椒植株的耐冷基因（CaERD15、CaRD29A、CaCBF1A、CaPOD、CaCAT2）、活 性 氧 清 除 基 因（CaPOD、CaCAT2）的表達(dá)量和抗氧化酶（SOD、POD、CAT）的活性，降低了離子滲漏率和MDA 含量，增強(qiáng)了辣椒的耐冷性，RNAi 植株反之[67]。另外，CaPIF8基因受低溫和高鹽誘導(dǎo)表達(dá)，RNAi 辣椒植株中低溫響應(yīng)基因[CaRBOHA（Respiratory burst oxidase homologue A）、CaNCED1、CaCBF1]的表達(dá)量降低，對(duì)低溫敏感性增強(qiáng)，同時(shí)對(duì)高鹽的敏感性也增強(qiáng)[68]。說(shuō)明CaPIF8 正調(diào)控辣椒的耐冷性和耐鹽性，可以通過超表達(dá)的方式提高辣椒的耐冷性和耐鹽性。

4 展望

低溫是主要的環(huán)境脅迫之一，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，降低產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。因此，培育耐低溫植物品種對(duì)穩(wěn)定農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、保障國(guó)家糧食安全具有重要的作用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，挖掘并利用耐冷基因提高植物的耐冷性是一條行之有效的途徑。轉(zhuǎn)錄因子在低溫信號(hào)通路中起著承上啟下的關(guān)鍵作用，其能調(diào)控下游一系列低溫響應(yīng)基因的表達(dá)，提高植物的耐冷性。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中第二大轉(zhuǎn)錄因子家族，家族成員眾多，功能多樣，在植物抵御低溫脅迫反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用。目前，通過基因工程技術(shù)超量或抑制bHLH 基因的表達(dá)，獲得了大量耐冷性提高的轉(zhuǎn)基因植物。但由于不同bHLH 基因的功能不完全相同，甚至相反，獲得的轉(zhuǎn)bHLH 基因植物的耐冷性程度不同。有的轉(zhuǎn)基因植物僅僅是苗期的耐冷性提高，有的轉(zhuǎn)基因植物是苗期和生殖生長(zhǎng)期的耐冷性均提高，甚至提高了產(chǎn)量。但是，目前已發(fā)現(xiàn)的能夠提高低溫脅迫條件下作物產(chǎn)量的bHLH 基因相對(duì)較少，今后應(yīng)該繼續(xù)加大力度通過各種組學(xué)（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等）技術(shù)挖掘更多的低溫響應(yīng)bHLH 基因，并對(duì)其進(jìn)行功能鑒定，明確更多的能夠提高植物生殖生長(zhǎng)期耐冷性的bHLH 基因。另外，目前獲得的耐冷性提高的轉(zhuǎn)bHLH 基因植物中的bHLH 基因大多是組成型表達(dá)，有時(shí)會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不利影響，例如：發(fā)育遲緩、開花推遲等。因此，今后應(yīng)該盡量采用低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)bHLH 基因以提高植物的耐冷性且盡量不影響其生長(zhǎng)發(fā)育。此外，耐冷性是復(fù)雜的多基因控制的數(shù)量性狀，單一基因的功能有限，可以通過同時(shí)轉(zhuǎn)多個(gè)基因的方法增強(qiáng)植株的耐冷性，以獲得耐冷性程度更高的轉(zhuǎn)基因植物。