桃細(xì)菌性穿孔病的接種方法與不同品種抗性鑒定研究

董京萍，范若渝，王友德，楊麗娜，朱峰，紀(jì)兆林*

(1.江蘇省揚(yáng)州大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省揚(yáng)州市儀征市陳集鎮(zhèn)人民政府，江蘇揚(yáng)州 211408)

桃(Prunusperica)隸屬薔薇目(Rosales)薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)，是中國(guó)十分重要的經(jīng)濟(jì)作物，因其獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)，深受人們的喜愛(ài)。中國(guó)是世界上最大的桃生產(chǎn)國(guó)，同時(shí)也是世界上最大的桃消費(fèi)國(guó)，年產(chǎn)量和消費(fèi)量均達(dá)1 300多萬(wàn)t[1]。近幾年，桃樹(shù)上病蟲(chóng)害的發(fā)生率逐漸增加，目前常見(jiàn)的病蟲(chóng)害達(dá)到20多種[2]，其中桃細(xì)菌性穿孔病(peach bacterial shot hole)在各桃產(chǎn)區(qū)中均廣泛發(fā)生，嚴(yán)重影響當(dāng)年的坐果率和果實(shí)品質(zhì)[3]。

桃細(xì)菌性穿孔病也被稱為桃細(xì)菌性黑斑病(peach bacterial black spot)或桃細(xì)菌性斑點(diǎn)病(peach bacterial spot)，最早于1903年被Smith從北美的李(Prunussalicina)中發(fā)現(xiàn)[4]，病原為樹(shù)生黃單胞李致病變種(Xanthomonasarboricolapv.pruni, Xap)，被歐盟植物檢疫條例列為檢疫對(duì)象。它的寄主主要是桃、李、杏和櫻桃等李屬植物[5]。Xap可以潛伏在桃樹(shù)枝梢、腋芽和葉痕等組織中越冬，次年春季溫度升高，越冬后的細(xì)菌開(kāi)始繁殖，并在越冬部位進(jìn)行初侵染形成病斑，病菌經(jīng)雨水從病部溢出，隨后借助風(fēng)雨和昆蟲(chóng)傳播到葉片、枝梢和果實(shí)上進(jìn)行再侵染[6]。

為更加明確桃細(xì)菌性穿孔病的致病機(jī)理及防治方法，對(duì)桃樹(shù)葉片、枝條和果實(shí)等部位開(kāi)展室內(nèi)接種實(shí)驗(yàn)。桃樹(shù)離體葉片接種方法主要包括傷口法、注射法、噴霧法等，在實(shí)際應(yīng)用中哪種方法更有效尚無(wú)定論。為此，筆者對(duì)幾種常見(jiàn)的離體葉片接種方法進(jìn)行比較，從而選出符合實(shí)驗(yàn)室條件下接種桃細(xì)菌性穿孔病菌的最適方法；并利用該方法，明確江蘇省常見(jiàn)桃樹(shù)品種對(duì)細(xì)菌性穿孔病的抗性，為果農(nóng)選擇桃樹(shù)品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株是從國(guó)內(nèi)桃產(chǎn)區(qū)采集、分離、純化、鑒定獲得[7]，從中選擇6個(gè)作為供試菌株。表1為6個(gè)供試Xap菌株的來(lái)源和菌株編號(hào)。

表1 桃細(xì)菌性穿孔病病菌分離株的來(lái)源與編號(hào)

供試桃品種：春雪和中桃9號(hào)(屬早熟毛桃品種)、中油16號(hào)(屬早熟油桃品種)、中油18號(hào)(屬早熟黃肉油桃品種)、中桃5號(hào)(屬中熟毛桃品種)、湖景蜜露(屬中熟水蜜桃品種)、錦繡黃桃(屬晚熟黃桃品種)。除湖景蜜露采集于本實(shí)驗(yàn)室溫室盆栽桃苗，其他品種均采集于儀征市友德家庭農(nóng)場(chǎng)桃園。

供試培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NB)，蔗糖10 g、酵母粉1 g、牛肉浸膏3 g，胰蛋白胨5 g，加入900 mL超純水?dāng)嚢柚镣耆芙?，? mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.8，最后定容至1 L，高溫高壓(121 ℃，110 kPa)滅菌備用；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(NA)是在1 L NB培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂后滅菌備用。

1.2 配置菌懸液

將上述菌株用接種針通過(guò)平板劃線法于NA培養(yǎng)基上活化，取單菌落加入至NB培養(yǎng)基中，置于180 rpm、28 ℃的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，將菌液離心后棄上清，用無(wú)菌水將菌懸液濃度調(diào)為1×108cfu/mL[2]，以下試驗(yàn)均為該濃度[8]。

1.3 接種方法

取中油16號(hào)、中油18號(hào)、中桃5號(hào)、中桃9號(hào)、湖景蜜露、錦繡黃桃、春雪7個(gè)品種生長(zhǎng)狀況一致的桃葉片，于超凈工作臺(tái)中經(jīng)75%酒精清洗1次、無(wú)菌水沖洗多次，無(wú)菌濾紙吸干水分備用。傷口接種法：用無(wú)菌注射器針頭在處理過(guò)的葉片上輕戳一下制造傷口，隨后在傷口處滴加20 μL菌懸液，待傷口表面菌懸液干燥；噴霧法接種：用無(wú)菌噴霧器噴灑60 μL菌懸液至葉片表面；剪葉法接種：用無(wú)菌剪刀蘸取適量菌懸液，于葉尖2～3 cm處剪下；注射法接種：用無(wú)菌注射器針頭在處理過(guò)的葉片上輕戳一下制造傷口，用去掉針頭的注射器輕抵住葉片正面，利用壓力將20 μL菌懸液通過(guò)傷口注射到葉片中；浸泡接種法：將葉片置于菌懸液中浸泡5 min，隨后用無(wú)菌濾紙吸去多余水分。用無(wú)菌水做上述相同的處理分別作為各自對(duì)照，處理后的葉片放于28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察及統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。每種方法分別用6種菌株接種不同品種的葉片，每個(gè)品種各接種4張?zhí)胰~片，其中傷口接種法和噴霧法在每張葉片上沿主葉脈左右兩側(cè)對(duì)稱位置處各有一個(gè)接種點(diǎn)，共8個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4 不同菌株的致病性測(cè)定

利用最適接種方法(注射法)將6種菌株分別接種到湖景蜜露相同數(shù)量、長(zhǎng)勢(shì)一致的離體葉片上，每張葉片選擇3個(gè)部位接種菌懸液、1個(gè)部位接種等量無(wú)菌水，將接種后的葉片放入28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察及統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。

1.5 不同桃樹(shù)品種抗病性測(cè)定

選用致病性最強(qiáng)9-4號(hào)作為接種菌株，利用篩選出的最適接種方法(注射法)對(duì)所有品種的離體葉片分別進(jìn)行接種，每張葉片均設(shè)置3個(gè)菌懸液接種點(diǎn)和1個(gè)無(wú)菌水接種點(diǎn)對(duì)照，將接種后的葉片放入28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察及統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃細(xì)菌性穿孔病葉片接種方法分析

6個(gè)菌株接種不同品種桃葉片的結(jié)果中，9-4菌株對(duì)湖景蜜露的病害癥狀最明顯。接種的方法不同，葉片的發(fā)病情況也有所不同，表2為湖景蜜露不同接種方法的接種結(jié)果，接種10 d后發(fā)現(xiàn)僅傷口法、注射法和噴霧法接種的葉片上出現(xiàn)褐色水漬狀病斑，屬于典型的細(xì)菌性穿孔病癥狀。采用注射法接種點(diǎn)均發(fā)病，發(fā)病率達(dá)到100%，且發(fā)病癥狀最為明顯；傷口法和噴霧法接種的發(fā)病率均為25%，但病斑較小，噴霧法接種產(chǎn)生的病斑不明顯，易忽略。而常用的浸泡法和剪葉法的葉片一直未出現(xiàn)病斑。

表2 不同接種方法在湖景蜜露葉片的接種結(jié)果

2.2 桃細(xì)菌性穿孔病菌不同菌株的致病性分析

用6種菌株接種長(zhǎng)勢(shì)相同的離體葉片，采用注射法接種湖景蜜露桃葉品種。所有葉片上選擇4個(gè)相同部位的點(diǎn)作為接種點(diǎn)，左上角的接種點(diǎn)注射無(wú)菌水作為對(duì)照，其他3個(gè)點(diǎn)接種菌株，每個(gè)菌株接種6張葉片，接種10 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。結(jié)果顯示，僅9-4、15b和25-3菌株接種的湖景蜜露葉片出現(xiàn)褐色水漬狀病斑，而9-5、15a和35-6菌株接種的桃葉片上無(wú)明顯變化(圖1，圖2)。菌株25-3和菌株9-4接種后產(chǎn)生的病斑較大，菌株25-3引起的病斑略小，菌株9-4、15b和25-3的發(fā)病率分別為83.3%、16.7%和5.6%，而菌株9-5，15a和35-6發(fā)病率為0(圖1)。

圖1 不同菌株接種湖景蜜露葉片的發(fā)病結(jié)果

圖2 不同菌株對(duì)湖景蜜露離體桃葉片的發(fā)病情況

2.3 不同桃樹(shù)品種對(duì)細(xì)菌性穿孔病菌的抗性分析

選用9-4菌株接種長(zhǎng)勢(shì)一致不同品種離體葉片，每張葉片選擇3個(gè)接種點(diǎn)，每個(gè)品種接6葉片，接種10 d后觀察表型(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅中油16號(hào)的葉片沒(méi)有發(fā)病，其他品種的葉片上均有褐色水漬狀斑點(diǎn)，其中6張湖景蜜露葉片上的18個(gè)接種點(diǎn)均出現(xiàn)細(xì)菌性穿孔病的典型病斑，發(fā)病率達(dá)到100%，為最敏感品種；中油18號(hào)和中桃9號(hào)的抗性也較低，其發(fā)病率分別達(dá)到83.3%和77.8%；錦繡黃桃的發(fā)病率是38.9%，抗性一般；中桃5號(hào)和春雪的抗性較高，發(fā)病率僅分別為16.7%和5.6%。

圖3 9-4號(hào)菌株接種不同品種桃葉片的發(fā)病情況

3 小結(jié)與討論

采用不同的接種處理法篩選室內(nèi)最適接種方法，明確注射法接種是桃細(xì)菌性穿孔病離體桃葉片室內(nèi)接種的最佳接種方法，該方法具有葉片發(fā)病率高、對(duì)照性強(qiáng)、易觀察等特點(diǎn)。Smith[4]對(duì)桃細(xì)菌性穿孔病的早期發(fā)病葉片切片進(jìn)行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)病原體可以通過(guò)氣孔進(jìn)入葉片。Xap細(xì)菌增殖的第一個(gè)位點(diǎn)為體下腔，然后是海綿狀薄壁組織，可能由于這些位點(diǎn)存在廣闊的自由空間。隨后，病原體在柵欄組織的細(xì)胞間隙中增殖[9]。注射法是直接將菌懸液注射入葉片組織液中，省去從氣孔侵入的過(guò)程，使侵入效率更高、致病率更強(qiáng)。

利用注射法對(duì)葉片接種Xap的不同菌株，結(jié)果表明分離株間致病性存在明顯差異，其中遼寧瓦房店的9-4菌株接種后葉片發(fā)病率最高，致病性最強(qiáng)，引起的癥狀最明顯。不同產(chǎn)地的菌株具有較高的同源性，地理位置不同可能引起Xap菌株的遺傳多樣性[3]，菌株致病力也不同。用9-4菌株接種不同品種的桃離體葉片，早熟桃品種春雪和中油16號(hào)抗病性較強(qiáng)，早熟桃品種中油18號(hào)和中桃9號(hào)抗病性較差，中熟桃品種湖景蜜露抗病性較差，中熟桃品種中桃5號(hào)抗病性較強(qiáng)。研究結(jié)果表明，桃樹(shù)品種的早熟晚熟特性與細(xì)菌性穿孔病的抗病性關(guān)聯(lián)性不大。但是在選育抗性品種時(shí)，早熟的特性可以作為推廣的一個(gè)重要因素[10]，鑒于選育各方面均佳的桃樹(shù)抗性品種時(shí)期較長(zhǎng)，因此可通過(guò)對(duì)菌株的抗病性強(qiáng)弱確定適合當(dāng)?shù)胤N植的桃樹(shù)品種，如遼寧產(chǎn)區(qū)的果農(nóng)可以優(yōu)先選擇春雪、中桃5號(hào)和中油16號(hào)。 而湖景蜜露、中油18號(hào)和中桃9號(hào)對(duì)桃細(xì)菌性穿孔病較敏感，應(yīng)慎重選擇。