生信分析腎陽(yáng)虛型絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥分子機(jī)制及淫羊藿的靶向治療機(jī)制

蔣 俊，毛國(guó)慶

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科，江蘇 南京 210000）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是指女性絕經(jīng)后發(fā)生骨組織結(jié)構(gòu)改變、骨量減少及骨的脆性增強(qiáng)的一種疾病，其原因是雌激素水平的下降，多于女性絕經(jīng)后5～10 年發(fā)生[1]。骨折是PMOP 并發(fā)癥中最嚴(yán)重的一種，在縮短患者生存周期的同時(shí)，嚴(yán)重影響患者的身心健康。2018年全國(guó)首次骨質(zhì)疏松流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示[2]，我國(guó)50 歲以上男性骨質(zhì)疏松患病率僅為6.0%，而同年齡段女性患病率高達(dá)32.1%。因此，PMOP 的防治不僅是一個(gè)健康問(wèn)題，而且是一個(gè)社會(huì)問(wèn)題。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中沒(méi)有“骨質(zhì)疏松”的病名記載，但根據(jù)其病因病機(jī)、發(fā)病特點(diǎn)及臨床癥狀，目前常認(rèn)為其屬于中醫(yī)“骨痿”“骨枯”“骨蝕”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為骨質(zhì)疏松發(fā)生的根本病因是腎虛。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提及：“腎主骨，生髓?！币虼?，腎虛會(huì)導(dǎo)致生髓功能的減弱，進(jìn)而引起骨髓空虛，骨強(qiáng)度減弱，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。根據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)[3]，淫羊藿在防治PMOP 的中藥復(fù)方中占很大比例，許多臨床防治PMOP 的驗(yàn)方中都含有淫羊藿，其使用頻率僅次于熟地黃位居第2 位，是治療腎陽(yáng)虛型PMOP 的最基礎(chǔ)藥物。淫羊藿屬于小蘗科植物，亦稱(chēng)“仙靈脾”，《中國(guó)藥典》中記載其性味辛甘溫，歸肝腎經(jīng)，有壯腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效。淫羊藿中有效成分復(fù)雜?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[4]，淫羊藿苷是淫羊藿中含量最高的成分，能夠抑制卵巢摘除大鼠的骨丟失，減緩骨密度下降，改善骨骼力學(xué)性能和骨小梁微結(jié)構(gòu)。盡管目前有很多關(guān)于淫羊藿與PMOP 相關(guān)的研究報(bào)道，但其治療腎陽(yáng)虛型PMOP 的作用機(jī)制仍不是十分明確。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)深入分析其作用靶點(diǎn)及作用通路，從整體論治淫羊藿與腎陽(yáng)虛型PMOP 的關(guān)聯(lián)性，為臨床應(yīng)用和后續(xù)試驗(yàn)研究提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源及差異基因分析 在公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus，GEO）中，以“postmenopausal osteoporosis”“kidney yang dificiency”為檢索詞，設(shè)定篩選條件為人（Homo spaiens）進(jìn)行搜索，檢索到GSE56116 芯片數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集由13例樣本構(gòu)成，其中10 例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者分為腎陰虛（4 例）、腎陽(yáng)虛（3 例）、非腎虛（3 例）3 組，另外3 例為絕經(jīng)后健康婦女。從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GSE132550 的基因表達(dá)譜，利用limma 包對(duì)絕經(jīng)后健康婦女及腎陽(yáng)虛絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女進(jìn)行差異基因分析，標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為|logFC|≥1且P＜0.05，結(jié)果以火山圖呈現(xiàn)。

1.2 腎陽(yáng)虛型PMOP 靶點(diǎn)獲取 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）中，以“postmenopausal osteoporosis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索并收集PMOP 的相關(guān)基因，結(jié)果與1.1 中的差異基因進(jìn)行匹配，得到重合部分基因即為腎陽(yáng)虛型PMOP 的靶點(diǎn)。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲得的腎陽(yáng)虛型PMOP 靶點(diǎn)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org/）中，選擇物種為人類(lèi)（Homo spaiens），隱藏未連接的節(jié)點(diǎn)，其他參數(shù)選擇默認(rèn)設(shè)置，進(jìn)行蛋白互作分析，結(jié)果導(dǎo)入3.9.0 版本Cytoscape 軟件中可視化，利用Cytoscape 軟件cyto－Hubba 插件獲得連接度值前10 的核心靶點(diǎn)。

1.4 GO 及KEGG 富集分析 將腎陽(yáng)虛型PMOP 的靶點(diǎn)輸入到DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）中，選擇人類(lèi)（Homo spaiens）且P＜0.01，進(jìn)行GO 生物過(guò)程和KEGG 通路富集分析，分析腎陽(yáng)虛型PMOP 的潛在病理機(jī)制。

1.5 淫羊藿活性成分及潛在靶點(diǎn)篩選 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）搜索淫羊藿（Epimrdii Herba）的化學(xué)成分，設(shè)置篩選條件：口服利用度（OB）≥30%及類(lèi)藥性（DL）≥0.18，初步篩選出淫羊藿的活性成分及其作用靶點(diǎn)。運(yùn)用R 軟件對(duì)連接度值前10 的腎陽(yáng)虛型PMOP 核心靶點(diǎn)進(jìn)行匹配映射，獲得潛在治療靶點(diǎn)。

1.6 計(jì)算機(jī)分子對(duì)接 在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/）及PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中，分別下載潛在治療靶點(diǎn)蛋白3D 結(jié)構(gòu)pdb 格式文件及化合物3D 結(jié)構(gòu)的sdf 格式。使用DockThor 進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因 在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中最終得到腎陽(yáng)虛型PMOP 的基因表達(dá)芯片（GEO 編號(hào)：GSE56116），對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)果顯示腎陽(yáng)虛型PMOP 患者低表達(dá)基因有313 個(gè)，高表達(dá)196 個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖

2.2 腎陽(yáng)虛型PMOP 靶點(diǎn) 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得腎陽(yáng)虛型PMOP 靶點(diǎn)1153 個(gè)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得腎陽(yáng)虛型PMOP 靶點(diǎn)45 個(gè)，去除重復(fù)，共得到PMOP 相關(guān)靶點(diǎn)1187 個(gè)，將腎陽(yáng)虛型PMOP 差異表達(dá)基因與PMOP 靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1，獲得48 個(gè)交集靶點(diǎn)，即為腎陽(yáng)虛型PMOP 的靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖2 腎陽(yáng)虛型PMOP 靶點(diǎn)

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò) 將48 個(gè)腎陽(yáng)虛型PMOP 靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)進(jìn)行互作分析，共得到35 個(gè)節(jié)點(diǎn)，90 條連線(xiàn)，見(jiàn)圖3，其中連線(xiàn)表示蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的證據(jù)，節(jié)點(diǎn)表示蛋白質(zhì)，相互關(guān)系計(jì)數(shù)越多，說(shuō)明該靶點(diǎn)基因在治療腎陽(yáng)虛型PMOP 中起到的作用越重要，利用Cytoscape 軟件cytoHubba 插件篩選出連接度值前10 的核心靶點(diǎn)基因，見(jiàn)表1。

表1 腎陽(yáng)虛型PMOP 核心靶點(diǎn)

圖3 腎陽(yáng)虛型PMOP 靶點(diǎn)基因PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 富集分析結(jié)果 GO 富集分析得到42 個(gè)結(jié)果，分別選擇展示前5 個(gè)基因功能，見(jiàn)圖4，生物學(xué)過(guò)程主要為參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移過(guò)程調(diào)節(jié)等；細(xì)胞組分主要有細(xì)胞外區(qū)域、外泌體等；分子功能主要有蛋白酶結(jié)合、整合素結(jié)合等。KEGG 通路富集分析得到6個(gè)結(jié)果，見(jiàn)圖5，富集的通路有PI3K-Akt 信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化、化學(xué)致癌受體激活、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)通路。

圖4 GO 富集分析

圖5 KEGG 富集分析

2.5 淫羊藿活性成分及潛在靶點(diǎn)篩選 按條件篩選獲得淫羊藿活性成分23 種，治療靶點(diǎn)467 個(gè)，將治療靶點(diǎn)與連接度前10 的腎陽(yáng)虛型PMOP 核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1，得到潛在治療靶點(diǎn)EGF、CRP、FOS、MMP1，對(duì)應(yīng)活性成分為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）。

2.6 小分子結(jié)構(gòu)文件獲取及分子對(duì)接 將槲皮素、木犀草素、山柰酚分別與潛在靶點(diǎn)基因EGF、CRP、FOS、MMP1 兩兩組合，進(jìn)行分子對(duì)接，見(jiàn)表2。一般默認(rèn)當(dāng)配體與受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定時(shí)，結(jié)合能值越小，發(fā)生作用的可能性越大，對(duì)接結(jié)果顯示對(duì)接能量均低于-5 kJ/mol，說(shuō)明藥物活性成分與疾病靶點(diǎn)能夠良好結(jié)合。根據(jù)最低結(jié)合能的結(jié)果，與槲皮素親和力最高的是EGF、與山柰酚親和力最高的是EGF、與木犀草素親和力最高的是CRP。

表2 分子對(duì)接結(jié)果（kJ/mol）

3 討論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)沒(méi)有“絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松”的病名記載，但根據(jù)其周身疼痛，彎腰駝背，不能負(fù)重，易發(fā)骨折等表現(xiàn)，常常將其歸于“骨痿”“骨枯”“骨蝕”“骨疏”等范疇，其中尤其與“骨痿”類(lèi)似?！端貑?wèn)·上古天真論》所載：“女子七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭。”故中醫(yī)理論認(rèn)為女子絕經(jīng)后，天癸衰竭，腎虛精虧，骨髓化源不足，骨骼失于榮養(yǎng)，導(dǎo)致骨量減少，發(fā)為本病?！毒霸廊珪?shū)·痿論》中說(shuō)：“腎者，水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿。”亦認(rèn)為PMOP 的根本病因是腎精虧虛，腎虛則不能生髓，髓不能養(yǎng)骨則骨枯，最終發(fā)展為骨痿。淫羊藿作為治療腎陽(yáng)虛型PMOP 的常用藥物，療效顯著，但其具有多成分、多靶點(diǎn)相互作用的特點(diǎn)，活性成分群與作用機(jī)制尚不清晰，限制了其臨床推廣使用。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，擬闡明淫羊藿的作用，探討其干預(yù)腎陽(yáng)虛型PMOP 的作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，腎陽(yáng)虛型PMOP 患者血液樣本中表達(dá)下調(diào)基因有313 個(gè)，上調(diào)基因有196 個(gè)，將其與PMOP 相關(guān)基因進(jìn)行映射匹配，結(jié)果得到腎陽(yáng)虛型PMOP 相關(guān)的靶基因48 個(gè)，對(duì)獲得的48 個(gè)靶點(diǎn)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，EGF、FGF2、CRP、VWF、ITGB3、IRS1、MMP1、SELP、FOS、PRL 等靶點(diǎn)具有較高度值，可能是腎陽(yáng)虛型PMOP 的核心靶點(diǎn)。研究證明[5]，EGF 是一種單鏈低分子多肽，能夠與受體EGFR 結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織修復(fù)。當(dāng)EGF 與EGFR 相結(jié)合時(shí)，EGFR/MEK/ERK1/2 信號(hào)通路會(huì)被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖[6]。CRP 是一種炎癥因子，能夠代表機(jī)體的炎癥水平。韓學(xué)明等[7]發(fā)現(xiàn)，hs-CRP 水平與絕經(jīng)后女性的骨密度存在高度相關(guān)性。同時(shí)既往研究發(fā)現(xiàn)慢性炎癥疾病可造成RANKRANKL-OPG 軸失衡，促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，增強(qiáng)骨吸收，最終導(dǎo)致PMOP 的發(fā)生[8，9]。MMP1 則是一種基質(zhì)金屬蛋白酶，由成骨細(xì)胞分泌。有研究發(fā)現(xiàn)MMP1水平與骨質(zhì)疏松存在相關(guān)性[10]。朱偉等[11]發(fā)現(xiàn)MMP1可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和改善骨質(zhì)疏松。楊全增等[12]通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MMPs 表達(dá)量的上調(diào)可以抑制骨基質(zhì)和Ⅰ型膠原的過(guò)度降解，維持骨重建平衡。FOS 是一種核內(nèi)磷酸蛋白，有研究證明其表達(dá)受RANKL 調(diào)控，當(dāng)RANKL 與受體結(jié)合時(shí)，能夠刺激C-FOS 的生成，整個(gè)過(guò)程能夠刺激破骨細(xì)胞分化增加，影響骨吸收，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[13]。Takayanagi H等[14]發(fā)現(xiàn)抑制C-FOS 的表達(dá)可以減少促炎因子生成，阻止炎癥發(fā)生及進(jìn)展，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞活化，最終改善骨質(zhì)疏松。

本研究通過(guò)GO 富集分析及KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，腎陽(yáng)虛型PMOP 與PI3K-Akt 信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化、化學(xué)致癌受體激活、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎通路有關(guān)。其中PI3K-Akt、Th17 細(xì)胞分化信號(hào)通路通過(guò)多種方式參與信號(hào)傳導(dǎo)，與骨質(zhì)疏松關(guān)系密切[15，16]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[17]，PI3K-Akt 通路是參與炎癥反應(yīng)及骨代謝失衡的關(guān)鍵通路之一，激活PI3K-Akt 通路可引起成骨細(xì)胞凋亡、破骨細(xì)胞生成及骨吸收控制節(jié)點(diǎn)失衡，導(dǎo)致骨代謝異常及骨質(zhì)疏松的發(fā)生。另有研究發(fā)現(xiàn)[18]，Th17細(xì)胞分化通路亦與骨質(zhì)疏松存在聯(lián)系。女性絕經(jīng)后雌激素缺乏能夠增強(qiáng)Th17 細(xì)胞分化功能，進(jìn)而導(dǎo)致IL-17 分泌增多，而IL-17 能夠增加來(lái)自成骨細(xì)胞的促破骨細(xì)胞因子來(lái)誘導(dǎo)骨丟失，加劇骨量的減少，最終導(dǎo)致PMOP 的發(fā)生。

本研究得到淫羊藿的23 種活性成分，對(duì)應(yīng)467種治療靶點(diǎn)。其中槲皮素、山柰酚、木犀草素可能作用于EGF、CRP、FOS、MMP1 發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。槲皮素、山柰酚、木犀草素均為黃酮類(lèi)化合物，具有抗骨質(zhì)疏松的作用。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[19，20]，槲皮素能夠促進(jìn)BMSCs 增殖和成骨分化，抑制骨丟失，增加骨密度，改善骨質(zhì)疏松。山柰酚可能通過(guò)下調(diào)c-Fos的表達(dá)減少破骨細(xì)胞的生成，治療骨質(zhì)疏松[21]。木犀草素可能通過(guò)激活PI3K-Akt 信號(hào)通路從而改善PMOP 大鼠的骨丟失[22]。本研究選取活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草與潛在治療靶點(diǎn)EGF、CRP、FOS、MMP1 進(jìn)行對(duì)接，結(jié)果顯示，對(duì)接能量均低于-5 kJ/mol，可知藥物的主要有效成分進(jìn)入機(jī)體后能與潛在治療靶蛋白有良好的親和力，表明淫羊藿以多成分協(xié)同的形式作用于多個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，發(fā)揮治療腎陽(yáng)虛型PMOP 的作用。

綜上所述，淫羊藿中的槲皮素、山柰酚、木犀草素可能通過(guò)EGF、CRP、FOS、MMP1 靶點(diǎn)與PI3KAKT、Th17 細(xì)胞分化通路治療腎陽(yáng)虛型PMOP。