一種用于核酸即時(shí)檢測(cè)的全集成微流控芯片*

楊馥瑞，吳夢(mèng)希，劉軍山

（大連理工大學(xué)遼寧省微納米技術(shù)及系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116024）

0 引言

病原體嚴(yán)重威脅人類生命健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1]。病原體的檢測(cè)方法包括核酸檢測(cè)、抗原抗體檢測(cè)、分離培養(yǎng)等。其中，核酸檢測(cè)具有高靈敏度和高特異性等優(yōu)點(diǎn)，已成為病原體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。基于常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的核酸檢測(cè)需要在3 個(gè)不同溫度之間進(jìn)行幾十次的擴(kuò)增循環(huán)，操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)。因此，研究人員開發(fā)了多種基于等溫?cái)U(kuò)增的核酸檢測(cè)技術(shù)，例如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）[2-3]，在恒定溫度下較短時(shí)間內(nèi)便可以完成核酸檢測(cè)過程。

現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)（Point-of-care Testing, POCT）與傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)方法相比，具有操作簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)[4]，在疫情防控等領(lǐng)域極具應(yīng)用潛力。微流控芯片具有微型化、集成化和便攜化等特點(diǎn)，特別適合用于核酸的即時(shí)檢測(cè)。然而，目前大多數(shù)基于微流控芯片的核酸檢測(cè)系統(tǒng)需要復(fù)雜昂貴的檢測(cè)設(shè)備和液體驅(qū)動(dòng)設(shè)備等[5-7]。例如，2010 年，德國(guó)弗賴堡大學(xué)的Lutz 等[8]研制的微流控檢測(cè)系統(tǒng)需要離心設(shè)備進(jìn)行芯片上的液體驅(qū)動(dòng)。2021 年，北京航空航天大學(xué)研制了一種全集成微流控芯片，利用指壓便可以實(shí)現(xiàn)芯片上的液體驅(qū)動(dòng)，借助紫外燈可以用肉眼讀出檢測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了結(jié)核桿菌的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)[9]。但是，為了實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)檢測(cè)，該芯片需要利用復(fù)雜的閥結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)池間的物理隔離。2009年，美國(guó)芝加哥大學(xué)的Du等[10]提出了一種滑動(dòng)式結(jié)構(gòu)的微流控芯片，在芯片的基片上制作出微溝道，在芯片的滑動(dòng)片上制作出液體腔室，利用兩片之間的相對(duì)滑動(dòng)，便可以實(shí)現(xiàn)不同液體腔室間的連通或者隔離。之后，又有多位學(xué)者對(duì)滑動(dòng)式結(jié)構(gòu)的微流控芯片進(jìn)行了相關(guān)研究。例如，2011 年，美國(guó)芝加哥大學(xué)的Shen 等[11]研制了一種只有硬幣大小的旋轉(zhuǎn)式滑動(dòng)芯片，可以連續(xù)生成納升級(jí)液滴，用于定量檢測(cè)HIV和HCV病毒。

為此，本文針對(duì)核酸現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)的需求設(shè)計(jì)了一種基于LAMP 技術(shù)的全集成微流控芯片，能夠完成核酸的提取和擴(kuò)增功能，利用一次性注射器進(jìn)行芯片上的液體驅(qū)動(dòng)，借助紫外線驗(yàn)鈔筆便可用肉眼直接讀出核酸檢測(cè)結(jié)果。而且，在芯片的擴(kuò)增區(qū)域采用了滑動(dòng)式芯片結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了16個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)池之間的物理隔離，因此該芯片可用于多靶標(biāo)檢測(cè)。

1 芯片的設(shè)計(jì)

圖1（a）為本文設(shè)計(jì)的全集成微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖，在芯片的基片上制作了微通道和試劑池等結(jié)構(gòu)。根據(jù)功能，將芯片分為3 個(gè)區(qū)域：核酸提取區(qū)、混合區(qū)和擴(kuò)增區(qū)，如圖1（b）所示。

圖1 全集成微流控芯片

（1）核酸提取區(qū)。為了實(shí)現(xiàn)便攜化操作，選擇了磁珠法進(jìn)行核酸的提取，為此該區(qū)域設(shè)計(jì)了4 個(gè)試劑池：磁珠池、裂解池、清洗池1和清洗池2。磁珠法的基本原理為：磁性納米顆?？梢耘c核酸分子特異性結(jié)合，利用磁場(chǎng)操控磁性顆粒運(yùn)動(dòng)，便可以在不同區(qū)域分別實(shí)現(xiàn)裂解、清洗等核酸提取步驟。

（2）混合區(qū)。該區(qū)域設(shè)計(jì)了1個(gè)洗脫池、1個(gè)擴(kuò)增試劑池和1 個(gè)方波混合器，主要用于實(shí)現(xiàn)核酸的洗脫以及與擴(kuò)增試劑的充分混合。為了便于操作和縮短檢測(cè)時(shí)間，選擇了LAMP 擴(kuò)增法，因此在擴(kuò)增試劑池里存放LAMP Mix試劑。

（3）擴(kuò)增區(qū)。為了實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)核酸檢測(cè)，在該區(qū)域采用了滑動(dòng)式芯片結(jié)構(gòu)。在基片上設(shè)計(jì)了用于液體流動(dòng)的微溝道，在滑動(dòng)蓋片上設(shè)計(jì)了16 個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)池，利用低熔點(diǎn)石蠟（48～50 ℃）將擴(kuò)增引物預(yù)先包埋在各個(gè)反應(yīng)池內(nèi)。當(dāng)需要將待測(cè)溶液引入擴(kuò)增反應(yīng)池時(shí)，移動(dòng)蓋片使反應(yīng)池與微溝道連通，此時(shí)由于引物被石蠟包埋在反應(yīng)池底部，因此不會(huì)發(fā)生反應(yīng)池間引物相互混合的現(xiàn)象。當(dāng)需要進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，移動(dòng)蓋片使反應(yīng)池與微溝道斷開，從而實(shí)現(xiàn)各反應(yīng)池之間的徹底物理隔離。

圖1（c）所示為采用精密銑削制作出的聚碳酸酯（PC）微流控芯片，圖1（d）所示為則為注入各種試劑后的芯片照片。

2 芯片的操作步驟

芯片的操作步驟包括實(shí)驗(yàn)前的芯片預(yù)備步驟和核酸檢測(cè)步驟。其中，預(yù)備步驟主要包括：（1）利用移液槍將不同類型的擴(kuò)增引物加入擴(kuò)增反應(yīng)池中，然后將低熔點(diǎn)石蠟融化后依次加入各反應(yīng)池，待石蠟由液態(tài)轉(zhuǎn)為固態(tài)時(shí)，引物便被包埋在反應(yīng)池底部；（2）將磁珠、裂解液、清洗液1、清洗液2、洗脫液和LAMP Mix 試劑加入各儲(chǔ)液池中，然后利用膠帶將注液孔密封；（3）在滑動(dòng)蓋片與基片之間涂覆少許無菌液體石蠟，保證兩片緊密貼合。

核酸檢測(cè)步驟主要包括：（1）將20 μL 樣品注入裂解池，在室溫下保持5 min，完成裂解過程；（2）利用一根釹鐵硼永磁棒移動(dòng)磁珠，使其依次通過清洗池1、清洗池2 和洗脫池，磁珠在兩個(gè)清洗池處各停留1 min，洗去殘留的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，在洗脫池中停留3 min，使核酸脫落磁珠表面，然后將磁珠移回清洗池2 中；（3）利用一次性注射器，手動(dòng)向芯片內(nèi)緩慢加壓，使核酸洗脫液與LAMPMix 試劑同時(shí)進(jìn)入方波混合器，得到混合均勻的待測(cè)溶液；（4）再次加壓，將待測(cè)溶液注入16個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)池中，將滑動(dòng)蓋片向上推移，反應(yīng)池間實(shí)現(xiàn)物理隔離；（5）將芯片升溫至65 ℃，保持40 min，完成核酸擴(kuò)增；（6）利用波長(zhǎng)為365 nm 的紫外線驗(yàn)鈔筆依次照射各反應(yīng)池，發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)的樣品池在照射下會(huì)發(fā)出明亮的綠色熒光，而未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的樣品池則暗淡無光。

3 結(jié)果與討論

3.1 方波混合器

方波混合器是微流控領(lǐng)域中常用的一種二維混合器，主要利用尖角處的湍流和層流間的液體擴(kuò)散來完成溶液混合[12]。根據(jù)Chen 等[13]的研究，在相同直徑、流速以及縱向長(zhǎng)度的情況下，方波形的混合器比其他類型的混合器效率更高。為此，結(jié)合全集成微流控芯片的外觀尺寸，對(duì)方波混合器的長(zhǎng)度和直徑進(jìn)行了設(shè)計(jì)。

利用COMSOL 軟件對(duì)方波混合器的進(jìn)樣和混合效果進(jìn)行了模擬仿真。在模擬氣壓推動(dòng)液體進(jìn)樣時(shí)，利用了物理場(chǎng)中的兩相流-水平集-層流。如圖2（a）所示，仿真結(jié)果表明，在氣體壓強(qiáng)和受壓面積相當(dāng)?shù)臈l件下，洗脫池與擴(kuò)增試劑池中的液體（紅色）可在空氣（藍(lán)色）的擠壓下同時(shí)完成進(jìn)樣。圖2（b）為對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可見仿真與實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

圖2 方波混合器進(jìn)樣效果圖

在模擬混合效果時(shí)，采用了物理場(chǎng)中的單相流-層流，建立的仿真模型如圖3（a）所示，進(jìn)樣速度設(shè)置為50 mm/s。利用參數(shù)掃描，研究了擴(kuò)散系數(shù)對(duì)于出口濃度的影響（圖3（b）），以及入口濃度對(duì)于混合效率的影響（圖3（c））。水溶液常溫條件下擴(kuò)散系數(shù)為10-10～10-9m2/s 之 間，這 里 將 擴(kuò) 散 系 數(shù) 設(shè) 置 為：1×10-11～1×10-9m2/s，而入口濃度設(shè)置為：1～50 mol/m3?？梢钥闯鰯U(kuò)散系數(shù)和入口濃度均不會(huì)影響液體的方波混合器的混合結(jié)果。同樣，利用藍(lán)紅兩種液體，對(duì)方波混合器的混合效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。如圖3（d）所示，兩種顏色的液體經(jīng)過方波混合器后得到了充分混合，形成了均勻的紫色。

圖3 方波混合器混合效果圖

3.2 滑動(dòng)式擴(kuò)增反應(yīng)池

利用熒光素鈉溶液對(duì)滑動(dòng)式擴(kuò)增反應(yīng)池的物理隔離效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。首先，在相互間隔的8 個(gè)反應(yīng)池中加入相同濃度的熒光素鈉溶液，待其風(fēng)干后用石蠟對(duì)其進(jìn)行包裹。其次，移動(dòng)蓋片使反應(yīng)池與微溝道連通，向反應(yīng)池中注入去離子水。接著，將滑動(dòng)蓋片向上推移，使16 個(gè)反應(yīng)池實(shí)現(xiàn)物理隔離。然后，將芯片放置到加熱板上進(jìn)行加熱，在65 ℃保持40 min。最后，利用紫外線驗(yàn)鈔筆對(duì)芯片進(jìn)行照射。如圖4（a）所示，8 個(gè)加入了熒光素鈉的反應(yīng)池發(fā)出了綠色熒光，而其他8 個(gè)反應(yīng)池則沒有熒光產(chǎn)生，表明本文設(shè)計(jì)的滑動(dòng)式結(jié)構(gòu)可以在沒有任何閥結(jié)構(gòu)的情況下實(shí)現(xiàn)反應(yīng)池間的物理隔離。

圖4 擴(kuò)增反應(yīng)池的隔離效果驗(yàn)證

此外，還利用熒光顯微鏡對(duì)芯片進(jìn)行了拍攝（熒光波長(zhǎng)為350～500 nm），采用ImageJ圖像軟件對(duì)8個(gè)加入熒光素鈉反應(yīng)池的熒光面積和熒光強(qiáng)度進(jìn)行了計(jì)算。如圖4（b）所示，8 個(gè)反應(yīng)池的熒光面積基本一致，表明初始加入的石蠟量不會(huì)影響陽(yáng)性結(jié)果的判定。8 個(gè)反應(yīng)池的均一化熒光強(qiáng)度基本相等，證明注入的去離子水能夠與各擴(kuò)增池中的熒光素鈉完全混合，進(jìn)一步證明了該滑動(dòng)式擴(kuò)增反應(yīng)池可以滿足多靶標(biāo)核酸檢測(cè)的要求。

4 結(jié)束語(yǔ)

本文設(shè)計(jì)了一種基于LAMP 技術(shù)的微流控芯片，只需要一個(gè)一次性注射器和一支紫外線驗(yàn)鈔筆，便能夠?qū)崿F(xiàn)核酸的提取、擴(kuò)增和檢測(cè)功能，未來有望用于病原體的核酸即時(shí)檢測(cè)。將芯片分成了3 個(gè)功能區(qū)：核酸提取區(qū)、混合區(qū)和核酸擴(kuò)增區(qū)，對(duì)各功能區(qū)內(nèi)的儲(chǔ)液池和微溝道等進(jìn)行了設(shè)計(jì)，探討了核酸的提取和擴(kuò)增方案，分析了芯片的工作流程。利用COMSOL 軟件對(duì)芯片上的方波混合器進(jìn)行了模擬仿真，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)測(cè)試，檢驗(yàn)了混合器的液體混合能力。利用熒光素鈉溶液，對(duì)芯片上的滑動(dòng)式擴(kuò)增反應(yīng)池的物理隔離性能進(jìn)行了測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該結(jié)構(gòu)能夠在核酸擴(kuò)增反應(yīng)過程中實(shí)現(xiàn)反應(yīng)池間的物理隔離，滿足了芯片多靶標(biāo)核酸檢測(cè)的要求。