楊樹(shù)抗寒分子機(jī)理研究策略

楊成超

(遼寧省楊樹(shù)研究所，遼寧 營(yíng)口 115213)

溫度是決定植物地域分布的主要限制因子，全世界每年因低溫對(duì)植物造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元。楊樹(shù)是多年生木本植物，較早完成基因組測(cè)序，是開(kāi)展抗寒分子機(jī)理研究的模式樹(shù)木，是耐凍融分子機(jī)制研究的理想材料。楊樹(shù)凍融傷害分為可逆凍融傷害和不可逆凍融傷害，有效凍融傷害的累積效應(yīng)是楊樹(shù)越冬死亡的主要原因[1，2]。楊樹(shù)具有在可逆凍融傷害后自我修復(fù)的能力是其最終能從冬季嚴(yán)寒中存活下來(lái)的關(guān)鍵，楊樹(shù)抗寒分子機(jī)理研究對(duì)楊樹(shù)抗寒育種具有重要意義。

楊樹(shù)響應(yīng)低溫脅迫分為幾個(gè)階段：信號(hào)感知(signal perception)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)、次級(jí)信號(hào)(Secondary signals)和靶基因響應(yīng)(target-responses)等。近20年來(lái)，樹(shù)樹(shù)抗寒機(jī)理研究進(jìn)展緩慢，主流觀點(diǎn)是20世紀(jì)的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能傷害及活性氧導(dǎo)致的氧化性損傷。一般認(rèn)為，細(xì)胞膜最先感知到環(huán)境溫度變化，將信號(hào)傳遞到胞內(nèi)。此外，組蛋白激酶、鈣離子通道及磷脂酶等都可能扮演著次級(jí)溫度感受器的角色。研究人員長(zhǎng)期專注于抗凍鍛煉階段冷脅迫和零下輕度凍脅迫的冷信號(hào)感知及冷信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制研究，例如Chen J等[3]對(duì)4 ℃和-4 ℃處理的胡楊(Populuseuphratica)葉片的轉(zhuǎn)錄組研究和Yang X Y 等[4]對(duì)4 ℃處理的毛白楊(P.tomentosa)葉片的轉(zhuǎn)錄組研究，而對(duì)較低溫度(如-40 ℃)凍脅迫階段的研究未見(jiàn)報(bào)道。

1 楊樹(shù)細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)冰點(diǎn)精確測(cè)定

楊樹(shù)凍害指冰點(diǎn)以下低溫造成的傷害。冰點(diǎn)分為胞外冰點(diǎn)和胞內(nèi)冰點(diǎn)。研究表明，胞外冰點(diǎn)可能造成細(xì)胞損傷，但一般不致死，而胞內(nèi)結(jié)冰會(huì)造成細(xì)胞死亡。另外，有效凍融傷害的累積超過(guò)抗凍融度，也會(huì)造成組織死亡[1]。因此，要研究楊樹(shù)可逆凍融傷害修復(fù)，首先要精確測(cè)定胞外冰點(diǎn)和胞內(nèi)冰點(diǎn)溫度，然后是有效凍融傷害的閾值[2]。

當(dāng)前的楊樹(shù)抗寒評(píng)價(jià)技術(shù)主要是測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖等生理指標(biāo)。根據(jù)相對(duì)電導(dǎo)率確定的半致死溫度不是細(xì)胞冰點(diǎn)，現(xiàn)在缺乏可精確測(cè)定細(xì)胞冰點(diǎn)的新技術(shù)來(lái)確定楊樹(shù)在抗寒鍛煉期、深度休眠期和脫鍛煉期胞外和胞內(nèi)冰點(diǎn)。該項(xiàng)技術(shù)研究將為楊樹(shù)抗寒性精確評(píng)價(jià)和凍融傷害修復(fù)分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

2 凍融傷害修復(fù)與膜再密封

洋蔥表皮蛋白質(zhì)組學(xué)[5]和菠菜葉靶標(biāo)蛋白研究[6]是已開(kāi)展的2個(gè)與凍融修復(fù)相關(guān)的典型研究。組織的凍融傷害修復(fù)程度通過(guò)融化后離子滲出率的減少、光合系統(tǒng)Ⅱ的光合效率恢復(fù)、抗氧化酶激活或者活性氧的損耗來(lái)評(píng)估。組織化學(xué)染色表明，在菠菜葉凍融傷害修復(fù)期間受傷害組織活性氧的累積或它們被減少的強(qiáng)度同損耗修復(fù)一致。

蛋白和基因的豐度直接或間接與膜聯(lián)蛋白離子平衡相關(guān)，受傷害組織的橫跨膜水通道蛋白減少，但在融化后修復(fù)。修復(fù)期間，K+流或離子平衡可能被14-3-3蛋白和膜聯(lián)蛋白控制，細(xì)胞膜中驅(qū)動(dòng)橫跨膜K+運(yùn)輸?shù)腍+-ATPase是14-3-3對(duì)細(xì)胞膜整合和激活的主要目標(biāo)[7]。也就是說(shuō)，14-3-3蛋白能激活向內(nèi)的K+通道[8]。通過(guò)離子平衡和氧化脅迫的改善，鈣磷脂結(jié)合蛋白能夠促進(jìn)凍融傷害修復(fù)，值得研究。

膜再密封策略在膜凍融傷害修復(fù)過(guò)程中是可行的。在植物細(xì)胞背景下，凍害誘導(dǎo)的囊泡已被用親脂的熒光染料和共聚焦低溫顯微鏡觀察到。Ca2+通過(guò)細(xì)胞膜上的穿孔點(diǎn)從細(xì)胞外間隙流入，最終導(dǎo)致冰凍誘導(dǎo)的囊泡經(jīng)由Ca2+綁定突觸結(jié)合蛋白進(jìn)行融合和細(xì)胞膜傷害點(diǎn)的再密封。這表明細(xì)胞外Ca2+提高原生質(zhì)體或未損傷葉細(xì)胞的耐凍性和抗電穿孔能力是膜保護(hù)而不是膜穿孔的象征[9]。當(dāng)前，楊樹(shù)還沒(méi)有開(kāi)展凍融傷害后的質(zhì)膜修復(fù)分子機(jī)理研究。

3 CBF/DREB調(diào)節(jié)

在林木抗寒性調(diào)控及響應(yīng)機(jī)制方面，發(fā)現(xiàn)了CBF/DREB低溫信號(hào)調(diào)節(jié)途徑及相關(guān)轉(zhuǎn)錄子。其中，在楊樹(shù)[10]、藍(lán)桉(Eucalyptusglobulus)[11]、葡萄(Vitisvinifera)[12]等分離鑒定出CBF直系同源基因。CBF/DREB系統(tǒng)誘導(dǎo)抗寒基因表達(dá)所編碼的防凍蛋白，對(duì)保護(hù)植物細(xì)胞免于低溫脅迫傷害很重要。例如，楊樹(shù)CBF調(diào)節(jié)因子CBF1、CBF2和CBF3表達(dá)誘導(dǎo)物ICEl在冬季休眠芽中上調(diào)了391倍，抗寒性增強(qiáng)。

4 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

轉(zhuǎn)錄組可定量分析生物受外界環(huán)境影響的各基因表達(dá)的變化，主要檢測(cè)的是生物體RNA水平的基因表達(dá)量。Chen 等[3]將2年生胡楊分別置于4 ℃和-4 ℃處理6 h后，使用Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)其葉片做轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序。Wang等[13]鑒定了茶樹(shù)(Camelliasinensis)在自然越冬條件下抗凍鍛煉后差異表達(dá)基因，包括低溫應(yīng)答基因、質(zhì)膜穩(wěn)定基因、滲透應(yīng)答基因等。上述研究表明，抗凍性強(qiáng)的胡楊關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄成分主要與ABA及鈣信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，而在抗凍性較弱的茶樹(shù)中碳水化合物代謝途徑和鈣信號(hào)通路相關(guān)基因起主要作用。

小RNAs通過(guò)降解mRNA、抑制翻譯和修飾染色質(zhì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在植物脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[14]。Lu等[15]通過(guò)構(gòu)建楊樹(shù)脅迫處理前后的小RNA文庫(kù)，成功鑒定19個(gè)冷響應(yīng)miRNAs，其中miR397等低溫上調(diào)，miR156g-j等低溫下調(diào)。Chen等[16]也在楊樹(shù)中鑒定了脅迫響應(yīng)相關(guān)的miRNAs。但目前有關(guān)小RNAs調(diào)控基因表達(dá)及產(chǎn)生抗逆性的具體分子調(diào)控機(jī)制還不明確，須進(jìn)一步研究。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸、不具備蛋白編碼功能的RNA。應(yīng)用深度測(cè)序和生物信息學(xué)分析，在擬南芥、水稻、番茄等中鑒定了數(shù)千種lncRNAs[17]。在lncRNA響應(yīng)低溫脅迫功能研究方面，模式植物擬南芥取得進(jìn)展，在其基因組的低溫敏感區(qū)域鑒定了一個(gè)叫SVALKA的lncRNA，SVALKA的突變會(huì)影響CBF1基因的表達(dá)和植物的冷害抗性[18]。但大多數(shù)lncRNA的生物學(xué)功能還不清楚。在楊樹(shù)方面，主要研究了lncRNA在毛白楊木材形成[19]中的作用、lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)楊樹(shù)根和莖頂端分生組織的發(fā)育[20]、IAA響應(yīng)的毛白楊lncRNA基因甲基化和生長(zhǎng)發(fā)育[21]、小葉楊非編碼RNA甲基化調(diào)節(jié)非生物脅迫基因表達(dá)[22]。lncRNA調(diào)控楊樹(shù)凍融傷害方面未見(jiàn)報(bào)道。

5 CRISPR/Cas9技術(shù)

CRISPR/Cas9技術(shù)是基于細(xì)菌體內(nèi)的獲得性免疫機(jī)制改造而成，可通過(guò)一條單鏈的單向?qū)NA(sgRNA)來(lái)識(shí)別特定DNA序列，并引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶剪切DNA雙鏈[23]。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、酵母和動(dòng)物的基因組編輯中[24]，而且，李然等利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)番茄lncRNA1459進(jìn)行了編輯，獲得了lncRNA1459的功能缺失突變體[25]。這說(shuō)明，CRISPR/Cas9技術(shù)可以用于lncRNA基因功能研究。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)具備同時(shí)快速高效地敲除多個(gè)內(nèi)源基因的優(yōu)勢(shì)。利用改良的CRISPR/Cas9多靶點(diǎn)載體系統(tǒng)[26]，在楊樹(shù)體內(nèi)同時(shí)表達(dá)Cas9蛋白和多個(gè)針對(duì)八氫番茄紅素脫氫酶基因的sgRNA，在楊樹(shù)體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)源基因的高效定點(diǎn)敲除，獲得穩(wěn)定的基因定點(diǎn)敲除的突變體株系[27]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在楊樹(shù)功能基因研究和遺傳改良中具有廣泛的應(yīng)用前景。

6 DNA修復(fù)

DNA修復(fù)是細(xì)胞對(duì)DNA受損傷后的一種反應(yīng)，這種反應(yīng)可能使DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)原樣，重新執(zhí)行它原來(lái)的功能，使細(xì)胞能繼續(xù)生存。如果細(xì)胞不具備這種修復(fù)功能，就無(wú)法應(yīng)對(duì)經(jīng)常發(fā)生的DNA損傷事件，就不能生存，所以研究DNA修復(fù)是探索生命的一個(gè)重要課題。David R. Liu發(fā)明了堿基編輯器，首先借助CRISPRi篩選發(fā)現(xiàn)多種促進(jìn)C-G編輯的因子，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建出的新CGBEs的編輯效果有明顯提升[28]，使DNA人工修復(fù)成為可能。楊樹(shù)在抗寒性分子機(jī)理方面還沒(méi)有開(kāi)展DNA修復(fù)研究。

7 問(wèn)題與展望

在楊樹(shù)基因組測(cè)序完成的背景下，楊樹(shù)抗寒分子機(jī)理研究思路從單一基因或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)向同時(shí)對(duì)多個(gè)基因或蛋白質(zhì)功能的系統(tǒng)發(fā)掘。凍融傷害作為數(shù)量性狀，受到多基因、多水平的協(xié)同調(diào)控。研究楊樹(shù)凍融傷害修復(fù)的分子機(jī)理是抗寒分子機(jī)理研究的發(fā)展趨勢(shì)之一。楊樹(shù)凍融傷害修復(fù)過(guò)程中，哪些基因在起作用？其功能是什么? 各個(gè)基因之間如何互作？在可逆凍融傷害DNA修復(fù)過(guò)程中哪些堿基發(fā)生了改變和修正？需要系統(tǒng)研究。